熱脅迫對大腸桿菌細胞膜和膜蛋白的影響

張愛靜，李琳瓊，王鵬杰，高瑀瓏

（南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心/江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023）

0 引言

【研究意義】大腸桿菌是一類在自然界廣泛存在且極易引起食品污染的革蘭氏陰性菌[1]。在自然環境中，大腸桿菌經常遭受高溫、低溫、酸、堿及滲透壓等不適環境的脅迫，由于被不適環境條件脅迫，誘發其啟動自我保護機制，通過對外界不利環境的適應而進行生長。在食品生產加工過程中，食品原料中的微生物經常處于脅迫環境中，面對不適宜的生長環境條件，其生理代謝會發生應激反應，通過這種對不良環境的適應能力使其生存下來[2-3]。高溫殺菌是食品工業中通常采用的一種滅菌手段[4]。微生物的耐熱性不僅受遺傳因素的影響，還受環境因素的影響[5]。微生物會對不利的生存環境產生抗性或適應性反應的機制，近年來引起了研究者的廣泛關注[6-7]。然而，微生物對不利環境因素產生抗性或適應性反應的機制尚未研究清楚，深入系統研究大腸桿菌在食品加工過程中熱脅迫響應機制，為高溫殺菌技術在食品工業中的應用奠定理論基礎，對于保障食品加工安全，建立食品質量安全控制體系具有重要意義。【前人研究進展】GIULIODORI等[8]研究發現，將大腸桿菌從最適培養溫度37℃轉移至10℃培養時，其會迅速做出冷應激反應，誘導相關基因的合成與冷休克蛋白的表達等。CEBRIáN等[9]通過對金黃色葡萄球菌進行亞致死性的酸、堿和過氧化氫脅迫處理，發現與原始對照菌株相比，適應性菌株對這些致死條件的抗性增加，表明金黃色葡萄球菌經過酸、堿和過氧化氫脅迫處理產生了抗性。有研究認為[10-11]，細胞膜流動性發生變化是菌體對不利生存環境產生適應性的原因之一。細胞膜是緊貼在細胞壁內側包裹細胞質的一層柔軟而富有彈性的半透性薄膜，是由磷脂和蛋白質分子組成的生物膜。流動的脂質雙分子層是生物膜結構的基本特征，適宜的流動性是保證細胞處于正常生理狀態的重要條件。BENEY等[12]研究表明，脅迫蛋白參與信號傳導，在防止蛋白變性和穩定細胞膜結構方面起到一定作用。微生物對環境變化的感受和迅速做出反應的能力對其生存尤為重要，大多數微生物都有這樣的能力[13-15]。【本研究切入點】根據張愛靜等[16]的研究，發現大腸桿菌ATCC43889分別經50℃、60℃和70℃10次熱脅迫均可誘導其抗熱性增加，經10次熱脅迫并轉接培養后，D值顯著增大（P＜0.05），且脅迫溫度越高，D值越大。然而，微生物對熱脅迫環境因素產生抗性或適應性反應的機制尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】本研究以食品生產加工中常見的污染菌大腸桿菌為試材，研究熱脅迫作用下大腸桿菌抗熱性增加與個體形態變化、生物被膜生成能力、細胞膜脂肪酸組成、細胞膜流動性變化以及外膜蛋白表達的關系，旨在綜合分析熱脅迫誘導大腸桿菌耐熱性增加的機制，為研究食品加工條件，加強食品安全預測及控制提供依據。

1 材料與方法

試驗于2018年在南京財經大學食品科學與工程學院進行。

1.1 材料與試劑

大腸桿菌ATCC43889購于江蘇省疾病預防控制中心，采用胰蛋白胨大豆肉湯（Trypticase Soy Broth，TSB）培養基培養。供試菌經活化后，接入TSB培養基，36℃、140 r/min搖床振蕩培養18 h，備用。

正己烷、甲醇、乙醚和甲基叔丁基醚為色譜純；氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鎂、氯仿、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、戊二醛、乙醇、冰乙酸為分析純；37種脂肪酸甲酯混標；TSB培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（Trypticase Soy Agar，TSA）培養基，購于南京丁貝生物科技有限公司。

皂化溶液I：由15 g氫氧化鈉、50 mL甲醇與50 mL蒸餾水混合配制；甲基化溶液Ⅱ：由65 mL 6 mol·L-1鹽酸與55 mL甲醇混合配制；萃取溶液Ⅲ：由50 mL正己烷與50 mL乙醚混合配制；洗滌溶液Ⅳ：由0.36 g氫氧化鈉與30 mL蒸餾水混合配制。

無菌緩沖液A（10 mmol·L-1PBS，pH 7.2—7.4）；無菌緩沖液B（包含10 mmol·L-1MgCl2與250 mmol·L-1Tris，pH 7.5）；無菌緩沖液C（50 mmol·L-1Tris/HCl，pH7.4）。

彩虹180廣譜蛋白Marker、5×蛋白質上樣緩沖液、TritionX-100、30%丙烯酰胺制膠液、四甲基乙二胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍R250、BCA蛋白濃度測定試劑盒、96孔微量酶標板和色譜柱HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm），購于南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S塞多斯精密電子天平，北京塞多斯天平有限公司；601超級恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機，上海市離心機械研究所有限公司；M200多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；S-3400N II掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；Agilent 6820型氣相色譜儀，GCMS-QP2010型氣相色譜-質譜聯用設備，安捷倫科技儀器公司；DSC-8000差示掃描量熱儀，珀金埃爾默股份有限公司；JY-SCZ2+電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；ZF-258凝膠成像系統，上海金鵬分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 3種抗熱性大腸桿菌ATCC43889菌株的獲得將1.1中活化的原始對照菌株ATCC43889按體積比為1%轉接至裝有200 mL TSB培養基的500 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養18 h至穩定期，分別將10 mL培養液加入無菌的中號試管（20 mm×200 mm），置于50℃、60℃和70℃的熱水浴中進行加熱脅迫處理，處理時間各為15 min，按照體積比為1.5%—2%的各溫度加熱脅迫處理后的ATCC43889菌種分別接種于裝有100 mL TSB培養基的250 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養18 h至穩定期，再分別取10 mL培養液加入無菌的中號試管（20 mm×200 mm），置于50℃、60℃和70℃的熱水浴中進行加熱脅迫處理，處理時間各為15 min；以此類推，重復以上恒溫振蕩培養與加熱脅迫處理10次，得到分別經50℃、60℃和70℃反復熱脅迫處理10次并轉接培養10次的3種抗熱性的ATCC43889菌株。ATCC43889的穩定期通過平板菌落計數方法結合比濁法測得的生長曲線來測定[17]。

1.3.2 大腸桿菌ATCC43889個體形態的觀察 參照梁靜南等[18]與胡春輝等[19]的方法，并做適當修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株與1.3.1中獲得的3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有100 mL TSB培養基的250 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養至穩定期，離心（4℃，5 000×g，15 min），棄上清液，再以0.85%無菌氯化鈉生理鹽水洗滌1次；加入2.5%戊二醛，用微型漩渦混合儀振蕩3—5 min，使其與固定液充分接觸，于室溫下固定3 h后，離心（4℃，5 000×g，15 min），棄上清液，加入緩沖液A，振蕩3—5 min，離心（4℃，5 000×g，15 min），棄上清液，重復2次；將離心管中的樣品依次分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇脫水離心（25℃，5 000×g，15 min），棄上清液；將上述樣品放置于干燥箱（40℃，3 h）里干燥，之后將其固定在載物臺上，置于鍍金儀中真空噴金90 s，最后用掃描電鏡拍照。掃描電鏡使用的電壓為20 kV，在放大倍數分別為10 000倍、20 000倍和40 000倍的視野下進行觀察。

1.3.3 大腸桿菌ATCC43889生物被膜生成能力的測定 參照LAJHAR等[20]的方法，并做適當修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株與1.3.1中獲得的3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有100 mL TSB培養基的250 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養至穩定期，備用。于無菌96孔微量酶標板中每孔加入TSB 100 μL，每個菌株3個平行，分別接種10 μL上述4種備用菌株，36℃靜置培養36 h后，吸出培養液，各孔加入200 μL緩沖液A清洗板孔2次，各孔加入100 μL甲醇固定15 min，吸出孔中的甲醇，自然風干；每孔加入100 μL的1%結晶紫溶液，染色5 min，吸出孔中的結晶紫染色液，用清水沖洗掉多余的染料；將酶標板倒置于濾紙上吸去殘余的水分，室溫下晾干；每孔加入100 μL 33%冰乙酸溶液，36℃保溫30 min，充分溶解結晶紫；在590 nm的波長處，以M200酶標儀分別測定各培養孔中溶液的OD值；以未接種菌的TSB培養液作為空白對照。本試驗將每種菌株測定的OD590值減去空白對照的OD590值來表示這種菌株的生物被膜生成能力，OD590值每增加0.001作為該種菌株的一個生物被膜生成活力單位（U），生物被膜生成活力越大表示該菌株的生物被膜生成能力越強。

1.3.4 大腸桿菌ATCC43889細胞膜脂肪酸組成的測定 參照王秋紅等[21]的方法，并作適當修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株及1.3.1中獲得的3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有100 mL TSB培養基的250 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養至穩定期，分別用0.85%的氯化鈉生理鹽水適當稀釋培養液，采用平板涂布的方法將上述4菌株稀釋培養液在TSA平板上培養24 h，分別用一次性接種環刮取大約40 mg濕重的菌體置于10 mL離心管中，加入1 mL皂化溶液I，100℃水浴30 min，快速冷卻后加入2 mL甲基化溶液Ⅱ，80℃水浴10 min，快速冷卻，加入1.25 mL萃取溶液Ⅲ，搖震10 min；吸棄下層溶液，在上層溶液中加入3 mL洗滌溶液Ⅳ，搖震10 min。靜置分層，移取上層液體于GC樣品管中待測定。

ATCC43889細胞膜脂肪酸組成進行氣相色譜分析條件為：進樣口溫度為270℃；檢測器溫度為280℃；載氣為氮氣，流速1.0 mL·min-1，不分流；尾吹氣為氫氣，流速25 mL·min-1；進樣量為1 μL；升溫程序：初溫100℃，保持13 min，10℃·min-1升到180℃，保持6 min，再以1℃·min-1升到200℃，保持20 min。ATCC43889細胞膜脂肪酸組成由37種混合脂肪酸標樣和氣相色譜-質譜聯用同時定性。氣質聯用測定條件為：氣相色譜-質譜聯用設備為GCMSQP2010 Ultra，色譜柱為HP-5，其他條件與氣相色譜分析一致。ATCC43889細胞膜脂肪酸組成利用面積百分比進行分析。

1.3.5 大腸桿菌ATCC43889細胞膜磷脂相變溫度的測定 參照CASADEI等[22]的方法，并作適當修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株與1.3.1中獲得的3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有200 mL TSB培養基的500 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養至穩定期，分別取800 mL的4種菌株培養液，離心（3 000×g，4℃，15 min）、收集菌體，用緩沖液B洗滌兩遍。將菌體沉淀重懸于7 mL緩沖液B中，加入20 mL甲醇和10 mL氯仿；搖床振蕩30 min；再加入10 mL氯仿和10 mL緩沖溶液B，搖床振蕩2 h。靜置分層，收集下層的氯仿層，自然揮發（10 h），取10 mg樣品置于DSC-8000差示掃描量熱儀中，-20℃預冷30 min，采用10℃·min-1的溫度梯度升溫，在-10—60℃范圍內測定ATCC43889細胞膜磷脂的相變溫度，以空白作為對照。

1.3.6 大腸桿菌ATCC43889菌體外膜蛋白的測定ATCC43889菌體外膜蛋白的提取：ATCC43889菌體外膜蛋白的提取參照JUNEJA等[23]的方法，并作適當修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株與3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有200 mL TSB培養基的500 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養18 h，離心（4℃，5 000×g，10 min）、收集菌體，用緩沖液C洗滌2次，重懸于緩沖液C中；用超聲波破碎菌體，處理15 min（15 s 1次，間隔10 s，300 W），離心（4℃，5 000×g，10 min），取上清液，離心（4℃，15 000×g，20 min）；用適量的2%TritionX-100溶解沉淀20—30 min，離心（4℃，15 000×g，20 min），用100 μL蒸餾水溶解沉淀，-20℃低溫保存備用。

ATCC43889菌體外膜蛋白的測定：采用BCA蛋白濃度測定試劑盒分別測定上述ATCC43889原始對照菌株與3種抗熱性菌株外膜蛋白濃度，以緩沖液A將此4種ATCC43889菌株外膜蛋白溶液稀釋至5 μg·μL-1，每種菌株取50 μL外膜蛋白溶液與50 μL的蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴8 min后，對其進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，凝膠經考馬斯亮藍R250染色2 h，待脫色完全電泳條帶清晰后，用全自動凝膠成像系統掃描，并采用Image Lab 4.0.1軟件進行圖像分析。

1.4 數據統計分析

數據處理通過SPSS（version 22.0，SPSS Inc.）軟件，數據間的多重比較采用Duncan新復極差法（SSR），數據結果以±SD來表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889個體形態的影響

由圖1可知，與原始對照菌株ATCC43889相比，經過加熱脅迫并轉接培養的菌株在掃描電子顯微鏡下形態變化明顯，原始對照菌株ATCC43889的個體形態呈典型的短桿狀或球狀，外形飽滿，表面光滑，大小均勻，比較一致（A1、B1、C1）；經50℃熱脅迫后，部分菌株由球狀體變為長桿狀（A2、B2、C2）；經60℃熱脅迫后的菌株個體形態較50℃熱脅迫處理的菌株細長（A3），其表面粗糙（B3）、凹凸、不平整（C3）；經70℃熱脅迫處理后大部分菌株變成了更細長的桿狀（A4），大量的菌株聚集在一起（B4），在較大的放大倍數下，菌體表面呈凸凹不平的無規則形態（C4）。上述研究結果表明，ATCC43889加熱脅迫株的個體形態與原始對照菌株相比差異顯著，這可能是ATCC43889在熱脅迫環境下生存的一種自我保護方式。

2.2 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889生物被膜生成能力的影響

細菌生物被膜是指當細菌粘附于接觸表面時，其分泌的多糖、蛋白質等物質將其自身包裹、圍繞其中形成了大量的細菌聚集膜樣物[24]。由圖2可知，隨著脅迫溫度的提高，熱脅迫轉接菌株的生物被膜生成活力增大，說明其生物被膜生成能力增強，與原始對照菌株相比，差異顯著（P＜0.05）；而60℃和70℃熱脅迫轉接株的生物被膜生成能力差異不顯著（P＞0.05），說明ATCC43889在不利的熱脅迫環境中可能是通過生成大量的生物被膜來增強其生存能力。有研究者認為[25]，幾乎所有的細菌都可形成生物被膜，其生成是細菌為適應環境變化及維持生命所發生的變化，生物被膜中的菌體被厚厚的多糖等包裹，在一定程度上增強了細菌對外界環境的抵抗力，是其進行自我保護的一種生存方式。

2.3 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889細胞膜脂肪酸組成的影響

為了探明50℃、60℃、70℃的溫度脅迫處理對ATCC43889細胞膜脂肪酸組成的影響，本研究以細胞膜脂肪酸中飽和脂肪酸（SFA）、不飽和脂肪酸（USFA）以及飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值（S/U）來作為評價指標。ATCC43889原始對照菌株及其分別經50℃、60℃、70℃各10次熱脅迫處理并轉接10次培養菌株的細胞膜中脂肪酸組成的相對含量見表1，由表1可知，ATCC43889原始對照菌株樣品中共檢測出14種脂肪酸，分別為C12:0、C13:0、C14:1、C16:0、C16:1、C17:0、C17:1、C18:1n9t、C18:1n9c、C18:2n6t、C18:3n3、C20:0、C21:0和C24:0。與原始對照菌株相比，分別經50℃、60℃、70℃熱脅迫處理并轉接10次培養的菌株，缺失了3種脂肪酸，分別為C18:1n9c、C18:3n3和C21:0，表明ATCC43889在遭遇到50℃、60℃、70℃熱脅迫條件時，此3種脂肪酸在細胞膜中不表達。同時發現，隨著熱脅迫溫度的升高，C13:0、C16:0和C17:0等飽和脂肪酸的含量在增加，而C14:1、C16:1、C17:1、C18:1n9t和C18:2n6t等不飽和脂肪酸的相對含量呈下降趨勢。本研究發現，隨著脅迫溫度的提高，ATCC43889細胞膜中飽和脂肪酸的總含量上升，不飽和脂肪酸的總含量下降，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值升高。S/U越高，表明菌體細胞膜流動性越弱，50℃、60℃、70℃熱脅迫菌株細胞膜流動性的降低有利于保證其在高溫環境下正常的流動性。ATCC43889抗熱性菌株細胞膜的流動性變化是為了更好地適應外界脅迫環境。

圖1 ATCC43889原始對照菌株及其熱脅迫株在掃描電鏡下的個體形態Fig.1 Individual morphology of ATCC43889 original control strain and heat-stressed strains under scanning electron microscope

2.4 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889細胞膜磷脂相變溫度的影響

差示掃描量熱法可用來研究細菌細胞膜磷脂的相變，測定細菌細胞膜磷脂物理狀態發生變化時吸收或釋放的能量。由圖3可知，在每一個熱能圖中均出現了一個峰，該峰值表示ATCC43889細胞膜磷脂的相變溫度，也即磷脂的熔點（Tm）；ATCC43889抗熱性菌株的熱脅迫溫度越高，其磷脂的熔點越高。在一定范圍內，細胞膜磷脂的熔點越低，膜的流動性越強；細胞膜磷脂的熔點越高，膜的流動性越弱。與對照組菌株相比，ATCC43889抗熱性菌株細胞膜流動性的降低有利于其抵抗不利于生存的高溫環境。

圖2 ATCC43889原始及其對照菌株分別經不同溫度熱脅迫處理并轉接培養其生物被膜生成能力Fig.2 Biofilm-forming ability of ATCC43889 original control strain and the strains which were treated with different temperatures,transfers and incubation, respectively

表1 ATCC43889原始對照菌株及其分別經不同溫度熱脅迫處理并轉接培養菌株的細胞膜脂肪酸相對含量Table 1 Membrane fatty acid composition of ATCC43889 original control strain and the strains which were treated with different temperatures, transfers and incubation, respectively

圖3 ATCC43889原始對照菌株及其分別經不同溫度熱脅迫處理并轉接培養的菌株細胞膜脂類提取物的差示掃描量熱圖譜Fig.3 DSC graph for lipids extracted from the whole cells of ATCC43889 original control strain and the strains which were treated with different temperatures, transfers and incubation, respectively

2.5 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889外膜蛋白表達的影響

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌細胞壁外壁層的主要結構成分，對維持細菌細胞結構的穩定，細胞物質的交換及細菌的致病性均起到非常重要的作用[26-27]。本研究所提取的ATCC43889原始對照菌株及其經50℃、60℃、70℃各10次熱脅迫處理并轉接10次培養后獲得的3種抗熱性菌株的外膜蛋白，經過SDS-PAGE電泳檢測后所得圖譜見圖4。可知，4種ATCC43889菌株外膜蛋白的分子質量主要分布在35—180 kD，但它們在構成和分布上存在著較大差異。與原始對照菌株相比，分別經50℃、60℃、70℃各10次熱脅迫處理并轉接10次培養的3種菌株外膜蛋白表達有明顯的差異。隨著脅迫溫度的升高，分子質量在63 kD和75 kD附近的外膜蛋白條帶顏色逐漸變深，說明這兩種分子量附近的外膜蛋白表達量明顯提高；分別經60℃、70℃各10次熱脅迫處理并轉接10次培養的2種抗熱性菌株，在48—75 kD增加了特異條帶，說明ATCC43889在這種高溫脅迫下產生了某些抗熱性蛋白，這些蛋白可能是熱脅迫下與應激反應有關的熱激蛋白。上述研究結果表明，經50℃、60℃和70℃熱脅迫，可誘導ATCC43889一些外膜蛋白表達量的增加和產生熱激蛋白。由此推測，由于這些蛋白表達的變化，可及時修復高溫對其造成的分子損傷，導致ATCC43889熱脅迫菌株中蛋白質合成、能量代謝、DNA復制能夠正常進行。最終使ATCC43889抗熱性菌株能夠在50℃、60℃、70℃高溫環境下生存下來；ATCC43889在50℃、60℃、70℃熱脅迫作用下，菌體能夠啟動某些相關基因，以此來表達相關蛋白而達到抗熱的目的。

圖4 ATCC43889原始對照菌株及其分別經不同溫度熱脅迫并轉接培養的3種菌株外膜蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of outer membrane proteins of ATCC43889 original control strain and the strains which were treated with different temperatures, transfers and incubation,respectively

3 討論

3.1 大腸桿菌ATCC43889個體形態變化與其抗熱性的關系

劉艷霞等[28]采用不同濃度的維生素B6和維生素E煙酸酯藥敏紙片聯合影響雙歧桿菌生長，通過革蘭氏染色和原子力顯微鏡掃描觀察其形態的變化。研究發現，不同濃度維生素B6和維生素E煙酸酯藥敏紙片聯合脅迫可誘導雙歧桿菌個體形態從短桿狀變為絲狀體。舒文婷[29]也發現，與標準菌株相比，經亞胺培南藥物作用的銅綠假單胞菌菌株個體形態變長，主要原因是亞胺培南藥物作用使其耐藥基因表達導致菌體變長。本研究發現，與原始對照菌株相比，分別經50℃、60℃和70℃各10次熱脅迫處理并轉接10次培養得到的3種抗熱性ATCC43889菌株的個體形態變長，表明高溫作用對ATCC43889的個體形態產生較大影響，形態的變長可能使其對熱產生抗性。這種菌體形態的變化常常伴隨著正常細菌的自溶，它們可能是不利環境的產物，也可能是對這種不利環境有抵抗力的個體，這可能是增加菌體存活穩定性的途徑之一[30]。

3.2 大腸桿菌ATCC43889生物被膜生成能力與其抗熱性的關系

生物被膜的形成是細菌為了適應生存環境而采取的一種策略。微生物易粘附于含有機物質的食品加工設備表面，形成生物被膜，而生物被膜中的細菌形態結構、生理、生化特性對外界不利環境（pH、溫度和滲透壓等）的敏感性皆比普通細菌強[31]。高璐等[32]研究了不同脅迫條件對副溶血性弧菌生物學特性的影響，該菌經低滲透壓、低pH和高溫條件下適應后傳代的菌株，其生物被膜生成能力與原始對照菌株相比均增強。本研究也發現，與原始對照菌株相比，3種抗熱性ATCC43889菌株生物被膜生成能力明顯增強。

3.3 大腸桿菌ATCC43889細胞膜脂肪酸組成與其抗熱性的關系

細菌細胞膜是磷脂雙分子層，流動的脂質雙分子層是生物膜結構的基本特征，適宜的流動性是保證細菌處于正常生理狀態的重要條件。本研究發現，3種抗熱性ATCC43889菌株細胞膜脂肪酸組成發生了變化，隨著熱脅迫溫度的升高，細胞膜中飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量下降，這與有關文獻的報道一致[33]。此外，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率可以反映細胞膜的流動性。本研究中，脅迫溫度升高，飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量降低，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率增加，細胞膜流動性降低，有利于其在高溫下保持正常的流動性。LI等[34]研究了冷、鹽和堿等應激處理對保加利亞乳桿菌細胞膜組成和凍干存活率的影響，結果發現，應激處理使保加利亞乳桿菌對凍干耐受性增強，細胞膜中生成新物質環丙烷脂肪酸（CFA）。研究證明，環丙烷脂肪酸的生成可提高細胞膜的穩定性，限制酰基鏈的移動，改變細胞膜的流動性[35]。在本研究中，3種抗熱性ATCC43889菌株中是否也合成類似CFA的物質來抵抗不利高溫的環境？相關工作有待進一步研究。

3.4 大腸桿菌ATCC43889細胞膜磷脂相變溫度與其抗熱性的關系

磷脂分子的相變是指在某個溫度點時，細胞膜磷脂分子層中脂肪酰鏈從全反式的高度有序剛性、致密的排列狀態突然向高度無序的柔軟、疏松排列狀態的轉變過程。這種轉變過程不是漸進的，而是在某個溫度時發生突變，該臨界溫度Tm稱之為相變溫度[36]。細胞膜磷脂分子相變溫度Tm受脂肪酰鏈飽和程度的影響，飽和度越高，Tm越高。有研究表明，微生物為了適應環境溫度的變化，通過改變脂肪酸鏈的不飽和度、鏈的長短以及支鏈與直鏈比來保持正常細胞膜的流動性，使其與外界進行正常的物質與能量交換[37]，這與本研究的結論基本一致。本研究發現，3種抗熱性菌株細胞膜中飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量下降，Tm升高，膜流動性降低；脅迫溫度越高，Tm也越高，膜流動性越弱，有利于其在高溫下保持正常的流動性。細胞膜由磷脂雙分子層組成，除了起到結構和屏障作用外，還與細胞內外信號轉導、交流和能量產生有關。細胞膜在細菌的脅迫抵抗中起重要作用，它能夠隨環境條件的變化而發生改變，通過控制流動性來維持菌體的正常生理活動，與其生命活動相協調，這種適應性變化可以對細菌的生存起到保護作用。

3.5 大腸桿菌ATCC43889熱激蛋白與其抗熱性的關系

熱激蛋白能夠防止蛋白質變性或者幫助己變性的蛋白重新折疊恢復正常的構象，避免熱脅迫引起的傷害，對高溫脅迫條件下細菌的生存起著至關重要的作用。熱激蛋白一旦形成，迅速應對外界脅迫環境表現出的抗熱性，是生物對熱脅迫適應的必需組成成分。LEYER等[38]研究酸適應脅迫誘導沙門氏菌對熱、鹽、表面活性劑等的交叉保護作用，結果發現，酸適應可誘導沙門氏菌合成特殊的外膜蛋白，從而增強了其對外界不利環境的抵抗力。本研究發現，3種抗熱性ATCC43889菌株某些外膜蛋白表達量和組成也發生變化，這些變化可能是高溫脅迫下ATCC43889合成的與熱激反應相關的蛋白質。至于這些外膜蛋白到底是通過改變哪些代謝路徑來幫助菌體抵抗不利的環境，還有待進一步研究。

4 結論

ATCC43889分別經50℃、60℃和70℃各10次熱脅迫處理并轉接10次培養后，產生了應激反應，其個體形態、生物被膜生成能力、膜脂肪酸組成、膜流動性和外膜蛋白表達均發生了變化。隨著熱脅迫溫度的升高，其個體形態變長，生物被膜生成能力增強，飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量下降，細胞膜流動性減弱，一些外膜蛋白表達量提高、表達種類增加，菌株耐熱性增強。綜上，ATCC43889在遭遇熱脅迫環境時，會通過改變自身個體形態、增強生物被膜生成能力、調整膜脂肪酸組成和膜流動性及外膜蛋白表達來適應不利環境，提高其生存能力。