D-異抗壞血酸鈉抑制臘腸脂肪和蛋白質氧化

尚校蘭，陳占兄，單新童，李妍，劉瑤瑤

（1.廊坊師范學院生命科學學院，河北廊坊065000；2.河北省動物多樣性重點實驗室，河北廊坊065000）

臘腸是我國著名的傳統風味肉制品之一，深受消費者的喜愛。目前市面上最常見的臘腸有3 種，二八腸（肥瘦質量比 2 ∶8）、三七腸（肥瘦質量比 3 ∶7）和四六腸（肥瘦質量比4 ∶6）。臘腸中脂肪對產品品質起著重要的作用，臘腸的特征風味主要來自于脂質的降解和氧化[1]，適度的脂質氧化有利于臘腸特征風味的形成，但是過度的脂肪氧化使臘腸產生哈喇味[2]，嚴重影響臘腸的品質，因此如何控制臘腸中脂肪的過度氧化成為亟待解決的關鍵技術問題。

趙謀明等[3]研究表明，真空包裝和抗氧化劑可以明顯抑制臘腸脂質氧化，復配抗氧化劑、沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）和特丁基對苯二酚（tert butyl hydroquinone，TBHQ）的抗氧化效果最佳。徐勇等[4]研究抗壞血酸（ascorbic acid，VC）和生育酚（tocopherol，VE）對廣式臘腸過氧化值以及色澤的影響，認為同時使用VC和VE能有效抑制廣式臘腸過氧化值的升高，并對臘腸的色澤具有較好的保護作用。

抗壞血酸是一種常用的抗氧化劑，它可以除去食品中的氧氣（如3.5 mg 抗壞血酸能清除1 cm3的頂空氧）；此外，抗壞血酸具有螯合金屬的能力，抗壞血酸和金屬形成的配合物的抗氧化活性低于單獨使用抗壞血酸的抗氧化活性[5]。

異抗壞血酸鈉（sodium erythorbate）是抗壞血酸鈉的旋光異構體，它沒有抗壞血酸鈉的生理活性，但其具有較強的抗氧化活性以及僅為抗壞血酸鈉1/3 的生產成本，因此被廣泛用于肉制品的生產中。根據食品添加劑使用標準GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》，在食品加工中可以根據需要決定異抗壞血酸鈉添加量[6]。關于異抗壞血酸鈉在肉制品中的應用，很多學者進行了報道。徐海祥等[7]研究不同含量異抗壞血酸鈉對臘腸過氧化值的影響，結果表明650 mg/kg 異抗壞血酸鈉能使臘腸的過氧化值降低90%左右；Choe 等[8]發現在 12 d 的貯藏期內，和未添加異抗壞血酸鈉的豬肉餅相比，添加異抗壞血酸鈉能有效地抑制豬肉餅的過氧化值和TBARS 值的升高。

關于抗氧化劑對肉制品中蛋白質氧化的影響，賈娜等[9]發現沒食子酸能抑制豬肉肌原纖維蛋白氧化；許鵬[10]發現賴氨酸和精氨酸能夠有效抑制乳化香腸貯藏期間脂肪氧化和蛋白質氧化程度；于海等[11]使用二丁基羥基甲苯（dibutyl hydroxytoluene, BHT）有效抑制了中式香腸的脂肪氧化和蛋白質氧化。目前，大多數學者的研究主要集中在臘腸貯藏過程中的研究，而對于臘腸加工過程中的研究較少報道，而D-異抗壞血酸鈉在臘腸加工過程中對脂肪氧化和蛋白質氧化的相關性分析，尚未見報道。本文研究了D-異抗壞血酸鈉對臘腸加工過程中脂肪氧化和蛋白質氧化指標的變化，并對其相關性進行了分析，為提高臘腸的品質奠定了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬瘦肉、豬肥膘、鹽、綿白糖、生抽、酒：市售；天然羊腸衣：河南省許昌市鄢陵縣鑫鑫腸衣有限公司。

5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5,5'-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：Sigma 公司；三（羥甲基）氨基甲 烷 [Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、2，4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、硝酸鈉、石油醚、硫代硫酸鈉、碘化鉀、三氯乙酸、乙酸乙酯、乙醇、鹽酸胍：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D-異抗壞血酸鈉（食品級）：江西省德興市百勤異VC鈉有限公司。

1.2 儀器與設備

IKA T18 高速勻漿機：德國IKA 公司；CTH2050R冷凍離心機：美國Thermo Fisher 科技有限公司；SP-2102UV 紫外-可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；R202-2 旋轉蒸發儀：德國海道夫公司。

1.3 方法

1.3.1 臘腸的制作

原料豬肉切成8 mm～10 mm 的肉丁，肥瘦質量比為 2 ∶8 混勻，按 100 g 豬肉，2 g 鹽，5 g 糖，5 g 生抽，3 g酒，10 mg 硝酸鈉，15 g 水的比例加入配料，攪拌混勻。向上述混合物中分別加入0%、0.05%、0.1%的D-異抗壞血酸鈉，攪拌均勻后按每根50 g 灌腸。灌腸后扎孔，置于 50 ℃烘箱內，分別測定 0、5、10、15、20、30、48 h以及72 h 下臘腸的以下各指標變化情況。

1.3.2 過氧化值的測定

根據 AOAC 的方法（AOAC,965.33）進行測定[12]。

1.3.3 TBARS 值的測定

根據GB5009.181-2016《食品安全國家標準食品中丙二醛的測定》進行測定[13]。

1.3.4 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參照Park 等[14]的方法，略作修改。取50 g 臘腸，剔除脂肪，稱取10 g 加入5 倍0.05 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0），混勻，9 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清液，重復洗滌一次。沉淀加入4 倍0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，10 000 r/min 勻漿90 s。過濾結締組織，靜置30 min 以充分溶解蛋白，9 000 r/min 4 ℃離心20 min，所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液。肌原纖維蛋白濃度采用雙縮脲法測定，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準蛋白。

1.3.5 肌原纖維蛋白羰基含量的測定

參考李學鵬等的測定方法[15]，取1 mL 濃度為5 mg/mL 的蛋白溶液放入塑料離心管中，加入1 mL 10 mmol/L 的 DNPH（用 2 mol/L HCl 配制），25 ℃下黑暗靜置1 h（每15 min，振蕩 1 次），添加 3 mL 20%三氯乙酸后10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用體積比為1 ∶1 的乙酸乙酯-乙醇洗沉淀3 次后，加5 mL 6 mol/L 鹽酸胍溶液（用 20 mmol/L，pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液配制），37 ℃保溫 15 min 溶解沉淀，10 000 r/min離心3 min 除去不溶物質，所得溶液在370 nm 波長處測定吸光度。使用分子吸光系數22 000 L/（mol·cm）計算每克蛋白中羰基含量μmol。

1.3.6 肌原纖維蛋白總巰基含量的測定

總巰基（-SH）含量測定參考Benjakul 等的方法[16]。1.0 mL 肌原纖維蛋白溶液（0.4 %）中加入9 mL 含有8 mol/L 尿素、2%SDS 和 10 mmol/L EDTA 的 0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8）0.4 mL，4 mL 混合液中加入0.4 mL 含有 0.1 % DTNB 的 0.2 mol/L Tris-HC1（pH 8.0）緩沖液，40 ℃反應 25 min，于 412 nm 處測定吸光值。空白樣品使用0.6 mol/L KCl 替代蛋白測定。巰基含量使用消光系數13 600 L/（mol·cm）進行計算。

1.3.7 數據處理

采用SPSS 16.0 和Excel 2016 軟件對數據進行分析。n=3，P＜0.05 具有顯著性差異，P＜0.01 具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 D-異抗壞血酸鈉對臘腸加工過程中過氧化值的影響

過氧化值（peroxide value，PV）主要是用來評價脂質氧化形成初級氧化產物-氫過氧化物的量，臘腸加工過程中脂肪氧化指標見表1。

由表1 可知，不添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，在0～10 h，過氧化值呈顯著（P＜0.05）上升趨勢，15 h～72 h呈下降趨勢，可能是因為10 h 后之前積累的氫過氧化物變為小分子物質，同時使TBARS 值升高，這和孫為正的研究一致[17]。Choe 等[8]向豬肉中添加了0.05%的抗壞血酸，發現添加抗壞血酸會降低豬肉的過氧化值，并且在12 d 的儲藏過程中，第1 天過氧化值最低，第4 天升高，后期呈現繼續升高趨勢，但和未添加抗壞血酸的相比，相同的時間點下，添加抗壞血酸的豬肉比不添加的過氧化值要低，這說明抗壞血酸在脂肪的氧化過程中，起到了持續的抗氧化作用。本研究發現，在0～10 h，添加0.05%D-異抗壞血酸鈉會使臘腸過氧化值降低但不顯著（P＞0.05），15 h～72 h，臘腸的過氧化值有所升高但也不顯著（P＞0.05）。添加0.1%D-異抗壞血酸鈉的臘腸過氧化值和添加0.05%D-異抗壞血酸鈉臘腸的過氧化值變化趨勢類似，但由于D-異抗壞血酸鈉量的增多，其過氧化值比0.05%的略低。

2.2 D-異抗壞血酸鈉對臘腸加工過程中TBARS的影響

肉制品的二級氧化通常通過測定TBARS 值來反映，而TBARS 值是以丙二醛含量的多少來表示。Ferreira 等[18]認為丙二醛濃度超過 2 mg/kg～3 mg/kg 時，肉品才會出現不良風味，臘腸加工過程中蛋白質氧化指標見表1。

表1 可知，所有臘腸的TBARS 值都沒超過2 mg/kg，未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，隨著加工時間的延長，TBARS 值顯著性升高（P＜0.05）。添加 0.05%D-異抗壞血酸鈉和0.1%D-異抗壞血酸鈉的臘腸，TBARS值也升高，但沒有未添加的顯著。這說明D-異抗壞血酸鈉在抑制脂肪氧化小分子化合物的生成上，起到了一定的作用。

2.3 D-異抗壞血酸鈉對臘腸加工過程中肌原纖維蛋白羰基含量的影響

未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，隨著加工時間的延長，肌原纖維蛋白羰基含量呈現升高趨勢（P＜0.05）。在各個時間點下，均發現添加D-異抗壞血酸鈉能使羰基含量顯著下降。0、5、10、15、20 h 以及 48 h 時，添加0.05 %D-異抗壞血酸鈉和添加0.1 %D-異抗壞血酸鈉的臘腸的羰基含量差異不顯著（P＞0.05），而30 h和72 h 下，添加0.05 %D-異抗壞血酸鈉和添加0.1 %D-異抗壞血酸鈉的臘腸的羰基含量具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 D-異抗壞血酸鈉對臘腸加工過程中肌原纖維蛋白巰基含量的影響

未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，巰基含量隨著加工時間延長呈顯著降低趨勢（P＜0.05），這和孫為正的研究結果一致[17]，是因為肌原纖維空間結構受到氧化因子的破壞，導致內部易氧性疏基的暴露[19]。添加D-異抗壞血酸鈉后，巰基含量也降低，可能是由于D-異抗壞血酸鈉中的某個基團和巰基發生反應（羥基化合物），從而導致其含量降低。但從30 h 開始，添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸巰基含量比未加D-異抗壞血酸鈉的高，這可能是由于隨著時間延長，D-異抗壞血酸鈉的抗氧化能力突顯，其發揮的抗氧化作用強于合成羥基化合物的能力，因此巰基含量升高。

2.5 臘腸過氧化值、TBARS值、肌原纖維蛋白羰基值、巰基值相關性分析

李夢琪[20]研究了羊肉在凍藏過程中脂肪氧化和蛋白質氧化之間的相關性關系，得出羊肉中脂肪氧化在一定程度上能夠促進肌原纖維蛋白羰基含量的增加、巰基的流失以及表面疏水性的增加。本文研究了不同D-異抗壞血酸鈉添加量下臘腸過氧化值、TBARS 值和肌原纖維蛋白羰基值、巰基值的相關性（表2）以及不同加工時間下臘腸過氧化值、TBARS 值和肌原纖維蛋白羰基值、巰基值的相關性（表3）。

表2 不同D-異抗壞血酸鈉添加量下臘腸過氧化值、TBARS 值和肌原纖維蛋白羰基值、巰基值相關性分析Table 2 Correlation between PV，TBARS and carbonyl value，sulfhydryl value of different concentrations of D-sodium erythorbate

表3 不同加工時間下臘腸過氧化值、TBARS 值和肌原纖維蛋白羰基值、巰基值相關性分析Table 3 Correlation between PV，TBARS and carbonyl value，sulfhydryl value of different processing time

由表2 可知，未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關（P＜0.01），與巰基值呈極顯著負相關（P＜0.01）；添加 0.05%D-異抗壞血酸鈉的臘腸，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關（P＜0.01），與巰基值呈顯著負相關（P＜0.01）；添加0.1%D-異抗壞血酸鈉的臘腸，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關（P＜0.01），而與巰基值無相關性。

由表3 可知，15 h 時，肌原纖維蛋白羰基值、巰基值與過氧化值呈顯著正相關（P＜0.05）；0 h 時，巰基值與 TBARS 呈極顯著正相關（P＜0.05），72 h 時，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關（P＜0.05）。

3 結論

添加D-異抗壞血酸鈉能減緩脂肪氧化和蛋白質氧化的速度，臘腸加工初期（0～10 h）過氧化值升高可能是由于被氧化形成氫過氧化物，后期（15 h～72 h）TBARS 值升高可能是由于形成小分子風味物質。未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，巰基含量隨著加工時間延長呈顯著降低趨勢（P＜0.05），添加D-異抗壞血酸鈉后，巰基含量也降低，可能是由于D-異抗壞血酸鈉中的某個基團和巰基發生反應（羥基化合物），從而導致其含量降低。不同D-異抗壞血酸鈉添加量下，蛋白質氧化指標和TBARS 值具有很大的相關性；而不同加工時間下，相關性較小，15 h 時，肌原纖維蛋白羰基值、巰基值與過氧化值呈顯著正相關（P＜0.05），0 h 時，巰基值與 TBARS 呈極顯著正相關（P＜0.05），72 h 時，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關（P＜0.05）。