超臨界流體制粒在類胡蘿卜素微粒中的應用

張亮，韋陽，高彥祥

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

超臨界流體（supercritical fluid，SF）是一種溫度和壓力高于其臨界溫度（critical temperature，TC）和臨界壓力（critical pressure，PC）的流體溶劑，在該溫度和壓力下，它的性質介于液體（如密度和高溶解能力）和氣體（如低黏度、高擴散率和高傳質速率）之間。許多化合物可以以超臨界的狀態存在，如二氧化碳、水、丙烷、氮等。其中，超臨界二氧化碳（supercritical carbon dioxide，SC-CO2）以價格低廉、超臨界狀態溫和易達到（TC=31.1 ℃，PC=7.38 MPa）等優點成為應用最普遍的超臨界流體[1-3]。超臨界流體制粒技術就是將超臨界流體作為溶劑或抗溶劑，經過一系列的物理反應，制得目標物質微細顆粒的新興技術。相比于傳統的制粒方法（如乳化蒸發法、噴霧干燥法、研磨法、冷凍干燥法），超臨界流體制粒技術無需經過剪切、均質等高能處理，也無需使用高溫使樣品溶解，且制得的微粒粒徑小而均勻，從而很大程度上解決了傳統方法制備微細顆粒所存在的得率低、不均一、活性差等難題。

類胡蘿卜素（carotenoids）是一類對人體有諸多重要生理功能的天然色素的總稱，其廣泛存在于一些動植物和藻類的黃色、紅色或橙色的色素中。類胡蘿卜素是由8 個頭尾相連的異戊二烯基團組成的化合物，其典型化學結構如圖1 所示[4]。

圖1 類胡蘿卜素的典型化學結構Fig.1 Typical chemical structure of carotenoid

類胡蘿卜素種類眾多，常見的類胡蘿卜素有番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和蝦青素等。類胡蘿卜素是食品工業中最常用的食用天然色素，也是功能保健品中最常添加的一類功能因子。但由于其自身理化特性的諸多缺點，如水溶性差、生物利用度低、在光和熱條件下易發生降解等，大大制約了它的充分利用[4-5]。而運用超臨界流體制粒技術，在溫和的操作環境下將其微粒化或制成微膠囊，將顯著提高其生物利用度、溶解性和穩定性，同時也將進一步擴大其在食品及其他領域的應用。

1 超臨界流體制粒技術種類及原理

根據超臨界流體在各反應體系中的作用不同（作為溶劑、抗溶劑、溶質），可將超臨界流體制粒技術分為三大類：快速膨脹法（rapid expansion of supercritical solution，RESS）、抗溶劑法（supercritical anti solvent，SAS）、氣體過飽和溶液法（particles from gas saturated solutions，PGSS）[6]。

1.1 RESS

RESS 是超臨界流體制粒技術中的一個重要分支，適用于與超臨界CO2流體互溶的物質的微細化。利用該方法制備類胡蘿卜素微粒，通常先調節裝置的溫度和壓力至CO2的超臨界態，而后將未經處理的類胡蘿卜素樣品溶于超臨界CO2流體中（由于類胡蘿卜素在超臨界CO2中溶解度較小，需加入甲醇或乙醇等夾帶劑以增強其溶解度），得到飽和溶液后通過特定結構的噴嘴快速噴射到常壓膨脹室，再經過旋風分離器收集粒徑大小合適的微粒。在此過程中，溫度和壓力的驟降使得溶質達到極高的過飽和度，進而析出形成大量微核，微核迅速生長形成大小均一的微米甚至納米級的微粒[4，6-8]。常見的操作裝置如圖2 所示。

圖2 RESS 經典裝置圖Fig.2 Classic diagram of RESS installation

如今隨著技術的不斷發展，在RESS 的原有設計基礎上，涌現出一些效果更好、能力更加出色的RESS改進版本，如固體共溶劑超臨界溶液快速膨脹（rapid expansion of supercritical solution with solid cosolvent，RESS-SC）[9]、超聲傳質增強式超臨界溶液快速膨脹（rapid expansion of supercritical solution with enhanced mass transfer by ultrasonic，RESS-EMU）[10]和超臨界溶液快速膨脹至液體溶劑（rapid expansion of supercritical solution into liquid solvents，RESOLV）[11]等。這些改進版本分別從增加溶質在超臨界流體中的溶解度、防止微粒之間發生團聚和簡化微粒的收集等方面著手，顯著改善了RESS 的制粒效果并提高了其制粒能力。

1.2 SAS

SAS 法制備超細微粒最初是由Gallagher 等[12]在1989 年提出的，該法適用在不溶于超臨界CO2流體，而溶于有機試劑的物質的微細化。其基本原理也是通過降低溶質在體系中的溶解度來實現微細化的，但具體操作和RESS 相比還有很多不同。制備微粒時，先開啟CO2高壓泵，往沉降釜中通入一定溫度和壓力的超臨界CO2流體，持續通入一段時間后，再打入一定量的溶劑（乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮等）以獲得沉降過程中流動相的均勻穩定體系。之后將類胡蘿卜素樣品溶解在某一溶劑中形成溶液，由噴頭和超臨界CO2流體一起噴出，此時超臨界CO2流體和溶劑之間相互擴散，使原溶液迅速達到過飽和，從而使溶質從溶液中結晶析出沉降，而后繼續通入超臨界CO2流體以洗凈殘留在微粒表面上的有機試劑。洗凈后，打開旋風分離器進行微粒的篩選和收集[4，6，13-15]。SAS 的裝置如圖3所示[14]。

圖3 SAS 裝置示意圖Fig.3 Diagram of SAS installation

根據實際操作的過程不同還可以將SAS 法細分為：氣體抗溶劑法（gas anti-solvent，GAS）、氣溶膠溶劑萃取體系法（aerosol solvent extraction systems，ASES）、超臨界流體提高溶液分散法（solution enhanced dispersion by supercritical fluids，SEDS）[16-18]等等。這些方法都利用了超臨界CO2流體與溶劑互溶的特性，使目標物質在溶液中的溶解度降低，進而導致溶質的析出。此外，還有一種以SAS 為基礎衍生出的方法，稱為超臨界流體乳液萃取法（supercritical fluid extraction from an emulsion，SFEE），該制粒方法是傳統乳化沉淀法與超臨界反溶劑法的結合體，它能制得比SAS 法粒徑更小的顆粒，且可以從很大程度上緩解顆粒聚集的問題[19]。

1.3 PGSS

PGSS 法的操作原理和微粒結晶機理與SAS 法極為相似。它是將超臨界CO2流體（廣義理解為氣體）當作溶質溶入液體溶液（熔融的脂類、水溶液、有機溶液等）中形成飽和溶液，溶有超臨界CO2流體的飽和溶液經過噴嘴快速釋放，由于壓力驟降和氣體膨脹，目標物質達到過飽和，最終形成微粒。在實際操作中，為了獲得性狀良好的微粒，防止體系中氣-液-固三相平衡遭到破壞，PGSS 一般不適用于在超臨界流體中具有較大溶解度的物質顆粒的制備[4，6，20-21]。PGSS 的裝置如圖 4 所示[22]。

圖4 PGSS 裝置示意圖Fig.4 Diagram of PGSS installation

PGSS 裝置由CO2氣瓶、氣體壓縮泵、混合器、噴嘴、流量計、收集室等部件構成。制備類胡蘿卜素微粒時，由于類胡蘿卜素在高溫下極易降解，所以不能將類胡蘿卜素樣品加熱至熔融態，應先將其溶解在有機試劑中，再往溶液中通入超臨界CO2流體至溶液飽和，在高壓攪拌室的高速攪拌下，經噴頭快速噴出形成微粒，該過程與 SAS 處理過程基本相同[6，20，22]。除了使用超臨界CO2流體，趙亞冬[23]自主開發了一種超臨界N2輔助的PGSS 微?；夹g，通過使用該技術可以順利制備出月桂酸、肉豆蔻酸和聚乙二醇顆粒。

2 超臨界流體制粒技術在制備類胡蘿卜素微粒中的應用

近些年來，眾多研究者利用超臨界流體制粒技術將β-胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素、胭脂素等類胡蘿卜素進行造粒或包埋處理，對處理過程中的操作參數（如壓力、溫度、溶液流速、芯壁比等）進行了優化，并對制得的產品進行了理化性質的表征（如粒徑、包埋率、負載率、差示掃描量熱、掃描電鏡等），詳見表1。

可見，RESS 法制得的微粒粒徑更小，包埋率更高，且還能制備脂質體、微乳液等其它形式的類胡蘿卜素傳遞體系，但類胡蘿卜素在SC-CO2中溶解度較差，加入共溶劑雖可提高其溶解度，但效果仍不是很理想，這就大大限制了RESS 在類胡蘿卜素微?；矫娴膽?；使用SAS 法制備類胡蘿卜素微粒的相關研究較多，大多集中在微膠囊的制備和表征方面。由于SAS 法使用了有機溶劑，因此能夠完全的溶解類胡蘿卜素，且制得的微粒粒徑大小適中，包埋良好，性質穩定，所以用該法制備類胡蘿卜素微粒以及制備其它脂溶性功能因子微粒具有廣闊的應用前景；PGSS 法和SAS 法原理相似，相關研究集中在操作過程中參數的優化以及微膠囊壁材的選擇方面，不難看出，使用PGSS 法制得的微

粒粒徑較大，這可能與溶液中溶入過多的SC-CO2有關。

表1 超臨界流體制粒技術在類胡蘿卜素中的應用Table 1 Application of supercritical fluid granulation technique in carotenoids

3 影響類胡蘿卜素微粒制備的主要因素

超臨界流體制粒過程中，各種試驗參數（如溫度、壓力、溶液濃度和流速等）都會對制備的微粒的粒徑、形貌、包埋率等理化性質造成影響。雖然不同的制粒方法、不同的反應體系對微粒的影響結果不盡相同，但其中某一個因素在特定的環境下所呈現出的結果仍有規律可言。表2 總結了近些年文獻中幾個主要因素對微粒粒徑的影響。

3.1 溫度

溫度是影響超臨界制粒產品的一個重要因素。溫度過高，易使類胡蘿卜素發生降解，導致產品負載率下降，活性不高；溫度過低，類胡蘿卜素無法完全溶解在SC-CO2或有機溶劑中，導致產品結晶明顯，顆粒較大。它主要影響產品的粒徑大小。在操作過程中，一般將溫度控制在35 ℃至45 ℃之間。由表2 不難看出，操作溫度在合理范圍內不斷上升，會導致產品粒徑增大，這是因為溶液溫度升高會導致SC-CO2或有機溶劑密度降低以及溶質的蒸汽壓升高，進而導致SC-CO2或有機溶劑溶解強度降低以及溶質的溶解度增加，二者共同作用導致溶液的過飽和度降低，微粒的成核速率降低，生長速率增加，最后導致微粒粒徑的增大[4，8，40]。

表2 制粒過程中參數變量對微粒粒徑的影響Table 2 Influence of parameter variables on particle size in granulation processes

但也有例外，比如Zhao Lisha 等[26]用RESS 法制備β-胡蘿卜素時發現，當操作溫度從40 ℃上升到53 ℃時，微粒的平均粒徑減小，當操作溫度從53 ℃上升到65 ℃時，其平均粒徑又增大了，這是因為溫度從40 ℃升高53 ℃時，SC-CO2或有機溶劑溶解強度降低導致溶質的溶解度降低占主導作用，從而使溶液的過飽和度增加，獲得較高的成核速率，使微粒粒徑減??；而當溫度繼續升高至65 ℃時，溶質的蒸氣壓升高導致溶質的溶解度增加占主導作用，使溶液過飽和度減小，微粒的生長速率更快，得到了粒徑更大的微粒。Hazuki Neromea 等[38]在用SAS 法制備番茄紅素微粒時也出現過類似的情況。

3.2 壓力

一般情況下，溶液壓力的變化主要影響物質在SC-CO2或有機溶劑中溶解度的大小，進而對產品的粒徑大小和形貌造成影響。由表2 可知，壓力的升高會使微粒粒徑減小，這是因為壓力升高致使溶液的膨脹度增加，進而使溶液的過飽和度增加，使微粒成核和生長速率同時增加，其中微粒經歷的成核階段時間較長，經歷的生長階段時間較短，故得到了粒徑更小的微粒。Guijin Liu 等[32]使用SAS 法制備蝦青素微粒，在其它條件維持不變的情況下，將壓力從8 MPa 升高到12 MPa，使微粒粒徑從 1.23 μm 降低到 954.6 nm，且微粒呈統一的球狀排布；Alessia Di 等[39]也使用同樣的方法得到了相似的結論。但也有少量的研究結果不存在這樣的規律，例如Zhao Lisha 等[26]以及Kahori Kaga 等[34]的研究結果就不符合上述的規律，這可能是因為繼續增加壓力使活性物質能更快的分散于SC-CO2中，以得到更高的溶解度，進而導致溶液的過飽和度下降，得到粒徑較大的顆粒。此外，試驗中出現的樹枝狀、葉片狀、不規則狀的顆?？赡苁怯捎谠囼瀰?、處理條件或噴嘴結構的不同所致。

3.3 SC-CO2和溶液流速

在RESS 和PGSS 中，由于它們的制粒流程與SAS不同，只存在一個最終溶液的流速，且該流速對最終產品的性質影響較小，所以關于溶液流速對它們產品的影響方面研究較少。而在SAS 中，SC-CO2和溶液二者的流速大小關系對最終產品有著不可忽略的影響。Hazuki Neromea 等[38]在其它條件不變的情況下（溫度：50 ℃，壓力：14 MPa），改變SC-CO2和溶液的流速大小，探究了SC-CO2和溶液二者流速之間的大小關系對番茄紅素微粒粒徑和形貌的影響。當在高溶液流速和低SC-CO2流速下，形成了平均粒徑為116 nm 的粗糙凝集顆粒；在低溶液流速下，得到了平均粒徑更小（38 nm）的顆粒。這是因為當SC-CO2流速較大時，使溶液的湍流擾動現象更為明顯，溶質與周圍環境的混合效果較好，在短時間內使溶液的過飽和度更高，所以得到粒徑更小的微粒[38，42-43]。此外，SC-CO2和溶液流速關系也會對微粒的包埋率造成影響。Mezzomo N 等[40]研究了SC-CO2和溶液流速的相互關系對蝦青素微膠囊包埋率的影響，結果表明溶液流速越大，包埋效果越差，可能是因為有機溶劑的量比SC-CO2的量大，以至于超過了SC-CO2飽和極限，阻礙顆粒的形成。

3.4 物質濃度

Miguel.F 等[34]在用SAS 法制備番茄紅素微粒時，保持溫度、壓力等條件不變，改變番茄紅素濃度大?。?25、250、500 mg/L），發現制得的微粒粒徑大小分別為7、10、20 μm。這是因為當物質濃度較低時，在液滴膨脹的過程中溶液形成過飽和，使溶質沉淀析出的時間相對較晚，顆粒主要經歷的是成核過程，此時形成粒徑較小的顆粒；相反，當物質濃度較高時，濃溶液中物質的析出在液滴膨脹過程中出現的時間較早，顆粒不但經歷了成核階段，而且又經歷了一段時間的生長期，此時形成的顆粒粒徑就相對較大。此外，物質濃度的增加還可能導致微粒包埋率的下降，這可能是因為物質含量的增多減弱了物質與壁材之間的相互作用，導致物質與壁材無法正常聯結形成囊狀結構[6，35，44]。

3.5 沉淀室長度

沉淀室長度主要對制得顆粒的粒徑大小造成影響。F.A.R.Cardoso 等[45]為了更好的通過SAS 法生產微米和納米粒子，創新性地通過計算流體動力學模型耦合種群平衡方程的方法，結合不同幾何形狀的沉淀池試驗數據，探究了沉淀池長度對PHBV 顆粒尺寸的影響。結果表明沉淀室軸向長度較大、腔徑較小的，更容易得到粒徑較大的顆粒。這是因為受到噴射流之間的相互作用，顆粒在腔徑較小的空間內相互碰撞發生了聚集，且溶液流速越大，聚集現象越明顯。此外，軸向長度較大導致顆粒的噴射距離增加，顆粒析出后留給其生長的時間隨之增加，也會導致最終顆粒粒徑相對較大[8]。Hezave 等[46]在使用RESS 法制備吡羅昔康顆粒時也發現了相同的規律，他們將沉淀室長度由1 cm 增加到 10 cm，發現顆粒粒徑也由 5.64 μm 增加至 8.78 μm。

4 存在的問題

雖然超臨界流體制粒技術在制備類胡蘿卜素微粒方面已取得很多進展，但在實際操作過程中仍存在許多不足。目前RESS 法最大的問題就是如何解決類胡蘿卜素在SC-CO2中的溶解度偏低的問題，研究者們對此也提供了許多完善方案，比如加入固體共溶劑和使用超聲增溶等等，但效果并不理想，無法滿足工業化大生產的需求[6]；SAS 法和PGSS 法原理相似，且二者也在類胡蘿卜素微粒制備方面應用較多，但由于當SC-CO2和溶液一起由噴頭噴出時，溶液中的有機溶劑并不能完全吸附在SC-CO2中被帶出，不僅導致有機溶劑的殘留，還會使顆粒聚集在一起，導致噴頭堵塞以及顆粒粒徑增大，且后續顆粒的收集也比較麻煩[4，6]。

5 展望

基于現階段所存在的諸多問題，目前超臨界CO2流體制粒技術具有以下幾個發展趨勢：第一，研究不同體系在不同條件下的相行為，各種多組分體系的相平衡可為操作參數（CO2流體濃度、溫度、壓力等）的設定提供理論參考；第二，探究涂層材料、生物活性物質和SC-CO2之間的相互作用關系，例如由于膨脹作用引起的物質玻璃化轉變溫度和黏度的降低；第三，深入討論各方法的微粒結晶機理，這會讓我們有能力對重點參數進行修改并及時得到產品性能的定量預估[47-49]。相信隨著超臨界制粒試驗技術和基礎理論研究的不斷完善，超臨界制粒裝置的設計和制造均將取得突破性進展。