‘巨峰’葡萄皮花色苷的分離純化、結構鑒定及抗腫瘤活性

薛宏坤，譚佳琪，劉 釵，劉成海,

（1.東北農業大學工程學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學農學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

近年來合成色素過量使用引發一系列安全問題備受人們的廣泛關注，利用天然色素取代合成色素成為當前研究的熱點。花色苷是一類天然水溶性的植物色素，來源廣泛，具有誘人的色澤和特殊的芳香。研究表明花色苷具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]、預防心血管疾病[4]等生理活性。因此，有必要對花色苷進一步深入研究，對提高花色苷的學術價值和商業價值有重要的指導意義。‘巨峰’葡萄是我國主要的栽培品種之一，因其粒大肉多、酸甜適中等特點，深受廣大消費者的喜愛。‘巨峰’葡萄主要被加工成果汁和果酒，在其加工生產過程中形成的副產物‘巨峰’葡萄皮，其內部含有大量花色苷（以錦葵素為主）、多酚等活性成分。而‘巨峰’葡萄皮通常被遺棄，造成環境污染和資源浪費。‘巨峰’葡萄皮為天然色素的主要原料，但對這種優質的天然色素資源研究開發較少，而且錦葵素相關的標準品稀缺且價格昂貴。因此，建立簡單易行的分離純化花色苷的方法獲得單一高純度的花色苷組分是必要的。

目前，花色苷的分離純化方法主要有柱層析法、膜分離法、高效逆流色譜法、高效制備型液相色譜法等。Wang Erlei等[5]和陳陽[6]等均采用大孔樹脂分別對藍莓花色苷和紅花蕓豆色素進行分離純化，經樹脂純化后樣品的純度得到顯著提高。鄧潔紅等[7]利用紙層析-薄層層析聯用技術從刺葡萄皮中分離純化得到5 種花色苷組分，但是分離純化過程復雜，所需純化周期長。滕學峰[8]運用單一的Sephadex LH-20葡聚糖凝膠技術對黑大豆皮中色素進行分離純化，分離效果較好，但是由于提取物中雜質含量較多，容易造成層析柱的堵塞和污染。在花色苷結構鑒定方面，常用的鑒定方法主要有紫外-可見光譜法、紅外光譜法、液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用法和核磁共振法等。Rasines-Perea等[9]利用紅外光譜法鑒定出紅葡萄中含有12 種花色苷組分。Escribano-Bailon等[10]采用紫外-可見光譜法-HPLC-MS法鑒定奇異果中花色苷結構，研究表明，奇異果中含有8 種花色苷。曹少謙[11]利用NHA-9大孔樹脂-Toyopearl TSK HW-40S凝膠層析聯用技術對血橙花色苷進行分離純化，并對純化后的產物進行結構鑒定，研究發現純化技術可行，經純化后得到8 種花色苷組分。花色苷的抗腫瘤活性方面，劉奕琳[12]、陳建楊[13]和薛宏坤[14]等分別研究發現藍靛果花色苷洗脫物、馬鈴薯花色苷提取物和藍莓提取物對HepG2肺癌和A549肝癌細胞增殖的影響，研究發現3 種花色苷提取物均能顯著抑制腫瘤細胞的生長，而針對花色苷單一組分的抗腫瘤活性研究有限。目前，利用大孔樹脂-Sephadex LH-20葡聚糖凝膠聯用技術分離純化‘巨峰’葡萄皮中花色苷，并探究純化后的單一高純度花色苷組分的抗腫瘤活性鮮見報道。

鑒于此，本實驗采用AB-8大孔樹脂-Sephadex LH-20葡聚糖凝膠聯用技術分離純化‘巨峰’葡萄皮中花色苷，獲得單一高純度的花色苷組分；利用超高效液相色譜三重四極桿飛行時間質譜聯用技術對純化后所得的花色苷組分進行結構鑒定及探究花色苷組分的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘巨峰’葡萄（采摘于東北農業大學園藝學院），成熟后于8月中旬采摘，洗凈，晾干，手工去皮，果皮置于冷凍干燥機凍至48 h，然后用植物粉碎機進行粉碎，過40 目篩，制成葡萄皮粉末，避光密封保存在-18 ℃冰箱中。

AB-8大孔樹脂 天津市大鈞科技有限公司；聚酰胺樹脂 日本三菱公司；Sephadex LH-20 美國Sigma公司；乙醇、乙酸、乙酸乙酯、冰醋酸、氯化鉀、甲酸 國藥集團化學試劑有限公司分析純；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）和DMEM完全培養基 北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）上海萊昂生物科技有限公司；HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞 哈爾濱醫科大學；超純水（過0.45 μm濾膜） 天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜儀和1290超高效液相色譜-G6500四極桿飛行時間質譜聯用儀 美國Agilent公司；DK-98-IIA型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；TG18K-II型高速離心機 上海趙迪生物科技有限公司；SHZ-D（III）型循環水式真空泵 鞏義儀器有限責任公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-mini1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HZQ-F全溫振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；TS100倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；ZE5流式細胞儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗流程

實驗設計流程如圖1所示。

圖 1 實驗設計流程圖Fig. 1 Flow chart of the experimental design

1.3.2 ‘巨峰’葡萄皮花色苷的純化與分離

1.3.2.1 ‘巨峰’葡萄皮色素粗提液的制備

在預實驗的基礎上，準確稱取50 g葡萄皮粉末，以1∶8的料液比加入體積分數為60%酸化乙醇溶液（含體積分數0.05%醋酸），恒溫水浴35 ℃，避光浸提6 h，真空抽濾，收集濾液，將其在35 ℃旋轉蒸發儀減壓濃縮，回收乙醇，將濃縮液以4 000 r/min離心15 min，取上清液以1∶4的體積比加入無水丙酮，避光35 ℃水浴振蕩1 h，真空抽濾，將其在35 ℃旋轉蒸發儀減壓濃縮，回收丙酮，取色素濃縮液以1∶1的體積比加入無水乙醚萃取2 次，棄上層有機相，將得到的萃取液以1∶1的體積比再加入無水乙酸乙酯萃取2 次，將水層除去有機溶劑，然后再將其在35 ℃旋轉蒸發儀減壓濃縮，最終得到‘巨峰’葡萄皮色素粗提液。采用pH示差法[15]測得花色苷的質量濃度為1.280 6 mg/mL。

1.3.2.2 AB-8大孔樹脂對‘巨峰’葡萄皮花色苷的吸附純化

在預實驗的基礎上，取10 mL經預處理后的AB-8大孔樹脂濕法裝柱（2.6 cm×60 cm），控制上樣流速為5 s/滴，當從AB-8大孔樹脂流出液的吸光度值達到上樣液的1/10時，認為大孔樹脂吸附飽和，此時停止進樣，然后用蒸餾水洗脫樹脂至洗出液無色，最后依次用酸化的去離子水（含體積分數0.02% HCl溶液）、體積分數60%酸化乙醇溶液（含體積分數0.05% HCl溶液）和體積分數80%酸化乙醇溶液（含體積分數0.05% HCl溶液）洗脫層析柱，洗脫流速為4 s/滴，洗脫液在35 ℃旋轉蒸發儀減壓濃縮（樣品1）。

1.3.2.3 聚酰胺樹脂對‘巨峰’葡萄皮花色苷的吸附純化

在預實驗的基礎上，取10 mL經預處理后的聚酰胺樹脂濕法裝柱（3.0 cm×40 cm），樣品1過聚酰胺柱，上樣流速為5 s/滴，當從聚酰胺柱流出液的吸光度達到上樣液的1/10時，認為聚酰胺樹脂吸附飽和，此時停止進樣，然后用蒸餾水洗脫樹脂至洗出液無色，將體積分數為50%的酸化甲醇溶液（含體積分數為0.1% HCl溶液）作為洗脫液對層析柱進行洗脫，洗脫流速為4 s/滴，洗脫液在35 ℃旋轉蒸發儀減壓濃縮（樣品2）。

1.3.2.4 Sephadex LH-20凝膠對‘巨峰’葡萄皮花色苷的分離純化

在預實驗的基礎上，經預處理后的Sephadex LH-20凝膠濕法裝柱（1.0 cm×100 cm），樣品1經過0.22 μm微孔濾膜過濾后上樣，上樣體積為2 mL，當樣品1完全滲入膠床后，然后用體積分數為50%的酸化甲醇溶液（含體積分數為0.1% HCl溶液）對層析柱進行洗脫，洗脫流速為10 s/滴，當色素帶在色譜柱中分離開后，將洗脫流速調至為2 s/滴，每2 mL一管，根據HPLC檢測結果，合并純度大于95%的收集管，在真空冷凍干燥機中將其凍干，得色素I、色素II、色素III、色素IV粉末，花色苷組分得率的計算如式（1）所示。

式中：m為花色苷組分粉末質量/g；m0為‘巨峰’葡萄皮粉末質量/g。

1.3.3 紫外-可見光譜分析

利用體積分數為0.01%鹽酸甲醇溶液溶解樣品1、樣品2、色素I、色素II、色素III和色素IV粉末，將其在200～700 nm波長范圍內進行掃描[16]，分析其光譜特征。

1.3.4 高效液相色譜分析

樣品處理：將樣品1、樣品2、色素I、色素III和色素IV分別用體積分數0.1% HCl-甲醇溶液稀釋后，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液，溶液過0.45 μm濾膜，用于HPLC分析。

色譜條件：1100 C18柱（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流動相A為V（甲酸）∶V（水）=1∶5；流動相B為V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=57.5∶40∶2.5；洗脫程序：10% B（0 min）～30% B（5 min）～30% B（10 min）～100% B（15 min）～100% B（25 min）～10% B（28 min）；流速為0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量為20 μL；檢測波長為520 nm。

1.3.5 超高效液相色譜三重四極桿飛行時間質譜聯用分析

HPLC條件：1290 C18柱（150 mm×2.1 mm，5 μm），流動相A：體積分數為0.1%甲酸水溶液；流動相B：體積分數為0.1%甲酸乙腈；洗脫程序：15% B（0 min）～40% B（9 min）～60% B（15 min）～75% B（25 min）～90% B（25 min）～15% B（30 min）；流速為0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量為20 μL；掃描波長為190～400 nm。色素檢測波長為287 nm。

質譜條件：電噴霧電離離子源，質譜采用正離子掃描方式，質量掃描范圍m/z 100～1 200，毛細管電壓4.5 kV，霧化器壓力138 kPa，干燥氣溫度335 ℃。

1.3.6 抗腫瘤活性指標

1.3.6.1 MTT法檢測細胞增殖能力

采用MTT法測定‘巨峰’葡萄皮花色苷組分對腫瘤細胞的增殖抑制作用，參照文獻[17]方法測定，細胞存活率計算如式（2）所示。

式中：As為樣品組的吸光度；Ac為空白對照組的吸光度。

1.3.6.2 花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞侵襲能力的影響

采用Transwell侵襲實驗考察花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞侵襲能力。參考楊三維等[18]研究紫小麥花色苷對腫瘤細胞侵襲能力影響的操作方法。在倒置顯微鏡下觀察，計算細胞數量，侵襲率的計算如式（3）所示。

1.3.6.3 花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞凋亡的影響

取對數期HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞接種于60 mm細胞培養板（2.5×105個/孔），培養24 h，用色素I、色素III和色素IV處理24 h，移除培養基，用胰蛋白酶消化，收集細胞，用PBS洗兩次，然后采用Annexin V-FITC/PI雙標記染色法，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4 數據處理

每組實驗重復3 次，結果用平均值±標準差表示；采用Statistix 8.0軟件對每組實驗數據進行方差分析；采用SAS 8.0軟件分析結果的差異顯著性；Origin 9.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 ‘巨峰’葡萄皮花色苷得率

依據式（1）計算可得，色素I、色素III和色素IV的得率分別為（0.108±0.011）%、（0.053±0.007）%和（0.038±0.005）%，而根據‘巨峰’葡萄皮花色苷的含量計算可得花色苷的理論得率范圍為0.21%～0.25%。因此，該純化分離方法在制備效率上是可行的。

2.2 紫外-可見光譜分析結果

經AB-8大孔樹脂純化后的樣品（樣品1）和經聚酰胺樹脂純化后的樣品（樣品2）的紫外-可見吸收光譜如圖2所示。樣品1和樣品2在280 nm左右和520 nm左右均有最大吸收峰，由此可判斷花色苷是經AB-8大孔樹脂和聚酰胺樹脂純化后的色素溶液中主要成分[19]。并且樣品1和樣品2在330 nm左右也有弱的吸收峰，說明樣品1和樣品2溶液中可能存在酰化的花色苷[20]。

圖 2 樣品的紫外-可見掃描光譜Fig. 2 UV-Vis absorption spectra of purified samples

樣品1再經Sephadex LH-20凝膠分離純化后，‘巨峰’葡萄皮色素溶液被凝膠柱分離成4 個不同顏色的色素帶，分別為色素I（淡粉色）、色素II（橙色）、色素III（紫紅色）和色素IV（粉紅色），對各色素帶在200～700 nm范圍內進行紫外-可見光譜掃描，其結果如圖3所示。色素II在280 nm和520 nm附近均無紫外吸收峰，結果表明色素II為非花色苷類的物質，不再進行后續的研究。而色素I、色素III和色素IV均在280 nm和520 nm附近有最大吸收峰，由此可知，色素I、色素III和色素IV均為花色苷類物質，另外色素III在305 nm波長處有弱的吸收峰，由此說明色素III可能為酰基化的花色苷類物質[21]。

圖 3 經Sephadex LH-20分離純化的4 條色素帶的紫外-可見光譜Fig. 3 UV-Vis absorption spectra of four pigments isolated by Sephadex LH-20 chromatography

2.3 HPLC分析結果

利用HPLC在520 nm波長處將經AB-8大孔樹脂純化后的樣品（樣品1）和經聚酰胺樹脂純化后的樣品（樣品2）進行分析，其色譜結果如圖4所示。

圖 4 純化后樣品在520 nm波長處的HPLC色譜圖Fig. 4 High performance liquid chromatography at 520 nm of purified samples

由圖4a可知，在520 nm條件下，樣品1共檢測出6 種花色苷組分，出峰時間集中在13～22 min范圍內。出峰時間在13.69 min和21.84 min為樣品1中主要的2 種花色苷組分，兩種組分相對含量分別為38.15%和47.62%。其他4 種組分的出峰時間依次為15.51、16.99、19.05、20.04 min，其相對含量分別為2.57%、4.08%、4.05%、3.53%。由圖4b可知，樣品2共檢測出4 種花色苷組分，出峰時間在13.63 min和21.86 min仍為主要的2 種花色苷組分，其相對含量分別為27.58%和69.11%，其他兩峰的出峰時間分別為17.06 min和19.09 min，相對含量分別為2.08%和1.23%。對比樣品1和樣品2中花色苷組分比例發現，樣品經不同純化方法所得的花色苷比例差別較大。其原因是在聚酰胺純化花色苷過程中，一部分花色苷被吸附在聚酰胺樹脂上，從而使得純化后的花色苷組分比例相差較大[22]。聚酰胺對出峰時間在13.69 min的花色苷吸附較為嚴重，原因需要進一步分析。以花色苷比例和分離度為考察因素，將樣品1再經過Sephadex LH-20繼續純化分離。

樣品1經Sephadex LH-20分離純化得到色素I、色素III和色素IV，三者的HPLC圖見圖5，色素I、色素III和色素IV的出峰時間分別為13.73、17.07和21.82 min，分別與樣品1中出峰時間為13.69、16.99、21.84 min的花色苷組分相對應，依據歸一法計算組分的相對含量，在520 nm條件下，3 種花色苷組分的純度分別為98.52%、96.84%和91.36%，采用HPLC-MS聯用技術進一步鑒定以上3 種花色苷組分的結構，另外也說明了Sephadex LH-20具有較好的分離效果。

圖 5 經Sephadex LH-20分離純化后的3 種花色苷組分在520 nm波長處的HPLC圖Fig. 5 High performance liquid chromatography at 520 nm of three anthocyanin components isolated by Sephadex LH-20 chromatography

2.4 超高效液相色譜三重四極桿飛行時間質譜聯用分析結果

為了研究色素I、色素III和色素IV的花色苷組成，采用超高效液相色譜三重四極桿飛行時間質譜對3 種色素的結構進行鑒定。花色苷的結構根據分子離子峰、碎片及標準品的保留時間來確定。3 種花色苷的MS圖見圖6，其鑒定結果如表1所示。

由圖6a1、a2可知，色素I保留時間為2.57 min，MS和MS2信息表明，其分子離子峰[M+]為595.4，在質譜中檢測到兩個碎片離子分別為m/z 449.1和m/z 287.2。m/z 287是矢車菊色素的特征離子，碎片（[M-146]+）對應于花色苷分子中失去一個鼠李糖基所得的碎片，而m/z 287的碎片（[M-146-162]+）對應于m/z 449的碎片上再失去一個己糖基得到的碎片。該研究結果與Liu Liang等[23]研究荔枝皮花色苷和Eguchi等[24]研究蕎麥花色苷中矢車菊-3-蕓香糖苷的質譜信息相一致。因此，色素I被鑒定為矢車菊-3-蕓香糖苷。由圖6b1、b2可知，色素III保留時間為4.87 min，MS和MS2信息表明，其分子離子峰[M+]為801，碎片離子m/z分別為331.1、493.2和639.1。m/z 331是錦葵色素的特征離子，m/z 493對應錦葵色素的單己糖，m/z 639對應錦葵素-香豆酰單己糖，碎片（[M-146]+）對應于香豆酸脫去一分子水后所得的碎片。A440nm/Aλmax的百分比為13.2%，推測色素III為3,5-雙己糖，該研究結果與王維茜等[22]研究刺葡萄皮花色苷和Hong等[25]研究果汁花色苷中的錦葵素-3,5-雙葡萄糖苷-香豆酰的MS信息相一致。因此，色素III被鑒定為錦葵素-3,5-雙葡萄糖苷-香豆酰。這于紫外-可見光譜分析中的色素III可能為酰化的花色苷這一結論相吻合。由圖6c1、c2可知，色素IV保留時間為6.35 min，MS和MS2信息表明，其分子離子峰[M+]為493，碎片離子m/z 331.1。m/z 331是錦葵色素的特征離子，丟失碎片162，可能為葡萄糖和半乳糖，結合文獻[26-27]可知色素IV為錦葵-3-半乳糖苷。

圖 6 3 種花色苷組分一級和二級質譜圖Fig. 6 Mass and tandem mass spectra of three anthocyanin components

表 1 ‘巨峰’葡萄皮花色苷種類鑒定Table 1 Identification of three anthocyanins isolated from kyoho grape skins

2.5 花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞生長增殖抑制作用

色素I、色素III和色素IV對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞的增殖抑制效果如圖7所示。

圖 7 花色苷組分對癌細胞生長抑制作用的劑量效應Fig. 7 Inhibitory effect of anthocyanins on the growth of cancer cells

由圖7可知，3 種花色苷組分處理HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞24 h后，兩種癌細胞的存活率隨3 種花色苷組分質量濃度增加呈現顯著降低的趨勢（P＜0.05）。當花色苷組分質量質量濃度在50 μg/mL時，色素I、色素III和色素IV樣品對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞的存活率分別為（90.01±2.03）%、（85.11±1.86）%、（91.02±1.55）%和（90.03±1.43）%、（83.99±1.89）%、（91.98±1.52）%，而當花色苷組分質量濃度在600 μg/mL時，色素I、色素III和色素IV樣品對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞的存活率分別為（51.98±0.87）%、（46.05±0.92）%、（58.05±0.84）%和（47.97±0.89）%、（42.04±0.82）%、（53.12±0.91）%，前者較后者HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞的存活率分別降低了38.03%、39.06%、32.97%和42.06%、41.95%、38.86%。結果表明，色素I、色素III和色素IV均能顯著抑制HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞的增殖，且質量濃度越大，抑制效果越顯著，表現出顯著的劑量效應。因此，后續實驗3 種花色苷組分的質量濃度均選擇600 μg/mL。對比相對質量濃度花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌存活率發現，色素III對HepG2肝癌細胞和A549肺癌的增殖抑制效果最強，其次是色素I，最低的是色素IV。分析原因是由于色素III中花色苷組分酰基化，酰基化后使得花色苷呈現“三明治”結構，提高花色苷穩定性和生理活性[28]。崔清慧[29]研究同樣發現，酰化的花色苷對抗腫瘤的效果優于未酰化的花色苷。色素I中花色苷的酚羥基數較色素IV多，酚羥基數越多，生理活性越強[30]。因此，色素V對HepG2肝癌細胞和A549肺癌增殖的抑制效果優于色素IV。

2.6 花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞侵襲能力的影響

侵襲能力通常被作為評價腫瘤細胞的重要指標之一。因此，研究3 種花色苷組分（質量濃度為600 μg/mL）對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞侵襲影響，結果如圖8和表2所示。

圖 8 3 種花色苷組分對腫瘤細胞侵襲的影響（200×）Fig. 8 Effect of three anthocyanin components on the invasion of cancer cells (200 ×)

表 2 3 種花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞侵襲能力的影響Table 2 Effects of three anthocyanins on the invasive ability of HepG2 hepatoma cells and A549 lung cancer cells

由圖8和表2可知，分別與HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞對照組相比，3 種花色苷組分處理HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞后，發現穿膜細胞數量明顯降低，侵襲率顯著降低。依據式（3）可計算出對照組、色素I、色素III和色素IV對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞侵襲率分別為100%、（55.81±1.69）%、（19.65±1.24）%、（34.16±0.97）%和100%、（48.18±1.62）%、（14.57±0.79）%、（34.12±1.02）%，分析數據發現，3 種花色苷組分均能顯著抑制HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞侵襲能力，3 種花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞侵襲抑制能力大小順序依次是色素III＞色素I＞色素IV。該研究結果與MTT實驗結果一致。

2.7 花色苷組分對HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞凋亡的影響

3 種花色苷組分（質量濃度為600 μg/mL）處理HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞24 h后，癌細胞凋亡情況如圖9所示。

圖 9 3 種花色苷組分對癌細胞凋亡的影響Fig. 9 Effects of three anthocyanin components on the apoptosis of cancer cells

目前，大量研究證明花色苷提取物具有抗氧化和清除自由基的能力[31]，對癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，加速癌細胞的凋亡[32]。因此，本實驗在MTT和細胞侵襲的基礎上，進一步探究3 種花色苷組分對癌細胞凋亡的影響。由圖9可知，色素I、色素III和色素IV對HepG2肝癌細胞凋亡率分別為（17.90±0.22）%、（30.45±1.39）%和（15.99±0.36）%，與對照組相比，凋亡率分別提高了15.76%、28.31%和13.85%。結果表明，3 種花色苷組分均能顯著提高HepG2肝癌細胞凋亡率，且促進HepG2肝癌細胞凋亡的效果順序依次為色素III＞色素I＞色素IV。Urias-Lugo[33]和Yeh[34]等同樣發現花色苷能顯著提高癌細胞的凋亡，其作用機制是通過上調和下調相關的凋亡蛋白和凋亡因子，從而促進癌細胞凋亡。由圖9d可知，色素I、色素III和色素IV對A549肺癌細胞凋亡率分別為（20.86±0.88）%、（33.66±1.52）%和（17.03±1.04）%，與對照組A549肺癌細胞凋亡率分別提高了20.44%、33.24%和16.61%。結果表明，3 種花色苷組分均能顯著提高A549肺癌細胞的凋亡率，促進癌細胞凋亡的效果順序同HepG2肝癌細胞。這與Chen Peini等[35]研究桑葚花色苷和陳建楊[13]研究特色馬鈴薯花色苷對A549肺癌細胞凋亡的研究結果相似。癌細胞凋亡的研究結果與MTT和細胞侵襲實驗結果一致，進一步說明花色苷組分具有顯著的抗腫瘤活性。

3 結 論

‘巨峰’葡萄皮色素粗提物經AB-8大孔樹脂純化-葡聚糖凝膠Sephadex LH-20純化后，得到4 種組分，其中色素II為非花色苷類，色素I、色素III和色素IV分別為矢車菊-3-蕓香糖苷、錦葵素-3,5-雙葡萄糖苷-香豆酰和錦葵-3-半乳糖苷，其得率和純度分別為（0.108±0.011）%、（0.053±0.007）%、（0.038±0.005）%和98.52%、96.84%、91.36%；而‘巨峰’葡萄皮色素粗提物經AB-8大孔樹脂純化-聚酰胺樹脂純化后，樣品在相同HPLC條件下檢測，花色苷組成比例相差較大，原因需進一步研究。探究色素I、色素III和色素IV對抗腫瘤活性的影響發現，3 種花色苷組分均能顯著抑制HepG2肝癌細胞和A549肺癌細胞的增殖和侵襲能力，并且顯著增加癌細胞的凋亡。3 種花色苷組分的抗腫瘤效果順序依次為色素III＞色素I＞色素IV。研究結果為花色苷分離鑒定及天然抗腫瘤藥物的開發提供理論依據。