強化多微麩曲制備工藝優化及其在陳醋酒精發酵階段的應用

張旭姣，閆裕峰，周景麗，梁 楷，郎繁繁，夏瑤瑤，丁 偉，武耀文，田 莉

（1.山西紫林醋業股份有限公司，山西太原 030400；2.山西省食品工業研究所，山西太原 030024）

大曲通常是指以大麥、豌豆為原料，通過自然發酵制作的曲，富含多種霉菌、酵母和細菌[1-3]，為山西老陳醋酸、醇、酯等風味物質的生成奠定了基礎[4]。麩曲是指以麩皮為主要原料，接種霉菌進行純種培養的曲，目前主要用于白酒及食醋的釀造[3]，其主要起糖化作用。由于微生物種群的單一，麩曲在食醋等的釀造過程中并不單獨使用[5-6]，而是與大曲作為發酵劑同時使用[7-8]。這樣的用曲方式，既能使陳醋具有山西老陳醋的特色風味，又能縮短發酵周期，但其大曲用量仍然占到山西老陳醋大曲用量的60%以上。

傳統大曲制作步驟繁瑣，勞動強度大，生產周期長達4個月以上[9]，受氣候影響[10]，生產效率不高，且生產、庫存占地面積大。而麩曲采用人工純種培養，便于機械化生產，生產成本低、周期短。在陳醋生產過程中，大曲與麩曲的結合使用，雖然有益于提高陳醋產品的品質，但由于陳醋市場需求逐漸增大，而大曲生產量受限，加大了企業大曲供應壓力。現階段，為減少傳統大曲的用量，大多數研究傾向于篩選其中的優良菌種，先分別制備純種大曲或麩曲等，而后與傳統大曲混合使用[11-12]。

以大曲為種曲制備強化麩曲，充分結合大曲微生物種群豐富及麩曲培養周期短的特點，將大曲中的優勢微生物種群通過較短時間的培養加以富集，使強化麩曲具備大曲所具有的糖化力及發酵力。本試驗以大曲為種曲制備強化多微麩曲，以糖化力及發酵力為響應值，通過單因素及響應面試驗對強化多微麩曲的制備工藝進行優化。并在陳醋酒精發酵階段進行了投料試驗，旨在探究使用強化多微麩曲替代部分麩曲及大曲用量在陳醋生產中應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：山西紫林醋業股份有限公司自制；麩皮、稻殼、豆粕粉、粗麥粉：市售；氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖、碘、碘化鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、硫酸、可溶性淀粉、乙酸、乙酸鈉、己酸、乙醇等（均為分析純或生化試劑）：天津歐博凱化工有限公司；次甲基藍（分析純）：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

202型電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；AR124CN電子天平、ZL-002 pH計：奧豪斯儀器有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業儀器有限公司；Alkomat酒精檢測儀：福林斯（徐州）生化技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 強化多微麩曲制備工藝流程

以麩皮為主要原料，加水，拌勻，100～120 ℃條件下蒸料25～35 min，取5%～8%的蒸煮麩皮在10～30 min內冷卻至32～36 ℃，與大曲攪拌均勻，堆積2～3 h，之后接種到已冷卻的剩余蒸煮麩皮中進行培養，進而得到成曲。

春末夏初時，氣溫及濕度都比較高，有利于控制曲室的培養條件[13]，是最好的壓曲季節[10]。因此，試驗所用種曲均為春末夏初時所制大曲，其水分含量≤13%，酸度為0.5%～1.3%，糖化力≥900.0 mg/（g·h），液化力≥1.0 g/（g·h），發酵力≥2.0 g/（0.5 g·72 h），酯化力≥600.0 mg/（50 g·7 d）。

1.3.2 強化多微麩曲制備工藝優化單因素試驗

加水量的確定：以麩皮用量為參照，選取加水量分別為40%、45%、50%、55%、60%，種曲（即大曲）添加量為1%，培養溫度為35 ℃，培養時間為40 h，進行強化多微麩曲的制備，以糖化力及發酵力作為評價指標，確定最佳的加水量，每個處理平行3次。

種曲添加量的確定：以麩皮用量為參照，選取加水量為45%，大曲添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，培養溫度為35 ℃，培養時間為40 h，進行強化多微麩曲的制備，以糖化力及發酵力作為評價指標，確定最佳的種曲添加量，每個處理平行3次。

培養溫度的確定：選取加水量為45%，種曲添加量為1%，培養溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，培養時間為40 h，進行強化多微麩曲的制備，以糖化力及發酵力作為評價指標，確定最佳的培養溫度，每個處理平行3次。

培養時間的確定：選取加水量為45%，種曲添加量為1%，培養溫度為35 ℃，分別培養30 h、35 h、40 h、45 h、50 h，以糖化力及發酵力作為評價指標，確定最佳的培養時間，每個處理平行3次。

1.3.3 強化多微麩曲制備工藝優化響應面試驗

在單因素試驗基礎上，采用Design-Expert8.0.6軟件進行Box-Behnken中心組合試驗設計[14]，選取加水量（A）、種曲添加量（B）、培養溫度（C）及培養時間（D）4個因素作為試驗因素，以強化多微麩曲的糖化力（Y1）及發酵力（Y2）為響應值，設計響應面分析試驗，其因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 強化多微麩曲陳醋酒精發酵的應用

高粱經潤料、蒸料后冷卻至60～65 ℃，加入麩曲糖化2～3 h，繼續降溫至25～30 ℃，加入大曲，進行酒精發酵，發酵前3天敞口進行，之后封口進行，發酵周期15～16 d。

將制備的強化多微麩曲部分替代大曲及麩曲應用于陳醋酒精發酵階段，具體添加量見表2。酒精發酵階段結束后，測定酒醪的酒精度、酸度、還原糖及淀粉含量。

表2 陳醋酒精發酵階段原料配方Table 2 Raw material formula of aged vinegar during alcohol fermentation

1.3.5 檢測方法

強化麩曲糖化力及發酵力測定方法采用輕工行業標準QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[15]測定；酒醪酸度的測定采用酸堿中和滴定法[16]；還原糖含量的測定采用菲林試劑法[17]；淀粉含量的測定采用酸水解法[18]；酒精度的測定[16]：取100 g酒醪加入100 mL蒸餾水，蒸餾出100 mL溶液，用酒精檢測儀測定酒精度。

2 結果與分析

2.1 強化多微麩曲制備工藝優化單因素試驗

2.1.1 加水量對強化多微麩曲質量的影響

由圖1可知，加水量為55%時，強化麩曲的糖化力最高，為623 mg/（g·h）；加水量為45%時，強化麩曲的發酵力最高，為0.54 g/（0.5 g·72 h），因此，加水量的確定需綜合衡量強化麩曲糖化力及發酵力決定。

圖1 加水量對強化多微麩曲的影響Fig.1 Effect of water addition on fortified Fuqu with multi-microorganisms

2.1.2 種曲添加量對強化麩曲質量的影響

圖2 種曲添加量對強化多微麩曲的影響Fig.2 Effect of seed Daqu addition on fortified Fuqu with multi-microorganisms

由圖2可知，當種曲添加量為2%時，強化麩曲的糖化力及發酵力最高，分別為579 mg/（g·h）、0.75 g/（0.5 g·72 h）。因此，確定最佳種曲添加量為2%。

2.1.3 培養溫度對強化多微麩曲質量的影響

圖3 培養溫度對強化多微麩曲的影響Fig.3 Effect of culture temperature on fortified Fuqu with multi-microorganisms

由圖3可知，當培養溫度為40 ℃時，強化麩曲的糖化力最高，為594 mg/（g·h）；當培養溫度為35 ℃時，發酵力最高，為0.80 g/（0.5 g·72 h）。由于35 ℃與40 ℃培養條件下，強化麩曲糖化力差異較小，因此，培養溫度選擇35 ℃為宜。

2.1.4 培養時間對強化多微麩曲質量的影響

圖4 培養時間對強化多微麩曲的影響Fig.4 Effect of culture time on fortified Fuqu with multi-microorganisms

由圖4可知，培養時間為40 h時，強化麩曲的糖化力及發酵力均達到最大，分別為615 mg/（g·h）、0.89 g/（0.5 g·72 h）。因此，確定最佳培養時間為40 h。

2.2 強化多微麩曲制備工藝優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert.V8.6.0.1軟件對水分含量（A）、種曲添加量（B）、培養溫度（C）及培養時間（D）進行響應面優化，試驗結果及分析見表3，方差分析結果見表4。

運用Design-Expert.V8.6.0.1軟件對中心組合試驗數據進行多元回歸擬合分析，得到糖化力（Y1）及發酵力（Y2）的二次多項回歸方程：

由表4可知，以糖化力為響應值構建的模型的P值＜0.000 1，極顯著。失擬項的P值=0.164 1＞0.05，不顯著。決定系數R2=95.59%，校正決定系數R2Adj=91.18%，說明模型與實際試驗擬合度良好，可以用來對試驗結果進行初步的分析及預測。根據回歸方程的方差分析可知，各因素對糖化力影響的主次順序為培養時間＞培養溫度＞加水量＞種曲添加量。一次項A、C、D及二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AD、BC、CD對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。各影響因素交互作用的響應曲面及等高線見圖5。由圖5可知，響應面均呈開口向下的圖面，說明存在最大值。結合方差分析結果可知，對于強化多微麩曲的糖化力，其水分含量與培養時間、種曲添加量與培養溫度、培養溫度與培養時間之間存在顯著的交互作用。

表3 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Benhnken experiments

續表

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis for regression equation

由表4可知，以發酵力為響應值構建的模型的P值＜0.000 1，極顯著。失擬項P值=0.453 8＞0.05，不顯著。決定系數R2=95.02%，校正決定系數R2Adj=90.04%，說明模型與實際試驗擬合度良好，可以用來對試驗結果進行初步的分析及預測。根據回歸方程的方差分析可知，各因素對發酵力影響的主次順序為培養溫度＞培養時間＞加水量＞種曲用量。一次項C、D、交互項AB、AD、CD及二次項A2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項A、交互項BD對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。各影響因素交互作用的響應曲面及等高線見圖6。由圖6可知，響應面均呈開口向下的圖面，說明存在最大值。結合方差分析結果可知，對于強化多微麩曲發酵力，其水分含量與種曲用量、水分含量與培養時間、種曲用量與培養時間、培養溫度與培養時間之間存在顯著的交互作用（P＜0.05），且除種曲用量與培養時間之間的交互作用為顯著外，其余均為極顯著（P＜0.01）。

圖5 水分含量、種曲添加量、培養溫度和培養時間交互作用對糖化力影響的響應曲面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between water content,seed Daqu addition,culture temperature and time on saccharifying power

圖6 水分含量、種曲添加量、培養溫度和培養時間交互作用對發酵力影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between water content,seed Daqu addition,culture temperature and time on fermenting power

運用Design-Expert.V8.6.0.1軟件對糖化力（Y1）及發酵力（Y2）的二次多項回歸方程進行最優化求解，得到的最佳工藝參數條件為加水量50.97%、種曲添加量1.93%、培養溫度34.36 ℃、培養時間41.96 h。該條件下所制備的強化多微麩曲的糖化力理論值為618.80 mg/（g·h），發酵力理論值為1.12 g/（0.5 g·72 h）。為便于實際操作，將工藝參數修正為加水量51.0%、種曲添加量2.0%、培養溫度34.5 ℃、培養時間42.0 h。采用修正后的工藝參數條件進行3次重復試驗，測得強化多微麩曲糖化力平均實際值為615.9 mg/（g·h），發酵力平均實際值為1.14 g/（0.5 g·72 h），與預測值基本一致，因此，采用響應面法預測強化多微麩曲的制備工藝參數是可行的。

2.3 強化多微麩曲在陳醋酒精發酵中的應用

表5 強化多微麩曲應用于陳醋酒精發酵試驗結果Table 5 Results of the fortified Fuqu with multi-microorganisms application in alcohol fermentation of aged vinegar

由表5可知，當使用強化多微麩曲替代25%麩曲，而大曲添加量不變時，酒醪的酒精度和淀粉含量顯著高于對照組（P＜0.05），分別升高2.75%和42.55%，酸度和還原糖含量顯著低于對照組（P＜0.05），分別降低3.75%和26.31%，說明強化多微麩曲替代25%麩曲時，除淀粉含量變化趨勢劣于對照組外，酒精度、酸度及還原糖含量的變化趨勢優于對照組；當使用強化多微麩曲替代25%大曲，而麩曲用量不變時，與對照組相比，酒醪酒精度和還原糖含量差異不顯著（P＞0.05），酸度顯著高于對照組（P＜0.05），升高21.43%，淀粉含量顯著低于對照組（P＜0.05），降低13.48%，說明強化多微麩曲替代25%大曲時，酸度變化趨勢劣于對照組，而淀粉含量的變化趨勢優于對照組；當使用強化多微麩曲替代25%大曲和25%麩曲時，酒醪的酒精度和酸度顯著低于對照組（P＜0.05），分別降低7.23%和10.12%，還原糖含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），淀粉含量顯著高于對照組（P＜0.05），降低130.49%，該組試驗結果的總體變化趨勢劣于對照組，尤其是在淀粉的利用上更為突出，其原因可能是由于在該組用曲情況下，淀粉轉化為葡萄糖的量減少，進一步導致乙醇生成量減少。對比使用強化多微麩曲單獨替代25%的麩曲或25%大曲時的結果，同時替代二者時應注意增加麩曲的用量，以加強對淀粉的分解利用。以上結果表明，在陳醋釀造酒精發酵階段，以強化多微麩曲替代部分大曲及麩曲是可行的，但最佳的替代量仍需通過進一步試驗確定[19-20]。

3 結論

本試驗通過單因素及響應面試驗的優化，得到了以大曲為種曲制備強化多微麩曲的工藝條件：加水量51.0%、種曲添加量2.0%、培養溫度34.5 ℃、培養時間42.0 h。在此優化條件下，強化多微麩曲的糖化力為615.9 mg/（g·h），發酵力為1.14 g/（0.5 g·72 h）。該強化麩曲富集了大曲中的優勢菌群，制備工藝相對簡單，過程控制便于管理，利于實現機械化生產。將其應用于陳醋釀造的酒精發酵階段，結果表明，該強化麩曲可以替代部分大曲及麩曲，但最佳的替代量及對應的酒精發酵的周期需進一步試驗確定。