響應(yīng)面法優(yōu)化圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料工藝及品質(zhì)分析

李昌寶，辛 明，孫 宇，唐雅園，李杰民，盛金鳳，李 麗，李志春，孫 健*

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西 南寧 530007）

圣女果（Lycopersicon esculentumMill.）又稱迷你番茄、小番茄等，屬茄科番茄屬植物，主要作為水果食用，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為優(yōu)先推廣的“四大水果”之一[1-3]。圣女果富含維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸等營養(yǎng)成分，特別是成熟果實(shí)中所含的番茄紅素，是一種天然的超級抗氧化劑[4-5]。圣女果具有美容養(yǎng)顏、促進(jìn)體內(nèi)血液循環(huán)、增強(qiáng)抵抗力等功效[6-7]。百香果（Passiflora edulisSims）為西番蓮科西番蓮屬多年生藤本植物[8-9]，是熱帶亞熱帶地區(qū)特有的水果。百香果果實(shí)成熟后香味豐富，其果漿可散發(fā)出10多種水果濃郁芬芳的香氣，享有“飲料之王”的美譽(yù)[10]。百香果果實(shí)多汁，風(fēng)味獨(dú)特，具有很高的營養(yǎng)價值，富含人體必需的17種氨基酸、多種維生素及鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鐵等對人體有益的礦物元素[11-12]。百香果還是一種傳統(tǒng)的藥用果實(shí)，具有豐富的醫(yī)藥保健功能，如活血強(qiáng)身、滋陰補(bǔ)腎、生津止渴、抗焦慮、抗炎等[12-14]。

圣女果和百香果都屬于呼吸躍變型水果，在采后不易貯存，特別在炎熱的夏季更易腐爛、發(fā)酵產(chǎn)生異味等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，降低果實(shí)的商品價值。因此，深加工是解決圣女果和百香果采后不耐貯存的重要手段之一。乳酸菌發(fā)酵可以改善果蔬汁的風(fēng)味，提高果蔬汁的營養(yǎng)價值，防止果蔬汁變壞，延長保存期，增加保健作用[15]。植物性乳酸菌發(fā)酵飲料正成為新的開發(fā)熱點(diǎn)，如番茄蘋果復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料[16]、番茄胡蘿卜發(fā)酵乳酸飲料[17]、百香果汁發(fā)酵乳飲料[18]等。本研究以圣女果、百香果為原料，研究利用發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵圣女果百香果飲料的加工工藝，考察乳酸菌菌種添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、果汁配比等發(fā)酵條件對圣女果百香果發(fā)酵飲料的影響，通過響應(yīng)面試驗對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，同時分析了其品質(zhì)指標(biāo)，以期為圣女果和百香果深加工產(chǎn)業(yè)開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圣女果：由廣西壯鄉(xiāng)河谷農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；百香果：由浦北南國水果種植農(nóng)民專業(yè)合作社提供；發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所；白砂糖：市售；MRS培養(yǎng)基（食品級）：德州潤昕實(shí)驗儀器有限公司；2,6-二氯靛酚、福林酚、蒽酮（分析純）：廈門海標(biāo)科技有限公司；草酸、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈉（均為分析純）：滄州臨港濱海化工有限公司；葡萄糖（分析純）：佛山市柏士食品有限公司；石油醚：常州市中超化工有限公司；蒽酮：上海通蔚生物有限公司；沒食子酸、番茄紅素（均為標(biāo)準(zhǔn)品）：中國計量科學(xué)院；硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PGL精密天平：深圳市怡華新電子有限公司；UV-6100紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；PHS-2C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；捷呈LRH生化培養(yǎng)箱：上海捷呈試驗儀器有限公司；LD8X-75KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；A3000榨汁機(jī)：南京漢越電子科技有限公司；GYB60-6S高壓均質(zhì)機(jī)：上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；IGMA3K15高速冷凍離心機(jī)：曦瑪離心機(jī)（揚(yáng)州）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）圣女果汁制備：選擇成熟度高、顏色艷麗、無腐爛、無病蟲的新鮮圣女果，用清水洗干凈后瀝干水分，用榨汁機(jī)打漿，過100目濾布，取濾液備用。

（2）百香果汁制備：選擇9成熟、無腐爛、無病蟲的新鮮百香果，去皮，去籽，過100目濾布，取濾液備用。

（3）調(diào)配、均質(zhì)：按比例加入圣女果汁和百香果汁，添加總體積8%的白砂糖，采用高壓均質(zhì)機(jī)在15 MPa條件下進(jìn)行均質(zhì)。

（4）滅菌：將調(diào)配好的復(fù)合果汁在85℃條件下殺菌15min，冷卻至室溫，備用。

（5）菌種活化：將發(fā)酵乳桿菌的保藏菌種培養(yǎng)物解凍，取100 μL于MRS平板上進(jìn)行活化復(fù)壯后，接種到50 mL的菌液中，并放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

（6）接種發(fā)酵：將殺菌后的復(fù)合果汁在無菌操作條件下接入經(jīng)過活化的發(fā)酵乳桿菌菌液，在一定溫度下恒溫按試驗設(shè)計時間發(fā)酵，完成后在4 ℃條件下后熟12 h。

1.3.3 工藝優(yōu)化單因素試驗

通過預(yù)實(shí)驗，確定以菌種添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、果汁配比（圣女果∶百香果）為主要影響因素，以感官評分為測試指標(biāo)，確定發(fā)酵因素水平。

菌種添加量的確定：固定發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間24 h、果汁配比5∶1，考察不同菌種添加量1%、2%、3%、4%、5%（體積分?jǐn)?shù)）對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料的影響。

發(fā)酵溫度的確定：固定菌種添加量3%、發(fā)酵時間24 h、果汁配比5∶1，考察不同發(fā)酵溫度27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料的影響。

發(fā)酵時間的確定：固定菌種添加量3%、發(fā)酵溫度為37 ℃、果汁配比5∶1，考察不同發(fā)酵時間18 h、24 h、30 h、36 h、42 h對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料的影響。

果汁配比的確定：固定菌種添加量3%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間24 h，考察果汁配比（圣女果∶百香果）1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhken試驗設(shè)計，設(shè)置菌種添加量（B）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）和果汁配比（D）4個因素為自變量，以單因素結(jié)果為中心點(diǎn)，設(shè)3個水平，以發(fā)酵產(chǎn)品感官評分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Benhken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.5 理化指標(biāo)測定

pH值：采用pH計測定；可溶性固形物：采用手持折光儀測定；總酸（以檸檬酸計）：按照GB/T12456—2008《食品中總酸的測定》中的滴定法測定[19]；還原糖：按照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》測定[20]中的直接滴定法；總酚：采用福林酚法測定[21]，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示；總黃酮：參考程詩韔[22]方法測定；番茄紅素：參考李麗杰[23]方法測定；維生素C（vitamin C，VC）：采用2,6-二氯靛酚滴定法[24]；乳酸菌菌落總數(shù)：按照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》測定[25]。

1.3.6 感官評分

選擇10人組成感官評價小組，對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料的色澤、氣味、口感、組織形態(tài)進(jìn)行評價，滿分100分，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of compound fermented beverage of cherry tomato and passion fruit

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行分析處理，采用Origin 8.0軟件繪圖處理。每組試驗3次平行，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 菌種添加量對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

圖1 菌種添加量對發(fā)酵飲料感官評分及總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculum on sensory score and total acid content of the fermented beverage

由圖1可知，隨著菌種添加量的增加，圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料的感官評分先逐漸增加，當(dāng)菌種添加量為3.0%時，感官評分達(dá)到最高，為81分；之后隨著添加量增加，感官評分有所下降，可能是因為菌種添加量過多使發(fā)酵過度，酸度過高，影響口感。總酸含量隨著菌種添加量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在添加量為4%的時候，總酸含量最高。這與藺志穎[26]研究椰漿蛋白發(fā)酵飲料的結(jié)果一致。這是由于菌種接種量較低時，乳酸菌繁殖基數(shù)少，活菌數(shù)增加相對較慢；接種量過大，會導(dǎo)致底物消耗過快，產(chǎn)酸過快以及乳酸菌代謝產(chǎn)物的增加都會抑制乳酸菌的活性[27]，只有適宜的接種量才能使乳酸菌的繁殖和產(chǎn)酸能力達(dá)到最佳。因此，綜合考慮感官評分及總酸含量，本試驗確定接種量為2%～4%。

2.1.2 發(fā)酵溫度對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

圖2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵飲料感官評分及總酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory score and total acid content of the fermented beverage

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度升高，感官評分和總酸含量均呈先升高后降低的趨勢，在37 ℃時，感官評分和總酸含量均達(dá)到最大值，分別為81分、5.27 g/100 g。這是由于乳酸菌的活性和溫度密切相關(guān)。發(fā)酵溫度過低，乳酸菌繁殖緩慢，產(chǎn)酸量低；發(fā)酵溫度過高，乳酸菌繁殖迅速，代謝旺盛，甚至使乳酸菌死亡而影響產(chǎn)酸量[28]。這與張婉瀅[29]研究胡蘿卜乳酸飲料的結(jié)果一致。因此，綜合考慮感官評分及總酸含量，本試驗確定發(fā)酵溫度為32～42 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時間對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

圖3 發(fā)酵時間對發(fā)酵飲料感官評分及總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory score and total acid content of the fermented beverage

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸量及發(fā)酵的完全程度會受發(fā)酵時間直接影響。由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，感官評分和總酸含量先快速增加后緩慢變化。在發(fā)酵時間18～30 h內(nèi)，菌種不斷利用發(fā)酵基質(zhì)中的糖類產(chǎn)酸，使乳酸累積，持續(xù)產(chǎn)酸，使得產(chǎn)品酸度呈上升趨勢。乳酸菌發(fā)酵不僅可以提高產(chǎn)品的酸度，還對產(chǎn)品的風(fēng)味等產(chǎn)生積極影響，因此感官評分也越來越高。在發(fā)酵30 h時，感官評分到達(dá)最大值85分。在發(fā)酵30 h之后，感官評分出現(xiàn)緩慢下降，總酸含量基本趨于穩(wěn)定，可能是由于前期乳酸菌利用底物繁殖，產(chǎn)酸率較快，而隨著發(fā)酵時間的延長，一部分乳酸菌衰老死亡，另外隨著產(chǎn)酸量的升高，乳酸菌也會受到不同程度的抑制而使產(chǎn)酸量下降，總酸含量基本不再改變[30]。這與張春嶺[30]研究紅棗乳酸發(fā)酵飲料的結(jié)果一致。因此，綜合考慮感官評分及總酸含量，本試驗確定發(fā)酵時間為24～36 h。

2.1.4 果汁配比對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

圖4 圣女果與百香果汁配比對發(fā)酵飲料感官評分及總酸含量的影響Fig.4 Effect of cherry tomato and passion fruit juice ratio on sensory score and total acid content of the fermented beverage

由圖4可知，果汁配比對發(fā)酵飲料的感官評分和總酸含量影響較大。隨著復(fù)合果汁配比的增加，圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料的感官評分呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)果汁配比為5∶1時，果汁酸甜適中，感官評分最高。逐漸增加圣女果汁的比例，果汁的口感、顏色越好，但圣女果汁比例過高則百香果的香氣不足，風(fēng)味欠佳，感官評價降低。隨著復(fù)合果汁配比的增加，總酸含量逐漸下降，這是由于百香果的總酸含量較高，當(dāng)百香果的比例下降時，對應(yīng)的總酸含量也逐漸下降。因此，綜合考慮感官評分及總酸含量，本試驗確定果汁配比為3∶1～7∶1（V∶V）。

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料工藝

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以菌種添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）和果汁配比（D）為自變量，感官評分（Y）為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗，Box-Benhken試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

采用Design Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到感官評分（Y）對菌種添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）和果汁配比（D）的二次多項回歸方程：

表3 復(fù)合發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology for compound fermented beverage technology optimization

表4 響應(yīng)面試驗方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology

續(xù)表

從表4可以看出，所獲得的回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型有效，能夠較好的預(yù)測試驗值。一次項A、C、D對感官評價影響極顯著（P＜0.01），B對其影響不顯著；交互項AB、AD、BC、CD對感官評價影響極顯著，AC、BD對其影響不顯著；二次項A2、B2、C2、D2影響極顯著（P＜0.01）。由P值結(jié)果得出對感官評分影響大小依次為：果汁配比＞發(fā)酵時間＞菌種添加量＞發(fā)酵溫度。

2.2.2 各因素響應(yīng)面交互作用分析

采用Design Expert8.0.6軟件對影響圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料的4個因素進(jìn)行交互分析，結(jié)果見圖5。

圖5 各因素交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each two factors on the sensory score

利用模型可擬合出兩兩因素間相互作用的響應(yīng)面圖，可以進(jìn)一步研究各因素間的交互作用強(qiáng)弱。由圖5A、D、E、F可知，隨著各因素的增加，感官評分均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，且響應(yīng)面形狀陡峭，說明兩者交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致；由圖5B可知，感官得分隨著發(fā)酵時間的增加呈先上升后下降的趨勢，隨著菌種量的增加上升緩慢，發(fā)酵溫度和菌種添加量的交互作用不顯著；由圖5C可知，感官得分隨著圣女果∶百香果汁配比的增加呈先上升后下降的趨勢，隨著發(fā)酵溫度的增加上升緩慢，果汁配比和發(fā)酵溫度的交互作用不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 最優(yōu)發(fā)酵條件的確定及驗證

由Design Expert8.0.6軟件得出復(fù)合果汁發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)是果汁配比5.69∶1、發(fā)酵時間30.98 h、菌種添加量2.94%、發(fā)酵溫度37.39 ℃，復(fù)合果汁發(fā)酵飲料的感官評分的預(yù)測值為82.46分。為便于實(shí)際操作，將發(fā)酵工藝條件修改為圣女果百香果果汁配比6∶1、發(fā)酵時間31 h、菌種添加量3%、發(fā)酵溫度37 ℃。根據(jù)此條件進(jìn)行驗證試驗，得出復(fù)合果汁發(fā)酵飲料的感官評分實(shí)測值為82分。該值與預(yù)測值比較近，因此選取此為復(fù)合果汁發(fā)酵飲料的發(fā)酵工藝參數(shù)。

2.3 圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)分析

利用最優(yōu)發(fā)酵條件發(fā)酵的圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)指標(biāo)見表5。

表5 圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)指標(biāo)Table 5 Quality indexes of compound fermented beverage with cherry tomato and passion fruit

續(xù)表

由表5可知，復(fù)合發(fā)酵飲料的pH、可溶性固形物、總酸、還原糖、總酚、總黃酮、番茄紅素、維生素C、乳酸菌總數(shù)分別為3.30、11.50%、5.95 g/100 mL、6.68 g/100 g、40.03 mg/100 g、6.83 mg/g、32.83 mg/100 g、23.31 mg/100 g、5.2×106CFU/mL。3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料工藝參數(shù)。結(jié)果表明，各因素對圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料中感官評分影響大小依次為果汁配比、發(fā)酵時間、菌種添加量、發(fā)酵溫度；最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：圣女果∶百香果汁配比6∶1、發(fā)酵時間31 h、菌種添加量3%、發(fā)酵溫度37 ℃。在此發(fā)酵條件下，圣女果百香果復(fù)合發(fā)酵飲料感官評分達(dá)82分，呈橘紅色、色澤光亮，具有圣女果、百香果固有香味，風(fēng)味獨(dú)特，酸甜適口。發(fā)酵后復(fù)合發(fā)酵飲料的pH、可溶性固形物、總酸、還原糖、總酚、總黃酮、番茄紅素、維生素C、乳酸菌總數(shù)分別為3.30、11.50%、5.95 g/100 mL、6.68 g/100 g、40.03 mg/100 g、6.83 mg/g、32.83 mg/100 g、23.31 mg/100 g、5.2×106CFU/mL。為進(jìn)一步開發(fā)兼具圣女果與百香果復(fù)合香味、營養(yǎng)豐富、保健功效的植物型乳酸發(fā)酵產(chǎn)品提供參考依據(jù)。