黃酒非生物穩定性的預測模型

謝廣發，陸 健，孫軍勇,，陸 胤，彭 祺，錢 斌，金建順，王 蘭，傅祖康，魯振東，劉彩琴

（1.浙江樹人大學生物與環境工程學院，浙江 紹興 312028；2. 浙江樹人大學紹興黃酒學院，浙江 紹興 312028；3.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122；4.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；5.國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000；6.會稽山紹興酒有限公司，浙江 紹興 312000）

黃酒是一種膠體溶液，在受到外界條件溫度、光照、pH值、氧等因素影響時，膠體溶液穩定性容易受到破壞，從而使其中的某些物質析出，造成非生物混濁[1-2]。非生物混濁在釀造酒中普遍存在[3-4]，而黃酒的混濁和沉淀問題比其他釀造酒更加嚴重[5]。蛋白質是已知影響黃酒非生物混濁的最大因素之一[6]，瓶裝黃酒沉淀中蛋白質量分數為50.56%[7]，但有關研究認為，混濁的形成與總蛋白含量并沒有直接的因果關系，而可能與黃酒中的某類特殊蛋白質相關[8]，多酚和鐵離子含量等也對酒體的非生物穩定性有影響[9]，敏感多酚和敏感蛋白的相互作用是影響黃酒非生物混濁的主要原因[10]。

目前黃酒行業沒有統一的非生物穩定性檢測方法，文獻報道用于黃酒非生物穩定性預測的方法有低溫存放法[11]、熱處理法[12-14]、冷熱循環法[15]和乙醇-濁度法[16-17]，其中研究最多的為冷熱循環法。白少勇[15]采用冷熱循環法測定酒樣處理前后的濁度，條件為0 ℃放置24 h、60 ℃放置24 h，兩個循環，恢復室溫后進行測定；江超[18]通過60 ℃水浴12 h、4 ℃放置12 h，以循環3 次后的濁度差來判斷黃酒非生物穩定性；高恩麗等[19]用60 ℃放置24 h、0 ℃放置24 h循環處理黃酒，4 d后在55～60 ℃下測定濁度；姬中偉等[20]采用-5、45 ℃交替存放50 d后，比較酒體的混濁程度來判斷酒體的穩定性；陳玲等[21]采用85 ℃放置0.5 h、0 ℃放置0.5 h，20 個循環后觀察混濁情況。實際應用中發現，這些預測方法與黃酒自然存放過程中的穩定性存在較大差異，不能很好地預測黃酒的穩定性。因此，通過對各種黃酒穩定性的評價及與穩定性相關的理化指標的分析，建立一種更準確實用的穩定性預測方法，有利于穩定性處理效果的評價和生產指導，避免貨架期間因酒體混濁而引起退貨返工。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒樣品主要購自當地超市，產地主要為上海、浙江、江蘇等，樣品具體信息見表1。

表 1 黃酒樣品基本信息Table 1 Information about Chinese rice wine samples tested in this study

乙腈、胰蛋白酶、α-氰基-4-羥基肉桂酸、碳酸氫銨、三氟乙酸 美國Sigma公司；30%丙烯酰胺單體儲液、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、甲叉雙丙烯酰胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、牛血清白蛋白、過硫酸銨、考馬斯亮藍R-250、β-巰基乙醇、丙酮、尿素、三氯乙酸、蛋白分子質量標準品、N-三(羥甲基)甘氨酸 生工生物工程（上海）股份有限公司；鹽酸羥胺、鄰菲啰啉、Folin-Ciocalteu試劑、聚乙烯吡咯烷酮、乙酸鈉、沒食子酸、單寧酸、硫酸亞鐵銨 國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

MPG-100H低溫加熱循環槽 上海一恒科學儀器有限公司；JD-801凝膠成像系統 江蘇捷達科技發展有限公司；Mini-Protein 3 Cell蛋白電泳系統） 美國Bio-Rad公司；WGZ-2-PJ型濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司；KT260凱氏定氮儀 丹麥Foss有限公司；Ultraflextreme基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒混濁樣品制備

將瓶裝黃酒或經非生物穩定性處理后的黃酒靜置5 d，采用虹吸法將上清酒液去除，留下底部約80 mL酒樣，振蕩混勻后，12 000 r/min離心30 min，收集混濁沉淀。再將收集的沉淀懸浮于超純水，12 000 r/min離心30 min，重復上述過程。超純水洗滌兩次后的沉淀用體積分數2%氨水溶解，添加硫酸銨粉末達到80%飽和度，然后用1 000 Da的透析袋于4 ℃下脫鹽48 h，最后冷凍干燥，即得到混濁蛋白樣品[22]。

1.3.2 混濁蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）按照文獻[22-23]中的方法進行，將樣品蛋白溶于pH 7.0的0.05 mol/L Tris-HCl溶液中，通過Bradford法測定蛋白質量濃度以確定上樣量。采用的分離膠質量分數為12%，采用的濃縮膠質量分數為4%。電泳結束后將凝膠固定30 min后，在染色液（考馬斯亮藍R-250）中染色30 min，脫色液脫色至背景清晰，采用JD-801凝膠成像儀對凝膠拍照，圖片通過捷達801圖像分析軟件3.3分析。

1.3.3 混濁蛋白的基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜分析

參考文獻[24]對混濁蛋白進行基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜分析，切取凝膠上的蛋白條帶，用含有100 mmol/L碳酸氫銨的體積分數30%乙腈溶液洗滌膠粒直至無色。加入50 μL無水乙腈使膠粒脫水呈現白色。向EP管中加入5 μL稀釋后的胰蛋白酶溶液，使膠粒完全吸收酶液（置于4 ℃冰箱中30～60 min），吸掉多余胰蛋白酶溶液，加入25 mmol/L碳酸氫銨溶液20 μL，37 ℃保溫16～20 h。將酶解液轉移到新離心管中，旋轉真空濃縮至約3 μL。取0.7 μL樣品點樣，干燥后加0.7 μL基質，干燥后通過質譜儀對點靶樣品進行質譜分析。采用正離子反射模式與自動獲取數據模式采集一級質譜數據，掃描范圍為700～3 500 Da。選取信號強度好的一級質譜峰進行二級質譜分析，使用BioTools軟件進行整合，用Mascot軟件在美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中進行全物種質譜數據搜索。

1.3.4 黃酒非生物穩定性實驗

冷熱循環法：黃酒樣品0 ℃放置12 h后80 ℃放置12 h，計為一個循環，每完成一個循環，測定樣品濁度，記錄濁度增加4 NTU所需循環數，記為?4 NTU循環數。

熱穩定性實驗：根據Hsu等[25]的方法稍作修改，取酒樣50 mL，90 ℃水浴6 h，冷卻至室溫，測定熱處理前后的濁度，計算濁度增加量，以濁度的增加量表示，單位為NTU。濁度的增加量越大，酒體的穩定性越差。

冷凍實驗參考文獻[15]：將黃酒樣品在0 ℃條件下存放12 h，測定冷凍后樣品的濁度，單位為NTU。

乙醇-濁度測定參考文獻[15]：取黃酒酒樣50 mL，加入無水乙醇25 mL，振蕩混勻，2 h后測定濁度，以添加乙醇前后濁度增加量表示，單位為NTU。

自然存放：將酒樣存放于自然條件下，記錄初始濁度以及自生產日期開始后第9、12個月的樣品濁度。

1.3.5 混濁相關指標的測定

黃酒混濁相關理化指標敏感蛋白、敏感多酚、總酚、兒茶素、隆丁區分和鐵離子的測定參照文獻[24]，其中敏感蛋白含量以添加單寧之后濁度的變化量表示，敏感多酚含量以添加聚乙烯吡絡烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）之后濁度的變化量表示，單位均為NTU。

1.4 數據處理與分析

所有實驗數據均測定3 次，取平均值。采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同非生物穩定性預測方法中析出蛋白質的SDS-PAGE分析結果

目前，用于酒類非生物穩定性快速預測的方法主要有冷熱循環法、熱處理法、乙醇濁度法和冷凍實驗法。在本研究中，對不同的預測方法中析出的蛋白質與自然沉淀中的混濁蛋白進行對比，以選擇能較準確預測非生物穩定性的預測方法。

采用不同的穩定性實驗方法處理瓶裝黃酒，處理結束后收集沉淀物，按照1.3.1節中的方法提取蛋白質，將不同穩定性實驗方法中析出的蛋白與收集的瓶裝酒中自然沉淀蛋白分別上樣進行SDS-PAGE，結果見圖1。

兩種不同的酒樣中，自然沉淀蛋白質都主要分布在14.4 kDa（條帶b1和c2）和27 kDa（條帶a1和b2），與孫軍勇等[26]研究發現黃酒混濁蛋白主要分布在13～16 kDa和28～55.4 kDa之間的結果一致。Schulte等[27]研究發現形成啤酒混濁的蛋白，主要是分子質量為16.5 kDa和30.7 kDa的糖蛋白。通過對比發現，冷熱循環法和熱處理法沉淀蛋白與自然沉淀蛋白的分布相同，也集中在14.4 kDa和27 kDa處。冷凍實驗法和乙醇-濁度法析出的主要蛋白分別是a2～c2和a1～c1。樣品A中析出的蛋白比自然沉淀蛋白多出了條帶c1（分子質量為8.0 kDa）；在樣品B中，多沉淀出了分子質量為34.4 kDa的條帶a2。經軟件計算，乙醇濁度法沉淀蛋白中的c1和a2，分別占總沉淀蛋白的40.2%和23.7%，這說明乙醇濁度法沉淀蛋白與自然沉淀蛋白的成分不同，并且各成分所占的比例也差異明顯；冷凍實驗法沉淀蛋白中的a2占總沉淀蛋白的38.6%，與自然沉淀蛋白成分相同的蛋白質總含量僅為61.4%，這與混濁蛋白的成分組成有很大差別。

圖 1 不同穩定性實驗方法沉淀出的蛋白質Fig. 1 SDS-PAGE of precipitated proteins in different stability tests

挖取條帶a2和c1進行質譜鑒定，鑒定結果分別為絲氨酸蛋白酶抑制劑-Z1C和病程相關蛋白-4（pathogenesis related protein-4，PR-4）。PR蛋白能抵抗糖苷酶、蛋白酶、尿素、重金屬、高溫（60 ℃）和低pH值[28-30]，PR-4蛋白是一個具有保守Barwin結構域的病程相關蛋白家族，除了對病原微生物的應激反應外，水稻PR-4基因還涉及非生物應激反應和耐受性[29]。PR-4是混濁蛋白的組成成分之一[31-33]，但是從混濁蛋白的電泳圖譜可以看出，PR-4的條帶顏色較淺，說明其在混濁蛋白中的含量很低，不是混濁蛋白主要的組成部分。絲氨酸蛋白酶抑制劑-Z1C來源于小麥，并不是混濁蛋白的組分，但在乙醇濁度實驗和冷凍實驗中析出，說明它可能是一種低醇溶性和低溫下溶解度降低的蛋白質，它的存在說明這兩種預測方法不能準確地預測黃酒的非生物穩定性。

綜上，不同的穩定性實驗方法沉淀出的蛋白質都含有14.4 kDa和27.6 kDa這兩個條帶，與混濁蛋白的分布相符，但乙醇濁度法和冷凍法所沉淀蛋白的種類和組成都與自然沉淀蛋白有較大差異，因此，這兩種方法不能準確反映黃酒的非生物穩定性，而冷熱循環法和熱處理兩種方法所沉淀蛋白質與混濁蛋白分布一致，可以用于預測黃酒的非生物穩定性。

2.2 黃酒蛋白非生物穩定性相關指標與不同預測方法相關性分析結果

黃酒在存儲過程中發生蛋白質混濁，從而影響黃酒的外觀和銷售，黃酒中的一些成分與蛋白質混濁相關，例如一些蛋白類、多酚類和金屬離子。為了更好地預測黃酒蛋白混濁情況，本研究通過對各黃酒樣品的蛋白質混濁相關指標進行測定，并且采用冷熱循環法和熱處理法快速反映黃酒的非生物穩定性，分析各項混濁指標與非生物穩定性的關系。

2.2.1 黃酒樣品蛋白類混濁指標及穩定性實驗分析結果

選取20 種不同產地、不同類型的黃酒樣品，測定其在生產日期1 個月內的各項蛋白質混濁相關指標并進行穩定性實驗，結果見表2、3；各項指標的統計性描述結果見表4。

表 2 黃酒樣品的敏感蛋白、總氮及隆丁分區Table 2 Concentrations of sensitive protein and total nitrogen and Lundin composition in Chinese yellow wine

表 3 黃酒樣品多酚類指標、鐵離子及穩定性實驗的測定結果Table 3 Concentrations of polyphenols and iron ions and stability evaluation of Chinese yellow wine

表 4 黃酒樣品蛋白質混濁相關理化指標及穩定性實驗統計性描述Table 4 Statistical description of physicochemical indexes related to turbidity and stability of Chinese yellow wine

2.2.2 黃酒樣品蛋白類混濁指標與穩定性實驗結果相關性分析結果

將購買的每一種黃酒分成兩份，一份用于測定蛋白混濁相關指標及其初始濁度，并且進行穩定性實驗，另一份存放于自然條件下，定時測定其濁度并觀察混濁情況。利用SPSS 18.0軟件對測定的各項指標、穩定性實驗結果和自然存放后的濁度進行分析，以期建立更準確地預測黃酒非生物穩定性的方法。

采用SPSS 18.0軟件對20 種黃酒的蛋白類混濁指標與不同穩定性實驗的結果進行Pearson相關性分析。從表5可以看出，與冷熱循環法相關性最顯著的蛋白類混濁指標為中分子質量氮質量濃度，呈極顯著負相關（r＝-0.647，P＜0.01），其次為中分子質量氮占總氮的比例（B區比例）（r＝-0.559，P＜0.05）和敏感蛋白含量（r＝-0.477，P＜0.05），均呈現為顯著負相關；對黃酒樣品的熱穩定性進行分析，發現相關性最顯著的蛋白類指標同樣也是中分子質量氮質量濃度，呈極顯著正相關（r＝0.694，P＜0.01），另外與總氮質量濃度呈極顯著正相關（r＝0.691，P＜0.01），其次為低分子質量氮比例（C區比例）和低分子質量氮質量濃度（r＝-0.645，P＜0.01；r＝0.632，P＜0.01）。

由表5可知，冷熱循環法與中分子質量氮相關指標和敏感蛋白含量顯著相關，而熱穩定實驗法與總氮質量濃度、高分子質量氮質量濃度、中分子質量氮質量濃度、低分子質量氮質量濃度、C區比例等眾多指標顯著相關。混濁蛋白的分子質量分布在13～56 kDa，屬于中分子質量氮（12～60 kDa）[26]。酒體中的大分子質量蛋白質經過發酵、壓濾、澄清和煎酒過程，絕大多數已被去除，中、低分子質量的蛋白在受到外界環境影響時，是形成混濁的主要原因[4]。因此，冷熱循環法能更準確地反映黃酒的非生物穩定性，并且中分子質量氮質量濃度與其顯著相關，可以用于黃酒非生物穩定性預測模型的建立。

表 6 黃酒樣品蛋白質混濁相關多酚類、鐵離子及穩定性實驗相關性分析Table 6 Correlation between turbidity-related polyphenols, iron ions and stability of Chinese yellow wine

從表6中可發現，?4 NTU循環數與多酚類指標和鐵離子質量濃度的相關性不顯著，熱穩定性與總酚質量濃度和敏感多酚濁度有一定的相關性。

2.3 自然存放酒樣混濁情況統計結果

將購買的20 種酒樣存放于自然條件下，定期觀察其混濁情況并測定濁度，從生產日期開始計算至自然存放9 個月的和12 個月的濁度及混濁情況如表7所示。在存放的過程中，黃酒的濁度越來越大，混濁程度越來越嚴重。對樣品的混濁情況分布進行分析（圖2），存放9 個月時，約30%的樣品出現嚴重混濁，存放到12 個月時，50%的樣品出現嚴重混濁，在瓶底形成一層沉淀，嚴重影響外觀品質。

表 7 自然存放不同時間黃酒的混濁情況Table 7 Change in turbidity of Chinese yellow wine during ambient storage

圖 2 黃酒混濁情況頻數分布圖Fig. 2 Turbidity distribution of Chinese yellow wine during ambient storage

在本研究中，將黃酒混濁程度共分為4 個等級：無混濁、輕微混濁、中等混濁及嚴重混濁。為了更好地將濁度與混濁情況對應起來，對表7中酒樣的濁度與混濁情況進行統計分分類，結果見表8。

表 8 黃酒混濁程度分類Table 8 Turbidity rating of Chinese yellow wine

2.4 黃酒非生物穩定性預測方法的建立

2.4.1 黃酒樣品濁度與各項混濁指標和穩定性實驗相關性分析結果

黃酒在存放的過程中除了受到溫度變化、振動、光照和氧化等因素影響外，酒體成分中的混濁相關物質也會影響黃酒的濁度變化。將20 種酒樣自然存放9 個月和12 個月的濁度與穩定性實驗及各項蛋白混濁指標進行相關性分析，結果如表9～11所示。

表 9 自然存放酒樣濁度與穩定性實驗相關性分析Table 9 Correlation analysis between stability and turbidity of Chinese yellow wine

從表9中可以看出，自然存放9、12 個月酒樣的濁度與冷熱循環法?4 NTU循環數極顯著負相關（r＝-0.678，P＜0.01；r＝-0.688，P＜0.01），而與熱穩定性相關性不顯著。因此，?4 NTU循環數可以用于非生物穩定性預測模型的建立。

表 10 自然存放酒樣濁度與蛋白類混濁指標相關性分析Table 10 Correlation analysis between protein and nitrogen indexes and turbidity of Chinese yellow wine stored under ambient conditions

根據表10可知，黃酒樣品存放9 個月濁度與敏感蛋白含量、總氮質量濃度、低分子質量氮質量濃度呈顯著相關，存放12 個月濁度與敏感蛋白含量、總氮質量濃度、中分子質量氮質量濃度和低分子質量氮質量濃度顯著正相關，因此敏感蛋白含量、總氮質量濃度、中分子質量氮質量濃度和低分子質量氮質量濃度也能夠用于非生物穩定性預測模型的建立。

表 11 自然存放酒樣濁度與初始濁度、多酚類指標和鐵離子含量相關性分析Table 11 Correlation analysis between initial turbidity, polyphenols contents and iron ion content and turbidity of Chinese yellow wine stored under ambient conditions

從表11可知，黃酒樣品分別存放9 個月和12個月后的濁度與樣品的初始濁度相關性并不顯著，因此不能根據初始濁度來判斷黃酒的非生物穩定性，并且其與多酚類指標和鐵離子質量濃度的相關性也不顯著，因此不用于預測模型的建立。

2.4.2 黃酒非生物穩定性多元回歸預測模型的建立

通過對黃酒樣品自然存放濁度與各蛋白質混濁相關指標和穩定性實驗之間的相關性進行分析，選取與自然存放酒樣濁度顯著相關的指標和穩定性實驗方法，利用SPSS 18.0軟件進行多元線性回歸分析，建立預測黃酒自然存放12 個月后濁度的模型，模型分析結果如表12所示。模型的相關系數0.805，決定系數R2為0.648。模型的F檢驗值為5.155，P值為0.007，達到極顯著水平，符合統計學意義上的要求。

表 12 模型的方差分析Table 12 Analysis of variance of the regression model

根據上文對自然存放9、12 個月濁度與各蛋白質混濁相關指標和穩定性實驗之間的相關性分析，選取與濁度顯著相關的?4 NTU循環數、敏感蛋白含量、總氮質量濃度、低分子質量氮質量濃度、中分子質量氮質量濃度為模型自變量，以存放12 個月的濁度為因變量，建立多元線性回歸方程，預測存放12 個月后黃酒的濁度，模型的相關參數如表13所示。最終模型的回歸方程如下式所示。

Y1＝2.79-0.485X1+0.663X2+0.327X3+1.577X4-3.864X5

式中：Y1為自然存放12 個月濁度/NTU；X1為?4 NTU循環數；X2為敏感蛋白含量/NTU；X3為總氮質量濃度/（g/L）；X4為低分子質量氮質量濃度/（g/L）；X5為中分子質量氮質量濃度/（g/L）。

表 13 建立模型的回歸參數分析Table 13 Coefficient analysis of the regression model

將各參數代入模型給出的回歸方程，計算出黃酒存放12 個月濁度預測值，與實際測得的濁度值進行比較分析，驗證模型的準確度。從圖3可以發現，黃酒存放12 個月的濁度預測值與實測值具有較好的對應性，除少數樣品外，均位于直線y＝x附近。因此，該模型可用于預測黃酒存放12 個月后的濁度。了解黃酒存放12 個月后的混濁情況，有助于提前發現非生物穩定性差的黃酒，避免其流入市場，對于黃酒生產企業生產和銷售的可持續發展具有重要意義。

圖 3 存放12 個月濁度實際值與模型預測值偏差Fig. 3 Deviation between actual values and model predicted values of turbidity after 12 months of storage

3 結 論

通過分析20 種不同產地、不同類型黃酒樣品的混濁相關指標、穩定性實驗與黃酒自然存放后樣品濁度之間的相關性，利用SPSS 18.0軟件進行多元線性回歸分析，發現瓶裝黃酒濁度與增加4 NTU所需冷熱處理循環數、敏感蛋白含量、總氮質量濃度、低分子質量氮質量濃度和中分子質量氮質量濃度等指標顯著相關，并以此為基礎構建了它們之間的多元線性回歸方程。該方程用于黃酒預測非生物穩定性的結果表明，預測值與實測值具有較好的對應性，采用該模型預測黃酒存放12 個月后的濁度，有助于提前發現非生物穩定性差的黃酒，避免其流入市場，對于黃酒生產企業生產和銷售的可持續發展具有重要意義。