葡萄酒中與風味相關4類含硫化合物的研究進展

張清安，陳博宇

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710119）

葡萄酒是一種成分復雜的發酵飲料，葡萄酒所含的化合物很大程度上決定了其外觀、香氣、味道和口感[1]。其中含硫化合物是葡萄酒中對營養價值、風味有重要影響的化合物，如還原型谷胱甘肽（GSH）具有抗氧化、增強免疫力和解毒的作用，在生物還原、保護紅細胞、抗氧化應激、抗異生素和內源性毒性代謝物解毒、酶活性及硫和氮代謝中發揮關鍵作用，對代謝和炎癥疾病如多發性硬化、代謝綜合征和糖尿病也有重要的功效[2-4]；揮發性含硫化合物如4-巰基-4-甲基戊-2-酮（4MMP）、3-巰基-1-己醇（3MH）和3-巰基己基乙酸酯（3MHA）是葡萄酒百香果香氣和葡萄柚香氣的重要來源[5-8]，而二氧化硫（SO2）、硫化氫（H2S）和低級硫醇如甲硫醇（MeSH）、乙硫醇（EtSH）則使葡萄酒產生不愉快的氣味。葡萄酒中谷胱甘肽、硫醇、硫化氫和二氧化硫的含量、來源及貯藏期間的變化情況各不相同且極其復雜，目前仍沒有統一的結論。因此，本文就近年來國內外針對葡萄酒中這4類含硫化合物存在形態、來源、檢測技術、貯藏期間的變化及控制方法5個方面的研究進展進行梳理，以期為優化葡萄酒生產工藝、提升葡萄酒品質提供參考。

1 葡萄酒中4類含硫化合物的概況

在4類含硫化合物中，谷胱甘肽是非揮發性含硫化合物，其結構中含有游離巰基，具有氧化還原和親核性質；揮發性含硫化合物根據結構可分為硫醇、硫化氫和二氧化硫，三者具有各自的特征氣味且感官閾值極低，其含量對葡萄酒的風味影響顯著。

1.1 谷胱甘肽

谷胱甘肽（glutathione）是一種由L-谷氨酸（LGlu）、L-半胱氨酸（L-Cys）和甘氨酸（Gly）經肽鍵縮合而成的三肽物質，廣泛存在于動植物體內[9]。谷胱甘肽主要以還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）形式存在（圖1），也有少部分會與輔酶A或半胱氨酸等形成混合二硫化物，一般情況下超過90%的谷胱甘肽以還原型存在[10]。1989年，CHEYNIER等[11]首次檢測出葡萄果實中GSH的含量，由于品種、產區、收獲期等因素，GSH的含量有所差異，在17—114 mg·kg-1，而未發酵葡萄汁中GSH的含量在1—20 mg·L-1。根據FRACASSETTI等[12]和KRITZINGER等[13]對白葡萄酒的測定結果，其中GSH的含量不高于70 mg·L-1。JANES等[14]檢測了新釀長相思白葡萄酒中的GSH含量，其結果在1.3—34.7 mg·L-1，平均值為12.5 mg·L-1。

1.2 硫醇

圖1 還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的結構Fig.1 Structure of the GSH and GSSG

硫醇是一類含有巰基官能團的化合物，揮發性硫醇感官閾值極低，對葡萄酒風味有重要影響[8]。葡萄酒中的硫醇主要是低級硫醇，如甲硫醇（MeSH）、乙硫醇（EtSH）和多官能團硫醇如4-巰基-4-甲基戊-2-酮（4MMP）、3-巰基-1-己醇（3MH）和3-巰基己基乙酸酯（3MHA）等。根據SIEBERT等[15]對澳大利亞產區的紅、白葡萄酒中低級硫醇含量測定的結果，MeSH和EtSH的含量分別低于8 μg·L-1和1 μg·L-1。TOMINAGA等[7]于1998年首次檢測出長相思葡萄酒中3種多官能團硫醇的含量，其結果分別為19.4—26.8 ng·L-1（4MMP），943—1 038 ng·L-1（3MH），30.9—36.8 ng·L-1（3MHA）。在此研究基礎上，FERREIRA等[16]、SCHNEIDER等[17]和RODRíGUEZ-BENCOMO等[18]改進了對4MMP、3MH和3MHA的檢測方法，并提高了檢測精度，最終測得4MMP、3MH和3MHA的含量分別為≤19 ng·L-1、500—3 200 ng·L-1、9—18 ng·L-1。但是葡萄酒中的一些硫醇如MeSH除了以游離態存在外，還會與金屬離子如Cu2+、Zn2+可逆結合形成無氣味化合物。根據FRANCO-LUESMA等[19]報道，紅葡萄酒中平均60%以上的MeSH以結合態形式存在，白葡萄酒中結合態形式平均占30%以上。

1.3 硫化氫

硫化氫（H2S）是揮發性極強的含硫化合物，在5—10 μg·L-1低濃度時就能在葡萄酒中呈現出臭雞蛋或腐敗物的“還原性”臭味，如果不及時去除，H2S可進一步與醇類物質結合形成硫醇，其中低級硫醇會產生不愉快風味且不易去除，所以釀酒時要及時發現、控制并盡可能降低H2S含量，以保證葡萄酒優良的感官質量[20]。葡萄酒中H2S的含量與含硫化合物、酵母菌株種類、發酵條件和葡萄汁的營養成分有關[21]。LóPEZ等[22]測定了西班牙產區21種白葡萄酒和13種紅葡萄酒中H2S的總含量，其中紅葡萄酒中H2S的總含量在13 μg·L-1以下，平均含量為2.8 μg·L-1；白葡萄酒中H2S的總含量不高于30 μg·L-1，平均含量為7.6 μg·L-1。H2S在葡萄酒中易與金屬離子結合形成無氣味化合物，根據FRANCO-LUESMA等[19]的研究結果，西班牙產區葡萄酒中大部分H2S以結合態形式存在，平均只有7%的H2S以游離態存在；其中紅葡萄酒中游離態H2S的含量低于3.44 μg·L-1，占總含量的6%左右；白葡萄酒中游離態的H2S含量低于3.94 μg·L-1，約占總含量的7%。

1.4 二氧化硫

二氧化硫（SO2）是一種常見的食品添加劑，帶有燃燒火柴的味道，感官閾值在20—25 μg·L-1，主要有抑菌、抗氧化、改善果酒風味和增酸等作用[23]。在葡萄酒釀造過程中，添加SO2的目的在于抑制細菌繁殖、防止氧化和變質。在葡萄汁剛榨出時，需添加SO2防止腐敗；在發酵時，為了防止釀酒酵母把糖分發酵完，也需要添加SO2適時終止釀酒酵母的代謝發酵，保留一定的含糖量[24]。SO2在葡萄酒中常以SO2氣體或亞硫酸氫根的游離態存在，或與含羰基化合物成鍵以結合態形式存在[25]。OLIVEIRA等[25]對葡萄酒中游離態和結合態SO2含量進行測定，其結果分別為2.1—30.9 mg·L-1和64.8—166.5 mg·L-1。適當添加SO2可以保護葡萄酒中的芳香物質，并促進陳釀香氣的形成，減弱霉味等不良風味；但如果用量過大，或發酵結束溫度仍較高時使用SO2，會形成一些不良風味，如硫味、臭雞蛋味和蒜味等[26]。我國食品添加劑使用標準（GB 2760—2014）規定，葡萄酒中SO2的使用量不得高于250 mg·L-1，甜型葡萄酒系列產品中SO2使用量不得高于400 mg·L-1。國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）規定，還原物質少于4 g·L-1的紅葡萄酒中SO2總含量不得高于150 mg·L-1，還原物質少于4 g·L-1的白葡萄酒和桃紅葡萄酒中SO2總含量不得高于200 mg·L-1，還原物質高于4 g·L-1的紅葡萄酒、白葡萄酒和桃紅葡萄酒中SO2總含量不得高于300 mg·L-1，在一些甜白葡萄酒中SO2總含量不得高于400 mg·L-1。

由上可知，葡萄酒中4類含硫化合物的含量及存在形態對葡萄酒的風味有重要影響，其中3類揮發性含硫化合物的感官閾值極低，且其含量高于感官閾值，對葡萄酒風味影響顯著，4類含硫化合物的具體特性及比較見表1。

表1 葡萄酒中4類含硫化合物特性比較Table 1 Comparison of characteristics of four sulfur compounds in wine

2 葡萄酒中4類含硫化合物的來源

這4類含硫化合物的來源可分為內源性途徑和外源性途徑，內源性途徑主要是發酵期間微生物對原料的代謝降解過程，外源性途徑包括原料自身含有的含硫化合物及葡萄酒生產過程中添加的含硫化合物等。其中，微生物的代謝過程是近年的研究熱點。

2.1 谷胱甘肽的來源

一般來說，未發酵葡萄汁中的GSH是葡萄酒中GSH的主要來源[29]。在葡萄葉的細胞溶質和葉綠體中，L-谷氨酸和L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用下形成γ-谷氨酰半胱氨酸，后者進一步與甘氨酸在GSH合成酶作用下形成GSH，隨后GSH從葉子中導出，通過韌皮部分配到果實、種子和根中[30-31]。此外，釀酒酵母中也含有少量的GSH，占釀酒酵母干重的1%左右（10 g·kg-1）[32]。除外源性途徑外，發酵期間酵母利用葡萄糖等作為碳源，以谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸為前體物質代謝產生GSH[33]。此外，葡萄的采收方法、果汁壓榨條件、發酵條件如溫度、pH等也會影響葡萄酒中GSH的含量，其中氧氣和其他活潑氧化物（如醌類物質）影響最顯著[34]。

2.2 硫醇的來源

葡萄酒中的硫醇化合物大多來源于含硫氨基酸的發酵、GSH降解以及以H2S為底物的化學反應和對應前體物質的發酵等[35-36]，如MeSH是蛋氨酸、半胱氨酸發酵的產物，EtSH是H2S與乙醛反應的產物等。WEIMER等[37]認為酵母可通過兩種代謝途徑產生MeSH，一種是蛋氨酸直接分解產生MeSH、氨氣和α-酮丁酸；另一種是蛋氨酸先形成中間產物α-酮-γ-甲硫基丁酸，再生成MeSH等代謝產物。

4MMP、3MH常來源于葡萄和葡萄汁中無氣味前體物質的發酵；而3MHA的生物轉化途徑較為特殊，它來源于3MH的進一步酯化[38]。根據DES GACHONS等[39]和TOMINAGA等[40]報道，其中4MMP和3MH分別來源于半胱氨酸化前體物質如S-3-（4-巰基-4-甲基戊-2-酮）-半胱氨酸（Cys4MMP）、S-3-（己烷-1-醇）-半胱氨酸（Cys3MH）和S-3-（4-巰基-4-甲基戊-2-酮）-谷胱甘肽（G4MMP）、谷胱甘肽化前體如S-3-（己烷-1-醇）-谷胱甘肽（G3MH）的發酵，其中Cys3MH作為前體物質形成3MH的產率明顯高于G3MH，而當G3MH作為前體物質形成3MH時，3MHA產率更高[41]。此外，HARSCH等[42]發現（E）-2-己烯-1-醇是一種新的3MH前體物質。根據HOWELL等[43]報道，4MMP的產生可受到負責編碼裂解Cys4MMP碳硫裂合酶的BNA3、CYS3、GLO1和IRC7影響。關于影響3MH產生的基因仍無定論，但涉及的基因不止IRC7[44]。3MHA由3MH與乙酸酯化形成，根據SWIEGERS等[38]報道，這種反應受成酯醇乙酰轉移酶（ester forming alcohol acetyltransferase）的控制，后者由ATF1編碼，其中VIN13酵母菌株中ATF1的過表達會引起3MHA含量顯著增加，而編碼酯降解酶的IAH1過表達會引起3MHA含量降低。根據MURAT等[45]報道，葡萄酒中揮發性硫醇含量與半胱氨酸結合物等前體物質的含量呈正相關性，而后者的含量與葡萄品種及其種植海拔、土壤等情況有關[46]。

2.3 硫化氫的來源

H2S是釀酒酵母代謝過程中硫酸鹽還原序列（SRS）途徑的產物，也是含硫氨基酸生物合成的中間產物，主要由含硫氨基酸、硫酸鹽和亞硫酸鹽等經酵母代謝分解產生，但是具體的前體物質可能與發酵條件有關[47]。根據報道，葡萄汁合成培養基發酵產生的H2S主要來源于亞硫酸鹽[48-51]。而根據KUNKEE等[52]報道，合成果汁培養基發酵產生的H2S主要來源于硫酸鹽。也有學者認為，葡萄酒中GSH是潛在的H2S前體物質。HALLINAN等[53]報道，在用硫酸鹽培養的氮饑餓酵母發酵產生的H2S中，40%來源于GSH。在缺乏氮源或硫源的條件下，GSH被迅速水解成氨基酸，其中半胱氨酸在半胱氨酸脫硫酶作用下進一步形成H2S，這一步主要受TUM1的影響[54]。

H2S發酵過程分兩個階段，發酵早期到中期產生的H2S與酵母的生長情況和營養物質如磷酸二銨（DAP）和泛酸的添加有關，發酵后期的影響因素較復雜，目前仍無定論[55]。H2S的產量主要與酵母菌株種類和基因有關，不同種類釀酒酵母菌株的H2S產率不同[56]。根據SPIROPOULOS等[57]報道，負責編碼O-乙酰絲氨酸/ O-乙酰高絲氨酸硫氫化酶的MET17過表達會抑制H2S產生。DONALIES等[58]報道，負責編碼腺苷磷酸激酶的MET14和負責編碼亞硫酸鹽泵的SSU1過表達會促進H2S產生。

2.4 二氧化硫的來源

葡萄酒中的SO2大多來自生產時的外源添加劑，其應用形式主要有偏重亞硫酸鉀、亞硫酸、液體SO2和硫磺片等[24]。SO2應用的關鍵在于各個工藝環節中的用量，其涉及因素有很多，如葡萄酒的成熟度、葡萄酒的類型、釀造工藝、設備狀況以及葡萄酒的內在質量（氧化程度、微生物感染程度、破敗程度、pH）等[26]。也有少部分SO2來源于微生物發酵過程，在硫酸鹽的代謝途徑中，SO42-被還原成SO32-，部分SO32-會分解產生SO2，是酵母代謝的中間產物[21]。

由上可知，除原料和添加劑外，這4類含硫化合物的來源主要與發酵期間釀酒酵母的代謝活動有關。因此，優化原料品質、改進生產工藝、了解其具體代謝途徑[1]（圖2）有助于減少異味產生、提升葡萄酒品質。

圖2 4類含硫化合物的主要代謝途徑及相關酶和基因Fig.2 Main metabolic pathway of four sulfur compounds and relevant enzymes and genes

3 葡萄酒中4類含硫化合物的檢測方法

由上述內容可知，葡萄酒的風味與4類含硫化合物的含量及存在形態有關，這兩者可能受原料品質和生產工藝影響。此外，4類含硫化合物檢測方法的精確度和檢測限不同也可能引起含量及存在形態的結果差異。

3.1 谷胱甘肽的檢測方法

在谷胱甘肽含量測定方面，ELLMAN[59]最早提出基于5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）與巰基反應，利用分光光度法測定黃色反應產物4-硝基苯硫酚化合物（TNB）吸光值（412 nm），通過換算得到GSH的含量。基于此原理，1989年，CHEYNIER等[11]用DTNB標記葡萄汁中的GSH，結合高效液相色譜（HPLC）首次檢測出葡萄汁中GSH的含量。根據JANES等[14]報道，利用鄰苯二甲醛（OPA）作為柱前衍生化試劑，以冰的脫氧甲醇為氧化酶抑制劑，配合高效液相色譜-熒光檢測（HPLC-FD）測定葡萄汁和葡萄酒中GSH的含量，排除氧化酶的影響，使GSH保持穩定，提高了檢測靈敏度，檢測限達0.06 mg·L-1。根據MARCHAND等[60]報道，以2,3-萘二醛（NDA）作為柱前衍生化試劑，配合HPLC-FD測定葡萄酒中GSH的含量，檢測限可達0.03 mg·L-1。這些測定方法主要原理是基于HPLC分離能力優良、靈敏性高、專一性強、線性范圍較寬、穩定性較高等特點，能夠同時測定GSH和GSSG。NDA是一種GSH原位標記探針，NDA-氨基硫醇加合物能夠被納入環糊精腔，提高熒光比率（fluorescence ratio）。LAVIGNE等[29]報道，選擇一溴聯苯（MBB）作為柱前衍生化試劑，配合毛細管電泳-激光誘導熒光法（CE-LIF）檢測葡萄酒中GSH含量時，檢測限可達到0.02 mg·L-1。KRITZINGER等[61]以對苯醌（pBQ）作為柱前衍生化試劑，配合超高效液相色譜-電噴霧電離串聯質譜法（UPLC-ESIMS/MS）檢測葡萄酒中GSH含量時，檢測限可達到0.0002 mg·L-1。

3.2 3類揮發性含硫化合物的檢測方法

葡萄酒中揮發性含硫化合物如硫醇和H2S的含量通常很低，需要特殊的樣品處理方法將其分離提取出來。ARTHUR[62]在1990年首次提出固相微萃取法（SPME），并將此技術應用到揮發性風味化合物的分析研究上。SPME是依據有機化合物能吸附在涂于石英細絲表面的色譜固定相上，且被吸附的分析物在氣相色譜儀（GC）的進樣口預熱可定量解析的原理設計的。它摒棄了傳統的溶劑，并將萃取、濃縮、解吸、進樣集于一體，具有靈敏度較高、操作簡單且成本較低等優點，目前已廣泛應用于各種食品風味分析中[63-64]。在此技術基礎上，LóPEZ等[22]對葡萄酒中主要揮發性含硫化合物進行了研究，利用頂空固相微萃取（HP-SPME）配合羧基聚二甲基硅氧烷（CAR-PDMS）纖維頭對葡萄酒樣品進行預處理，配合氣相色譜-脈沖火焰光度計檢測器（GC-PFPD）對樣品進行測定，最終定性并定量分析了6種含硫化合物。但是由于氧氣氧化及基底效應等問題，此方法精度不高。GüRBüZ等[65]采用固相微萃取靜態頂空采樣（static-HS-SPME）技術對葡萄酒樣品進行預處理，并與GC-pFPD、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）等檢測方法相結合，定性測出24種含硫化合物。

3.2.1 硫醇和硫化氫的檢測方法 在H2S和一些硫醇含量的測定上，考慮到它們會與葡萄酒中Cu2+及其他金屬離子結合形成非揮發性化合物，在定量分析時需分別測定游離態和總物質含量。FRANCO-LUESMA等[19,66]提出在測定游離態揮發性含硫化合物時，在無氧環境下將葡萄酒樣品和內標溶液加入標準頂空玻璃管中，通過HS-SPME預濃縮并進一步分析，最后利用GC-pFPD進行測定。在測定總揮發性含硫化合物含量時，需在相同條件下將葡萄酒樣品和內標溶液加入到含有NaCl溶液的標準頂空玻璃管中，后續操作同上。由于葡萄酒中部分硫醇含量極低，因此需要優化樣品制備和采用更靈敏的分析方法。針對痕量硫醇，TOMINAGA等[7]首次提出利用硫醇中硫基能與對羥基汞基苯甲酸汞（p-HMB）可逆性結合的特性，將痕量硫醇從葡萄酒的二氯甲烷萃取液中選擇性提取出來，后續采用GC-MS檢測含量；但在對4MMP進行檢測和分析時只基于其中一個片段，且用于從p-HMB復合物中提取硫醇的陽離子樹脂會導致3MHA分解為3MH，從而可能會導致試驗結果不精確。同時，由于硫醇具有較強的還原性，在提取過程中樣品很容易被氧化而影響試驗結果。基于此原因，FERREIRA等[16]同樣采用p-HMB提取樣品，通過填充LichrolutEN樹脂的載體除去干擾化合物，配合GC-MS檢測含量，提高了對硫醇的選擇性和檢測靈敏度。SCHNEIDER等[17]基于類似的方法，在液-液萃取技術（LLE）的基礎上，利用Affigel 501（一種帶有苯基汞凝膠的交聯瓊脂糖凝膠）捕獲特定的硫醇，并配合氣相色譜-原子發射光譜（GC-AED）測定4MMP的含量；氣相色譜與離子阱串聯質譜聯用（GC-ITMS-MS）測定3MH及3MHA的含量，且其檢測限都低于感官閾值。這是首次使用被標記的3MH、3MHA和4MMP作為內標物，克服了樣品的氧化問題。RODRíGUEZ-BENCOMO等[18]在處理葡萄酒樣品時，將4MMP肟化，并使用對苯二酚溴（PFBBr）和SPME進樣系統進行原位SPE衍生化，以氘類化合物作為內標物，以降低基底效應，配合GC-MS檢測3種物質的含量，分別將檢測限降低至1.3 ng·L-1（3MH）、0.25 ng·L-1（3MHA）、0.03 ng·L-1（4MMP）。

3.2.2 二氧化硫的檢測方法 傳統的SO2測定方法，是基于淀粉作為滴定終點指示劑的碘量滴定法，由于葡萄酒中還存在多酚等還原性物質，滴定終點難以觀察，這種檢測方法精確性不高。為提高精確性，林軍等[67]提出在酸性條件下，用碘標準溶液作為滴定劑，用電位滴定儀控制滴定終點，測定游離和總SO2的含量。測定總SO2濃度時，需先在堿性條件下，將樣品中的結合態SO2釋放為游離態SO2，再進行測定。為進一步提高精確度，流量法測定被提出；其原理主要是采用氣體擴散裝置[68]，微蒸餾裝置[69]或滲透蒸發裝置[70]等分離裝置將釋放的SO2從基質中分離出來，再采用分光光度計[71]、安培計[72]、電勢測定法[73]或化學熒光法[74]等檢測SO2的含量。但是，以上方法大多數需要樣品預處理，例如樣品稀釋和水解可能引起誤差。基于亞硫酸鹽與孔雀綠（malachite green）和副品紅（pararosaniline）反應能引起顏色變化[75-78]，金曉蕾等[79]建立連續流動分析儀測定不同類型葡萄酒中總SO2的檢測方法。將樣品在酸性條件下蒸餾，蒸餾液與甲醛及鹽酸副品紅反應生成紅色絡合物，利用連續流動分析儀（CFA）在 560 nm 波長處自動檢測得出總SO2含量。OLIVEIRA等[25]采用氣體擴散分離和分光光度檢測技術，建立了基于多重換向概念的流動體系測定酒中游離和總SO2含量的方法。他們將未經過預處理的酒樣直接注入流動系統，直接處理游離SO2或堿性水解釋放結合態SO2，讓其先與副品紅反應，再與孔雀綠反應，期間冰凍樣品，最后用紫外-可見光吸收光譜（UV-vis）檢測游離和總SO2含量。

由上可知，4類含硫化合物的檢測方法主要包括化學檢測方法、光譜法、色譜法等（具體方法見表2）。雖然檢測限不斷降低、精確度不斷提高，但是檢測時常常需要復雜的樣品預處理，且儀器昂貴，不適用于實際生產操作。這4類含硫化合物在葡萄酒中的含量通常較低，開發檢測限低、精確度高且便于實際生產操作的檢測方法有助于了解葡萄酒中含硫化合物的含量，利于高品質葡萄酒的生產優化。

4 葡萄酒貯藏期間4類含硫化合物的變化

貯藏陳釀是葡萄酒生產中的重要環節。在貯藏陳釀期間，葡萄酒會發生復雜的化學變化，從而影響葡萄酒的顏色、風味、口感和整體感官質量，其中4類含硫化合物在貯藏陳釀期間主要發生氧化還原反應。

4.1 4類含硫化合物在金屬離子作用下的變化

葡萄酒中的金屬離子主要來源于原料及葡萄酒生產中的外源添加劑，這些金屬離子能引起含硫化合物含量的變化，這種非酶促氧化過程是由金屬離子催化還原氧氣引發的[80]。DANILEWICZ[81-83]研究表明，氧的消耗由Fe3+介導，而Cu2+增強了這一過程。這些過渡金屬離子將氧氣氧化為過氧化氫，然后通過Fenton反應進一步還原產生極為活潑的羥基自由基，然后與葡萄酒中化合物反應[84]。根據NEDJMA等[85]報道，在Cu2+存在的條件下，H2S可以和MeSH、EtSH發生反應生成對稱和非對稱三硫化物。UGLIANO等[86]研究了葡萄酒裝瓶貯藏期中Cu2+對重要揮發性化合物3-MH、H2S、MeSH含量的影響，將含有不同Cu2+濃度的葡萄酒樣品裝瓶儲藏6個月，發現Cu2+的添加會導致3-MH含量在起始階段快速減少，同時使H2S含量增加；但是對MeSH的含量沒有顯著影響。VIVIERS等[87]研究了Cu2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+和Al3+離子在儲存期間對葡萄酒中H2S和MeSH含量變化的影響，結果顯示這5種過渡金屬離子都會影響葡萄酒中H2S和MeSH的含量，其中Cu2+的影響最為顯著。KREITMAN等[27-28]研究表明，當葡萄酒中存在過量的H2S和硫醇時，會引起H2S/Cu2+、硫醇/Cu2+絡合物的快速形成，并導致H2S和硫醇的損失。NIKOLANTONAKI等[88-89]則證實了Fe3+可以通過促進醌的形成，加快揮發性硫醇與多酚反應，從而影響葡萄酒中揮發性硫醇的含量。

4.2 4類含硫化合物在氧氣作用下的變化

葡萄酒中的氧氣可能來源于加工過程中發酵、倒罐、冷凍、灌裝等工序。已有文獻報道，極少量的氧氣就能在陳釀期間改善葡萄酒的品質，如減少收斂感、促進酒色穩定等[90-92]。DU TOIT等[34]控制葡萄酒中溶解氧的含量，發現還原性環境下的GSH含量更高，而氧化處理會顯著增加GSSG的含量。此外，揮發性含硫化合物的變化主要來源于氧化損失[93]。FRANCOLUESMA等[94]測定了無氧室溫環境儲存下葡萄酒中含硫化合物含量的變化情況，發現樣品酒和模型酒中游離H2S、MeSH和總MeSH含量都有顯著上升，但是H2S的總量變化不大。UGLIANO等[86]將樣品酒分別儲藏在空氣和氮氣環境下，結果顯示低氧條件能促進H2S的積累并減少3-MH的降解。根據FERREIRA等[93]報道，在氧氣含量非常小的樣品酒中H2S的含量也會受影響而降低，且H2S和MeSH的含量隨氧化程度增加而降低。

表2 葡萄酒中4類含硫化合物檢測方法比較Table 2 Comparison between detection methods of sulfur compounds in wine

由上可知，在葡萄酒貯藏陳釀期間，由于金屬離子和氧氣的作用，這4類含硫化合物會發生氧化還原反應、Fenton反應或沉淀等而引起含量變化（反應方程式見表1）。貯藏陳釀期是影響葡萄酒風味的重要生產環節，優化工藝條件、控制金屬離子和氧氣的濃度，同時理解含硫化合物的變化機理有助于提升葡萄酒的品質。

5 葡萄酒硫味的控制

由上述文獻可知，葡萄酒中含硫化合物主要來源于原料和釀酒酵母代謝，也受到原料處理、添加劑使用、貯藏陳釀等生產環節影響，因此主要從以下4個方面控制葡萄酒中的硫味。

5.1 原料控制

根據DES GACHONS等[95]報道，相較于低氮土壤，在含氮量合適土壤中生長的葡萄果實中含有更高含量的4MMP、3MH前體物質。以DAP作為氮補充劑添加到葡萄汁中會抑制MeSH、EtSH、H2S的產生，而對于3MH的影響仍無定論[96-99]。在制取汁時，皮渣浸漬可增加果汁中Cys3MH、G3MH的含量，相較于無皮渣浸漬和150 g·L-1皮渣浸漬葡萄汁，600 g·L-1皮渣浸漬葡萄汁發酵期間GSH產量更高[33,100]。根據MAGGU等[101]報道，在長時間表皮接觸（skin contact）制汁時，較高壓力產出的壓榨果汁3MH-S-Cys含量更高，但GSH含量較低。PATEL等[102]報道，相較于自然出汁（free run juice），壓榨果汁及其成品葡萄酒的3MHA、3MH含量和酸度值較低，GSH含量下降較快。此外，發酵前補充GSH會引起成品葡萄酒中硫醇濃度的降低，而壓榨果汁時的巴氏殺菌過程會引起成品葡萄酒中3MHA含量增加，3MH含量降低[102]。

5.2 酵母篩選和優化

酵母的種類對葡萄酒風味有重要影響，特別是揮發性含硫化合物產量[103-104]。BELJAK等[105]通過比較8種釀酒酵母對葡萄酒中SO2含量的影響，發現H2S陽性釀酒酵母更利于SO2產生，且發酵初始糖濃度較高時，SO2產率更高。宮雪等[106]篩選得到的HO2、E22酵母菌株H2S產率低，且酒樣感官品質與商業釀酒酵母VL1、RC212、C2C無明顯差異。EGLINTON等[107]比較Saccharomyces bayanus酵母和Saccharomyces cerevisiae酵母對葡萄酒品質的影響，發現Saccharomyces bayanus酵母發酵的葡萄酒含有更多的甘油、琥珀酸、乙醛和SO2，較少的乙酸、蘋果酸和乙酸乙酯，且氣味特征不同。DUBOURDIEU等[108]研究得出，相較于Saccharomyces cerevisiae酵母VL3和EG8菌株，Saccharomyces bayanus酵母能產生更多的4MMP。

根據HARSCH等[109]報道，分別敲除釀酒酵母中17個與硫代謝相關的基因，可顯著提升或降低3MH和3MHA的產量，如單獨敲除CYS3、CYS4或MET17的菌株3MH和3MHA的產量有顯著提升，而單獨敲除SER1或SHM2的菌株3MH和3MHA產量有所降低。SWIEGERS等[110]通過克隆編碼一種色氨酸酶的大腸桿菌tnaA，使其在酵母菌株中表達，可使4MMP和3MH的產量提升24倍。DUFOUR等[111]利用一個天然的URE2突變體，通過分子標記驅動回交技術（backcrosses driven by molecular markers）在釀酒酵母啟動子引入等位基因，發現URE2性狀遺傳能夠增加4MMP和3MH的產量。

5.3 優化SO2的使用

控制外源SO2的添加，可減少酵母可利用的硫元素，從而減少異味產生。LUSTRATO等[112]提出使用低電流技術（LEC）替代葡萄酒生產中的二氧化硫添加劑，結果顯示LEC降低了尖型酵母（Apiculate yeasts）的存活時間并增加其死亡率，而不影響釀酒酵母的生長和存活。LEC控制酵母菌群的作用與SO2相當，同時減少硫元素的攝入，有利于減少異味產生。柳琪等[26]得出改進或規范生產操作能減少葡萄酒中SO2的含量：1）盡量保證原料完好無損，受病蟲害、破損及霉變的葡萄原料會引起葡萄醪中可與SO2結合的物質含量增加；2）盡量保證酵母的純度，使用優良酵母菌系，能抑制產SO2菌系的活性；3）加快葡萄酒的澄清，減少葡萄酒中的懸浮物與SO2結合；4）山梨酸對酵母菌有抑制作用，裝瓶時結合SO2使用，可減少SO2用量；5）維生素C具有抗氧化作用，裝瓶時可將維生素C代替或結合SO2使用。

5.4 金屬鹽處理

此外，生產中常用硫酸銅法、檸檬酸銅法和銀鹽法降低葡萄酒異味[113-114]。根據VELA等[115]報道，銅鹽處理可立即降低葡萄酒中游離H2S和MeSH的含量，并減緩低氧儲存期間游離H2S的增加。這3種方法各自存在著不足之處：1）硫酸銅法 硫酸銅可與H2S和硫醇發生反應產生沉淀，但不能與二硫化物反應，而在儲存期間二硫化物易被水解還原成硫醇，產生不良氣味；2）檸檬酸銅法 使用時試劑用量大，釋放的銅離子較少，反應效率較低；3）銀鹽法 處理后酒樣必須經過皂土澄清，增加處理難度和成本。此外，用銅離子與H2S、硫醇反應產生沉淀時，反應可能不完全，導致少部分產物殘留，后分解重新生成H2S和硫醇，且上述3種處理方法都會對葡萄酒口感產生負面影響。

除上述方法外，控制貯藏陳釀期間葡萄酒中過渡金屬離子和氧氣的含量（見4.1，4.2），也有利于降低異味。還可以潑灑葡萄酒，通過揮發和氧化除去異味[116]。

6 展望

通過上述分析可知，葡萄酒中4類含硫化合物對葡萄酒的風味有顯著影響，但是在實際生產時無法精確控制其含量。這主要是因為目前對4類含硫化合物的來源和變化情況仍不清楚，特別是發酵階段變化機理及貯藏陳釀期間的變化機理。在今后的研究中可以從以下幾個方面開展：

一是優化含硫化合物的檢測方法，現有的檢測方法仍存在樣品易污染、檢測時間長、精確度低等問題。未來研究可從樣品處理方法和檢測方法分別開展，優化現有的樣品分離方法、開發更高效的柱前衍生化試劑、優化色譜條件等，縮短檢測時間、降低檢測限、增加精確度。

二是探究葡萄酒發酵和貯藏陳釀期間4類含硫化合物含量變化及機理。未來在機理研究中可采用模型酒形式，控制模型酒中化合物的種類和含量，簡化反應的環境，利于探究各類化合物的變化情況。

三是改進葡萄酒生產工藝，從原料種植環節到產品封裝環節層層優化。首先，在葡萄原料種植環節，選擇合適的土壤、肥料和溫濕度等，提升葡萄果實品質。其次，在葡萄采收環節，改進采收技術，避免損壞果實。第三，在榨汁環節，選擇合適的壓力、氧氣含量、皮渣含量，提升葡萄汁品質。第四，在二氧化硫使用環節，改進使用方法，減少用量，或開發合適的替代品，以減少產品中二氧化硫含量。第五，在釀造環節，篩選或生物技術改良酵母菌株，選擇合適的溫濕度、含氧量、添加劑等，減少不愉快風味。第六，在貯藏陳釀期間，選擇合適的溫濕度、含氧量、金屬離子濃度等，進一步提升葡萄酒品質，并減少不愉快風味。最后，在葡萄酒封裝環節，優化洗瓶、灌裝工藝，選擇合適的瓶塞、滅菌條件等。