呋喃西林代謝物酶聯免疫吸附測定方法的建立及性能測定

徐冬梅，李亞英，李玉靜

（1.石家莊職業技術學院食品與藥品工程系，河北石家莊050081；2.河北科技大學，河北石家莊050018；3.河北交通職業技術學院，河北石家莊050051）

呋喃西林（Nitrofurazone）是硝基呋喃類藥物的一種，具有5-硝基呋喃母核[1]，可抑制細菌DNA 和RNA合成，干擾菌體內酶代謝系統，能有效殺滅多種革蘭氏陰性和陽性菌及某些真菌和原蟲，曾被廣泛應用于畜牧、水產養殖中[2]。然而，該類藥物及其代謝物具有細胞誘變性、動物致癌毒性[3]，通過食物鏈進入人體后會產生潛在危害，大部分國家已經禁止其在肉食中殘留[4]。

呋喃西林在動物體內會被迅速代謝[5]，不易檢測，其代謝產物氨基脲（semicarbazide hydrochloride，SEM）能跟細胞內蛋白長期結合[6-8]，存留較長時間，因此SEM 可作為呋喃西林殘留的標識物。目前，呋喃西林代謝物的檢測方法主要為色譜分析技術和免疫學分析技術。色譜技術主要為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatography-mass，LC-MS）和液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）等，這些方法能隨刻進行精確檢測[9-11]，有著靈敏和準確等優點，但儀器設備昂貴、操作繁瑣、檢測成本高，不適合現場批量檢測，嚴重影響了對其非法使用的檢測監管和風險預警。以酶聯免疫吸附技術為代表的免疫分析方法具有靈敏準確、方便快捷、分析容量大、檢測成本低等優點，可以實現對目標物進行現場批量快速定性定量分析，已成為目前最有效的初篩技術手段[12-17]，廣泛應用于動物源性食品中有毒有害物質的檢測。

本研究以自制的SEM 抗原、抗體為基礎原料[18]，通過確定抗原和抗體使用濃度、抗原包被時間和溫度、一抗和二抗作用時間等反應條件，建立間接競爭ELISA 檢測方法，通過性能測定，該方法的靈敏度、準確度和精密度等參數均符合我國動物源性食品中獸藥殘留檢測方法的有關規定，具有簡便、快速、能批量檢測等特點，能夠應用于動物源性食品中呋喃西林代謝物的檢測。影響該方法性能的因素有很多，如人工抗原的純度、抗體的敏感性和特異性以及方法學的各項反應條件等[19-23]。本試驗采用了自制的呋喃西林代謝物的人工抗原和單克隆抗體，人工抗原經透析等手段保證了純度，單克隆抗體經鑒定具有很高的敏感性和特異性，從基礎材料上有效保障了方法學的建立。通過進一步的試驗，建立其酶聯免疫吸附測定方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

呋喃西林代謝物標準品：Sigma 公司；呋喃西林代謝物完全抗原SEM-OVA、呋喃西林代謝物單克隆抗體細胞株3D9：河北省科學院生物研究所細胞生化研究室研制；牛血清白蛋白（bovine serum albumen，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、胎牛血清：上海生物工程股份有限公司；HRP 標記山羊抗小鼠IgG：北京中杉金橋生物；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器設備

MULTIVAP 型氮吹儀：上海書俊儀器設備有限公司；ME54E 電子分析天平：METTLER 公司；液氮罐：成都金鳳液氮容器有限公司；Allegra X-15R 高速冷凍離心機：德國BECKMAN 公司；DKB-8A 電熱恒溫水浴鍋：上海精宏設備有限公司；ELX800 酶標儀：美國伯騰儀器有限公司Bio-TEK；XW-80A 漩渦混合器：上海醫科大學儀器廠；96 孔酶標板：Costar 公司；微量移液器：Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA 檢測方法條件優化

1.3.1.1 抗原抗體工作濃度的確定

抗原、抗體采用方陣稀釋法，橫向包被梯度濃度的抗原，縱向加入倍比稀釋的抗體，用間接酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）法進行測定，選擇A450nm為1.0 左右時抗原和抗體濃度的組合作為理想工作濃度。

1.3.1.2 抗原包被時間及溫度的選擇

以確定的抗原、抗體濃度，分別設定包被條件為以下 6 種：4 ℃包被過夜、37 ℃孵育 0.5、1、2、3 h 和 4 h，分別檢測其吸光度值，選擇最佳包被時間和溫度。

1.3.1.3 一抗作用時間的選擇

一抗作用時間會影響到一抗和抗原的反應效果，因此需要通過試驗來確定一抗與抗原的最佳作用時間。本試驗選用一抗作用時間分別為10、20、30、45 min和60 min，通過線性關系選擇最佳作用時間。

1.3.1.4 羊抗小鼠二抗作用時間的確定

羊抗小鼠二抗的孵育時間選用10、20、30、45 min和60 min 進行測定。

1.3.2 樣品預處理

準確稱取（1±0.05）g 均質樣本于 50 mL 離心管中；加入4 mL 去離子水，0.5 mL 1 mol/L 鹽酸溶液和100 μL 衍生化試劑工作液，充分振蕩；在37 ℃過夜孵育（約16 h）或60 ℃水浴孵育 1.5 h；分別加入 5 mL 0.1 mol/L K2HPO4溶液，0.4 mL 1 mol/L NaOH 溶液和6 mL 的乙酸乙酯，充分振蕩5 min；室溫26 ℃下4 000 r/min，離心10 min；取出3 mL 的上層液到另一5 mL 離心管中，50 ℃～60 ℃水浴氮氣吹干；用 2 mL 正已烷溶解殘留物，再加入1 mL 復溶工作液充分振蕩混合 30 s；室溫 26 ℃ 4 000 r/min，離心 5 min；去除上層正己烷相以及兩相（正己烷相和水相）之間的泡沫或者膠狀物，取下層水相50 μL 樣品進行檢測。

1.3.3 ELISA 方法的性能測定

1.3.3.1 標準曲線的建立

按照優化的條件，在線性范圍內繪制標準曲線，計算回歸方程和R2，計算IC50值；重復測定，確定標準曲線的穩定性。

1.3.3.2 檢測限測定

根據歐盟《動物源性食品中獸藥殘留檢測方法》的規定，分別測定20 份魚肉組織的空白樣品，根據以上所述的方法對樣品進行處理。用回歸方程計算樣品殘留濃度，用SPSS 得出樣品濃度的平均值（X）和標準差（SD），以X 加3 倍SD 值作為各樣本的最低檢測限。

1.3.3.3 準確度試驗

采用樣品添加回收試驗檢測該方法的準確度，在空白魚肉樣品中添加不同濃度的待測物，用間接競爭ELISA 方法檢測。回收率計算如下：

回收率/%=實測濃度（μg/L）/添加濃度（μg/L）×100

1.3.3.4 精密度試驗

精密度試驗用變異系數來表示。

某日經過一家普通餐廳，便有心進去進餐。當他走進洗手間時，發現一張老舊卻別致的桌子上放著一瓶鮮艷盛開的花，洗手間內干凈整潔，一塵不染。他發現很多人洗手后會主動把臺子擦干凈。老板剛好進來，他便對老板說：“這花真漂亮！”老板得意地說：“知道嗎？我在此擺鮮花已十余年了，你絕對想不到它為我省去多少清潔工作。”

式中：SD 表示標準偏差；X 表示平均值。

取5 個批次的組裝試劑盒，測定魚肉組織中添加不同濃度的待測物的變異系數。

1.3.3.5 ELISA 法與儀器方法的比較

選取魚肉樣本，用本試驗確定的間接競爭ELISA法和農業部783 號公告-1-2006 中液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）同時對樣品進行檢測，比較兩種方法的符合性。

2 結果分析

2.1 抗原抗體最佳工作濃度的確定

對抗原抗體的最佳工作濃度的進行測定，結果如圖1。

圖1 SEM 不同抗原抗體濃度檢測結果Fig.1 Different antigen antibody concentration detection results of SEM

隨著包被濃度的降低，抑制曲線在上移，IC50值在上升，可能是抗原抗體的結合能力較差，需要比較高的作用濃度。綜合考慮，選擇線性較好的抗原濃度1 μg/mL、抗體稀釋倍數 1 ∶1 萬作為 SEM 的 ELISA 法最佳抗原抗體使用濃度。

2.2 包被時間及溫度的確定

包被條件結果見圖2。

圖2 最佳包被時間和溫度的確定Fig.2 Determination of optimal packet time and temperature

結果表明，37 ℃ 0.5 h 所得 OD 值明顯較低，到37 ℃2 h 后OD 值趨于穩定，且與4 ℃過夜的OD 值無明顯差別，故確定37 ℃2 h 或4 ℃過夜為最佳包被條件。

2.3 一抗作用時間的優化

隨著抗體和抗原作用時間的增加，抑制曲線呈上移趨勢，綜合反應時間和線性關系因素，選擇30 min作為SEM 間接競爭ELISA 的一抗作用時間。

2.4 羊抗小鼠二抗作用時間的確定

對二抗作用的時間進行測定，結果如圖4。

圖3 SEM 不同的一抗作用時間結果Fig.3 Results of different action time of primary antibody

圖4 SEM 不同的二抗作用時間結果Fig.4 Results of different action time of secondary antibody

隨著作用時間的延長抑制曲線呈現上移，且線性范圍在擴大，綜合反應時間和線性關系，選擇30 min作為SEM 間接競爭ELISA 的二抗作用時間。

2.5 標準曲線

將 6 個濃度的 SEM 標準溶液（0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43 μg/L），每個濃度重復 5 孔，按照間接競爭ELISA 法測定獲得相應的吸光度值，計算抑制率B/B0（B0為標準品 0 μg/L 的吸光度值，B 為標準品不同濃度的吸光度值）。以B/B0為縱坐標，以標準品濃度的對數值為橫坐標，繪制SEM 的抑制曲線。結果如圖5。

圖5 SEM ELISA 試劑盒標準曲線Fig.5 ELISA kit standard curve of SEM

SEM 的 ELISA 檢測方法在 0.03 μg/L～2.43 μg/L范圍內呈線性，線性方程為y=-0.335 1x+0.384 2（R2=0.992 7）。以線性最低點0.03 μg/L 作為該檢測方法靈敏度。

2.6 檢測限測定

對魚肉組織、蝦肉組織樣本進行檢測，結果如表1和表2 所示。

表1 魚肉組織樣本測定結果Table 1 Determination of fish tissue samples μg/kg

表2 蝦肉組織樣本測定結果Table 2 Determination of tissue samples from shrimp meat μg/kg

檢測限分別為 0.236 μg/kg 和 0.229 μg/kg，根據實際檢測情況將樣本的最低檢測限定為0.25 μg/kg。

2.7 試劑盒準確度及精密度測定

SEM 的ELISA 試劑盒測定魚肉組織中添加回收試驗，結果如表3 所示，樣品回收率均在75%～120%之間，批內、批間變異系數均在15%以下，符合我國動物源食品中獸藥殘留檢測方法的規定。

2.8 與儀器方法的對比試驗

本試驗用標準方法LC-MS/MS 和ELISA 方法同時測定樣品中SEM 的含量見圖6。兩種方法用于魚肉樣本的檢測，均呈現較好的相關性，R2為0.994 4。

表3 樣品的變異系數及回收率Table 3 Coefficient of variation and recovery of samples

圖6 LC-MS/MS 和ELISA 方法檢測魚肉樣本中SEM 的相關性比較Fig.6 Correlation comparison between LC-MS/MS and SEM in fish samples

3 結論

本研究建立的檢測方法在 0.03 μg/L～2.43 μg/L 范圍內呈線性，線性方程為y=-0.335 1x+0.384 2（R2=0.9927），檢測靈敏度為 0.03 μg/kg，魚肉組織樣本、蝦肉組織樣本的檢測限分別為0.236、0.229 μg/kg，回收率均在75%～120%之間，批內、批間變異系數均在15 %以下，通過與標準方法LC-MS/MS 對比驗證，兩種方法用于魚肉樣本的檢測均呈現較好的相關性，相關系數R2為0.994 4。本研究建立的呋喃西林代謝物酶聯免疫吸附測定方法的靈敏度、準確度和精密度等參數均符合我國動物源性食品中獸藥殘留檢測方法的規定，具有靈敏準確、方便快捷、分析容量大、檢測成本低等優點，適合動物源性食品中呋喃西林代謝物的檢測。