超聲輔助熱水浸提小球藻多糖及抗氧化活性測定

劉 芬，朱順妮，徐忠斌，王忠銘*

（1.中國科學院 廣州能源研究所，廣東 廣州 510640；2.中國科學院可再生能源重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東省新能源與可再生能源研究開發與應用重點實驗室，廣東 廣州 510640；4.中國科學院大學，北京 100049）

近年來，微藻因其較高的含油量而受到廣泛關注，被認為是最有潛力替代傳統化石燃料的生物資源[1]。微藻種類繁多、環境適應能力強、生長周期短、固碳能力強，其中小球藻因其更快的生長速率成為最廣泛培養的微藻品種之一[2]。除了油脂可利用外，微藻還富含多糖、蛋白質、維生素等多種營養成分，而實現對這些成分的利用是降低微藻生物能源生產成本，提高微藻利用經濟性的關鍵[3]。近年來，小球藻在傷口愈合、解毒、抗腫瘤、生長刺激和免疫增強等方面的潛在治療作用被廣泛報道，研究表明這些生物活性主要與多糖和蛋白質復合物有關[4-6]。

活性多糖的提取是研究和利用多糖的前提。因多糖是強極性大分子化合物，傳統上采用熱水浸提法提取，但是該方法耗時長，難以使胞內多糖溶出[7]。稀酸、稀堿溶液浸沉雖然可以在一定程度上提高多糖的提取率，但是可能會破壞多糖的結構，如硫酸酯基結構，影響多糖的生物活性[8-9]。超聲輔助提取、微波輔助提取和酶解法等可以有效地提高提取率[10]。超聲輔助提取因產熱少、耗時短、抽提率高等優點而應用較多[11]。

因此，本研究采用超聲輔助熱水浸提法提取小球藻多糖，并采用單因素及響應面法優化提取條件，利用傅里葉紅外變換（Fourier transform infared spectrometry，FTIR）對最優提取條件下獲得的多糖進行結構表征，并測定了其體外抗氧化活性，為小球藻多糖的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻藻粉：由戶外跑道池養；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度97%）：東京化成工業株式會社；OH·測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

VCX800超聲儀：美國SONICS &MATERIALS公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀：德國BRUKER公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；5804R離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 小球藻粗多糖的制備

稱取一定量小球藻藻粉，以1∶20（g∶mL）料液比加入蒸餾水，按照所需實驗條件進行超聲破碎、熱水浸提多糖，離心（8000r/min、10min）取上清，加入4%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），4 ℃靜置過夜，離心（5 000 r/min、20 min）取上清加入5倍體積分數為95%乙醇，4℃靜置過夜離心（8000r/min、10 min）取沉淀，-80 ℃凍干即獲得小球藻粗多糖。

1.3.2 多糖含量測定

取一定量的粗多糖復溶，利用改良的苯酚-硫酸法[12]測定多糖質量濃度，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到的標準曲線回歸方程為：y=0.008 1x-0.010 6，相關系數R2=0.996 9。按照標準曲線回歸方程計算樣品中多糖的含量，多糖得率計算公式如下：

式中：C為復溶液多糖質量濃度，mg/mL；V為復溶液體積，mL；M0為復溶粗多糖質量，g；M1為總粗多糖質量，g；W為原料質量，g。

1.3.3 提取條件優化單因素試驗

以多糖得率為評價指標，對影響提取結果的超聲時間、提取溫度、提取時間3個因素進行單因素試驗，固定超聲功率均為280 W，超聲時間分別為0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，提取溫度分別為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃，提取時間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h。

1.3.4 提取條件優化響應面試驗設計

依據單因素試驗結果，利用Box-Behnken中心組合設計，以超聲時間（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為自變量，多糖得率（Y）為響應值，優化提取條件。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 紅外光譜分析

取1 mg左右的小球藻粗多糖樣品，以KBr壓片，在波數4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描。

1.3.6 抗氧化活性試驗

（1）DPPH自由基清除率測定[13]

配制不同質量濃度的多糖溶液，2 mL 樣品溶液中加入0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL，混合均勻后于室溫下避光反應30 min，于波長517 nm條件下測定吸光度值，以維生素C（vitamin V，VC）為陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為對照吸光度值（乙醇替代樣品）；A1為樣品吸光度值；A2為空白吸光度值（乙醇替代DPPH）。

（2）OH·清除率測定

利用南京建成OH·清除率測定試劑盒檢測。OH·清除率計算公式如下：

式中：Ab為對照組吸光度值（雙蒸水替代樣品）；As為樣品組吸光度值。

2 結果與分析

2.1 多糖提取的單因素試驗結果

由圖1A可知，小球藻多糖的提取率隨著超聲時間在0～60 min范圍內的延長而升高；當超聲時間為50 min時多糖的得率達到最高，為3.34%；之后稍有降低。這是因為超聲時間越長，對小球藻的破壞作用越強，有助于小球藻多糖的溶出，但是過長時間的超聲會對多糖的結構造成破壞[14]，可能會不利于后期多糖的沉出。因此，超聲時間50 min為宜。

由圖1B可知，小球藻多糖的提取率隨著提取溫度在50～100 ℃范圍內的升高而升高，上升趨勢于90 ℃之后趨于平緩。隨著提取溫度的升高，多糖的溶解度逐漸增大，但是長時間的高溫浸提可能會使多糖的糖鏈發生斷裂[15]，不利于后期多糖回收。因此，提取溫度90 ℃為宜。

由圖1C可知，提取時間在1～3 h范圍內，小球藻多糖得率呈上升趨勢；并在提取時間為時多糖的得率達到最高，為4.02%；當提取時間＞3 h之后出現明顯下降，這與孫建瑞等[16]的研究結果相同。長時間的浸提有利于多糖的溶出，但是過長提取時間的高溫浸提會造成多糖的降解[17]，不利于后期的回收。因此，提取時間3 h為宜。

圖1 超聲時間（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）對小球藻多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic time (A),extract temperature (B) and time (C) on yield of polysaccharide from Chlorella sp.

2.2 小球藻多糖提取條件優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面設計及結果

依據單因素試驗結果，多糖得率（Y）為響應值，以超聲時間（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為變量，采用響應面法優化超聲輔助水熱法提取小球藻多糖條件，試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

通過對實驗數據分析，可得小球藻多糖得率的二次多項式回歸方程：

對該模型的方差及顯著性進行分析，結果見表3。由表3可知，回歸模型的P值=0.000 3＜0.01，失擬項P值=0.240 2＞0.05，模型極顯著，失擬項不顯著，說明模型可靠。決定系數R2=0.962 8，表明該模型的擬合度較好，可以很好地反應多糖得率與超聲時間、提取溫度和提取時間之間的關系。每種因子對小球藻多糖得率的影響程度為提取溫度＞超聲時間＞提取時間。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應面分析

三維響應面和等高曲線是回歸函數的圖形表示，反映了兩個測試變量之間的相互作用以及響應值與各變量試驗水平之間的關系。由圖2a可知，在提取溫度80～100 ℃內，隨著超聲時間的增加，多糖得率先上升后下降；當超聲時間在40～60 min時，隨著提取溫度的提高，多糖得率總體呈上升趨勢。說明提取溫度對響應值的影響更為顯著，與超聲時間的交互作用不顯著。由圖2b可知，曲面圖的陡峭趨勢較為平緩，說明超聲時間和提取時間對多糖得率的影響較小。超聲時間在40～60 min時，隨著提取時間的增長，多糖得率先上升后降低；當提取溫度80～100 ℃內時，多糖得率同樣先升高后降低，超聲時間不同，最佳提取溫度不同。說明提取時間和超聲時間之間有交互作用。由圖2c可知，在提取溫度80～100 ℃內，隨著提取時間的增長，多糖得率先上升后下降；當提取時間在2～4 h時，隨著提取溫度的提高，多糖得率先上升后趨于平緩。說明提取溫度對響應值的影響極顯著（P＜0.01），與超聲時間的交互作用不顯著（P＞0.05）。

圖2 超聲時間、提取溫度及提取時間對多糖得率影響的響應面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between ultrasonic time,extract temperature and time on polysaccharide yield

2.2.3 最佳提取條件的驗證

經軟件Design-Expert 8.6分析，超聲輔助熱水浸提小球藻多糖的最佳條件為超聲時間51.90 min，提取溫度96.61 ℃，提取時間3.05 h，此條件下多糖得率理論值為5.38%。為方便實驗操作，將預測條件調整為超聲時間52 min，提取溫度97 ℃，提取時間3.0 h，獲得多糖得率實際值為5.30%，實際值和預測值的相對誤差為1.49%，表明用該回歸模型預測小球藻多糖得率是準確可行的。優化后的多糖得率與凍融輔助超聲提取法[18]（5.92%）及酶輔助提取法[19]（5.78%）相近，比傳統熱水浸提的得率提高了2.46倍。

2.3 小球藻多糖的紅外光譜分析

小球藻多糖的紅外圖譜見圖3。因多糖樣品為雜多糖，圖譜較單一多糖組分更為復雜[20]。由圖3可知，波數3394cm-1、2 928 cm-1處的-OH和C-H是多糖的特征吸收峰。1 724 cm-1處附近為C=O振動吸收峰，波數1 667 cm-1和1 419 cm-1處附近為COO-的伸縮振動，表明多糖中含有糖醛酸[21-22]。波數100～1 200 cm-1處附近為C-O-C伸縮振動，表明多糖樣品中含有吡喃糖環。波數928 cm-1以及835 cm-1處附近的吸收峰表明，該多糖既有α-糖苷鍵又有β-糖苷鍵[23-24]。

圖3 小球藻粗多糖的紅外圖譜Fig.3 Infrared spectrogram of crude polysaccharide from Chlorella sp.

2.4 小球藻多糖的抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力

DPPH是一種可以穩定存在的氮族自由基，在波長517nm處有最大吸收峰，被抗氧化物還原后消失，被廣泛用于評價物質的抗氧化性[25]。由圖4可知，小球藻多糖對DPPH自由基的清除能力隨著劑量的增大而增強，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值為4.83 mg/mL，優于乙醇分級沉淀的小球藻多糖[13]，可能由于未進一步純化。

圖4 小球藻粗多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of crude polysaccharide from Chlorella sp.on DPPH free radicals

2.4.2 對OH·的清除能力

OH·是生物細胞內反應活性最強的氧族自由基，具有很高的電子還原電勢，能與生物體內脂類、蛋白質、核酸等生物大分子產生最強的氧化破壞效應，引起細胞與組織的氧化損傷[27]。由圖5可知，小球藻多糖對OH·的清除呈劑量依賴型，最大去除率可達95%，IC50值為0.77 mg/mL，去除能力高于酶輔助提取的小球藻多糖[19]。OH·去除率在達到最大值后趨于平穩狀態。

圖5 小球藻粗多糖對羥自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of crude polysaccharide from Chlorella sp.on OH free radicals

3 結論

本試驗利用超聲輔助熱水浸提小球藻多糖，在單因素試驗的基礎上，采用響應面優化設計得到小球藻多糖的最佳提取工藝為：超聲時間52 min，提取溫度97 ℃，提取時間3.0 h，多糖得率為5.30%，與預測值5.38%較好吻合。提取的多糖具有多糖的典型特征吸收峰，含有糖醛酸，為吡喃糖，同時表現出對DPPH·及OH·的顯著清除作用，是一種潛在的天然抗氧化劑。綜上，超聲熱水輔助浸提小球藻多糖可有效提取小球藻多糖并保留多糖自身活性。提取的小球藻多糖可進一步去雜提純以提高其有效的活性成分，并用于其他活性測試。