基于轉錄組技術研究藻藍蛋白在抑制非小細胞肺癌中的調控作用

郝 帥，李 爽，王 靜，吳婷婷，張佳雯，王成濤

（北京市食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

藻藍蛋白源于螺旋藻、藍藻、紅藻等海洋生物，是一種天然無毒的藻類蛋白質[1]。由于其水溶性好、顏色鮮亮等特點，藻藍蛋白作為公認的食品著色劑被廣泛應用于多種食品行業中；近年來研究表明，藻藍蛋白可以作為一種功能因子參與腫瘤抑制、減輕炎癥、抵抗氧化損傷和衰老等多種生理調控過程，并且不產生毒副作用[2-5]。有研究報道，藻藍蛋白對肺癌、乳腺癌、肝癌、以及黑色素瘤等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[6-12]。藻藍蛋白生物活性的發現引起了廣大研究者的極大興趣，在海洋類功能性食品的開發和利用方面具有重要的研究價值。

近年來，汽車尾氣的排放、工業廢氣污染以及PM2.5霧霾的擴散等環境問題日益嚴重，這些環境污染會對人體肺部造成巨大損傷并引起癌變。由于肺癌細胞易發生遠端轉移，使得肺癌成為目前全球第一大惡性腫瘤，發病率和致死率在各類腫瘤中占據首位[13]。而隨著我國人口老齡化程度加劇，1998年—2015年，我國的肺癌發病率與死亡率始終保持逐年上升的趨勢，肺癌已經成為危害我國居民健康最主要的惡性腫瘤[14-15]。肺癌的病理分型按組織學可分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類，近年被診斷的肺癌中，約85%屬于非小細胞肺癌[16-17]。因此，尋找與肺癌發生、轉移過程相關的蛋白，研究藻藍蛋白在肺癌中的生物學功能，深入探索其作用機制，可為非小細胞肺癌的診斷、預防甚至治療提供思路與依據。

轉錄組學技術（RNA-seq技術）是近年來發展起來的轉錄水平測序技術，具有高通量、成本低、準確性高等優勢。目前，轉錄組技術已經用于多種腫瘤模型中關鍵基因的篩選和調控機制研究中，具有鮮明的技術優越性。例如，Jian Jinlong等采用轉錄組技術研究了p204蛋白的抗腫瘤調控機制[18]；Aldaz等利用轉錄組技術對野生型與p53突變型的乳腺癌小鼠進行了差異基因的篩選，發現了一系列p53所調控的新基因[19]。此外，Ying Jun等同樣采用了轉錄組技術探究了藻藍蛋白在抑制卵巢癌SKOV-3細胞增殖中的調控機制，他們發現p53信號通路活性的改變可能是藻藍蛋白抑制卵巢癌的一條重要途徑[20]。本研究以一株典型的非小細胞肺癌H460細胞為模型，采用轉錄組技術對藻藍蛋白在H460細胞中的潛在靶點進行分析，以期揭示藻藍蛋白的抗肺癌機制，為非小細胞肺癌的治療和功能性食品添加劑藻藍蛋白的開發提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人類非小細胞肺癌H460細胞系，購于美國模式培養物集存庫，保存于北京市食品添加劑工程技術研究中心。

藻藍蛋白標準品 美國Envirologix公司；DMEM細胞培養基 美國Gibco公司；胎牛血清 天津康源生物技術有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 天根生物技術有限公司；TRIzol試劑 北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

細胞培養箱 德國Heraeus公司；漩渦振蕩儀德國IKA公司；超凈工作臺 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；數字型電子天平 德國Sartorius公司；CFX96Touch熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Bioanalyzer 2100核酸檢測儀 美國安捷倫公司；RNA-seq高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

非小細胞肺癌H460細胞培養于含有體積分數10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素以及100 units/mL青霉素的DMEM培養基中，培養條件為37 ℃、5% CO2。細胞每3～4 d傳代一次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3.2 細胞存活率實驗

收集處于對數生長期的H460細胞，胰酶消化，以每孔5 000 個細胞量鋪于96 孔板中，放置培養箱中培養12 h，分別加入終濃度為0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol/L（質量濃度分別為0、20、40、80、160、320 mg/L）的藻藍蛋白，繼續放置培養箱培養48 h后，加入10 μL MTT溶液（儲備液質量濃度為5 mg/mL）孵育4 h，加入100 μL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-HCl裂解液繼續孵育12 h，檢測570 nm波長處吸光度，統計數據并根據下式計算藻藍蛋白作用細胞48 h的細胞存活率（R）。

1.3.3 細胞生長曲線測定

將處于對數生長期的細胞接種于96 孔板（5×104個/孔）12～16 h，細胞貼壁生長后添加終濃度為4.8 μmol/L藻藍蛋白處理，并加入10 μL的MTT（儲備液質量濃度為5 mg/mL），4～6 h后加入100 μL的SDS-HCl裂解液，12 h后測定570 nm波長處吸光度。以生長時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.3.4 克隆實驗

取對數期細胞接種于6 孔板（2×102個/孔），置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h待細胞完全貼壁，隨后分別采用濃度為0、2.4、4.8、9.6 μmol/L的藻藍蛋白處理細胞。培養2～3 周，當6 孔板中形成大約50 個克隆數時終止培養，并用吉姆薩染液染色計數克隆數。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

取生長狀態良好的細胞接種在T25培養瓶中培養24 h，分別加入0、2.4、4.8 μmol/L的藻藍蛋白處理72 h，胰酶消化后在室溫1 000 r/min離心10 min，用100 μL雙染孵育液將洗干凈的細胞沉淀重懸，加入5 μL AnnexinV-FITC染液，再加入5 μL 7-AAD染液，冰上20 min避光染色。充分混勻后上機檢測細胞的凋亡情況，統計早期凋亡、晚期凋亡的細胞比例。

1.3.6 用于轉錄組測定的H460細胞的前處理

前一天晚上將H460細胞進行傳代處理，細胞密度大約50%左右。第二天待細胞完全貼壁后，采用藻藍蛋白處理細胞（其中對照組采用相同體積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）處理細胞），每個處理組做3 個生物學平行組，藻藍蛋白處理48 h后收集細胞進行后續實驗。研究結果中1～3號樣本為對照組；4～6號樣本為藻藍蛋白處理組。

1.3.7 細胞cDNA文庫的構建

在4 ℃條件下，采用TRIzol試劑提取H460細胞總RNA。RNA樣本濃度和純度采用Bioanalyzer 2100核酸檢測儀測定，其中滿足OD260nm/OD280nm≥1.8、OD260nm/OD230nm≥1.5并且RNA完整度數量（RNA integrity number，RIN）≥8.0條件的RNA樣本可用于后續實驗。隨后在RNA樣本中加入破碎液將mRNA斷裂成碎片，隨后用于反轉錄合成cDNA的第一條鏈；cDNA第二條鏈利用dNTPs，RNA酶H以及DNA聚合酶進行合成。雙鏈cDNA隨后進行末端修復和連接，凝膠純化后采用PCR擴增技術構建cDNA文庫。

1.3.8 RNA-seq測序以及生物信息學分析

轉錄組測序采用5 μg RNA樣品進行實驗。原始讀長中去除含有測序引物以及低質量的讀長后，進行序列拼接形成高質量的讀長片段。采用TopHat將高質量的讀長片段與人類基因組序列進行比對，隨后通過UCSC基因組數據庫進行序列注釋。通過非冗余蛋白質數據庫、非冗余序列和SwissProt數據庫，運用BLAST算法以E值10-5為限定條件進行序列的同源性比對。轉錄組分析獲得的轉錄本和基因采用GO聚類、KEGG聚類進行分析，確定轉錄本的功能信息。

1.3.9 差異基因的表達分析

差異基因表達量（differentially expressed genes，DEGs）利用RSEM 1.2.31軟件進行分析，該方法基于每百萬讀長中來自于某基因每千堿基長度的片段數（fragments per kilobases per millionreads，FRKM）的方法進行計算，獲得基因表達量FRKM。基因的差異比對采用DESeq軟件進行分析，對DESeq檢測結果按照差異顯著性標準（差異基因的表達量變化高于2 倍且錯誤發現率指標小于0.05）進行篩選，統計基因顯著性差異表達調節的情況。

1.3.10 實時熒光定量PCR檢測基因的表達

采用5 μmol/L藻藍蛋白處理H1299細胞48 h后，利用TRIzol法提取細胞總RNA進行定量PCR的檢測。2 μg總RNA用于進行反轉錄，獲得cDNA，采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒進行檢測（GAPDH作為內參）。基因的相對表達量采用2－ΔΔCt法進行計算，每個樣本進行4 個生物學重復。其中定量PCR的引物設計如表1所示。

表 1 用于定量PCR反應的引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.11 Western Blot檢測

收集細胞，加入適量體積的RIPA裂解液進行細胞裂解和蛋白抽提；利用Bradford法測定其濃度。將蛋白采用質量分數12%的SDS分離膠進行分離，隨后進行轉膜處理；轉膜結束后，根據目的條帶大小剪膜，用5%脫脂奶粉封閉目的條帶1.5 h、孵育一抗過夜。第2天于37 ℃恒溫靜置孵育二抗1 h，經TBST溶液清洗3 次，孵發光液顯色，洗片機曝光目的條帶蛋白，掃描儀掃描膠片并保存圖片。

1.4 數據統計分析

實驗數據均以平均值±標準差表示，采用SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析，其中P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 藻藍蛋白對H460細胞生長的抑制作用

圖 1 藻藍蛋白對H460細胞生長的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of phycocyanin on H460 cell growth

首先采用藻藍蛋白處理正常培養的H460細胞，利用細胞存活率、細胞增殖和集落形成實驗檢測藻藍蛋白對細胞增殖的影響。圖1A顯示，隨著藻藍蛋白濃度的增加，細胞存活率出現濃度依賴性下降，4.8 μmol/L和9.6 μmol/L濃度處理能夠引起細胞存活率發生極顯著降低；圖1B顯示藻藍蛋白能夠顯著降低細胞的體外增殖能力；圖1C顯示，隨著藻藍蛋白濃度的增加，細胞的群落形成能力逐漸降低。以上結果均表明藻藍蛋白能夠顯著抑制非小細胞肺癌H460的體外增殖能力。

2.2 藻藍蛋白對H460細胞凋亡的影響

圖 2 藻藍蛋白對H460細胞凋亡的影響Fig. 2 Effect of phycocyanin on the apoptosis of H460 cells

采用細胞形態學觀察、流式細胞術和Western Blot實驗檢測了藻藍蛋白對H460細胞凋亡的影響。圖2A顯示，藻藍蛋白處理后，細胞生長狀態發生改變，正常貼壁生長的細胞數量明顯降低；隨后采用流式細胞術對處理后細胞的凋亡比例進行了檢測，圖2B顯示，隨著藻藍蛋白濃度的增加，H460細胞早期和晚期凋亡的比例顯著增加；同時，圖2C顯示，藻藍蛋白能夠增加促凋亡蛋白Bax和Bad的表達量。以上結果表明，藻藍蛋白不僅能抑制H460細胞的生長，還能夠顯著促進細胞的凋亡。為了進一步探究藻藍蛋白在H460細胞中的調控機理，對藻藍蛋白處理前后的H460細胞進行了高通量轉錄組測序研究。

2.3 RNA質量控制

表型實驗結果表明，4.8 μmol/L濃度的藻藍蛋白已經能夠引起H460細胞的生長和凋亡發生極顯著改變，因此，采用此濃度進行H460細胞的轉錄組學分析。采用1.3.6節方法將藻藍蛋白與PBS對照分別處理正常培養的H460細胞，48 h后收集細胞提取總RNA用于轉錄組學分析。首先對細胞總RNA的純度和完整度等指標進行了檢測。圖3分別采用核酸凝膠電泳和核酸分析儀對RNA的完整性進行了檢測，結果顯示，RNA 18S和28S亞基條帶清晰，并且在相應的時間出峰完整，集中程度高；表2顯示了RNA質量控制的基本參數，6 個樣本的RNA總量均超過15 μg，OD260nm/OD280nm大于1.8，OD260nm/OD230nm大于1.5，RNA 完整值（RNA integrity number，RIN）均大于8，表明RNA樣本完整，沒有發生降解，并且純度和濃度較高，可以進行后續轉錄組學測序分析。

圖 3 細胞總RNA的完整度檢測Fig. 3 Integrity analysis of total bacterial RNA

表 2 RNA質量控制基本參數Table 2 Essential parameters of RNA quality control

2.4 差異基因的篩選分析結果

采用高通量轉錄組測序技術對藻藍蛋白處理組與對照組的H460細胞中的差異基因進行了篩選。由圖4可知，共獲得了2 532 個表達量顯著差異的基因，其中顯著上調基因1 491 個，占差異基因總數的58.9%；顯著下調基因1 041 個，占差異基因總數的41.1%。

圖 4 藻藍蛋白處理后差異基因模式散點圖Fig. 4 Scatter diagram of differentially expressed genes induced by phycocyanin treatment

為了進一步研究藻藍蛋白對H460細胞的調控作用，對差異基因進行了GO功能分析。表3顯示了GO分析中差異基因參與的排名前10 位的生物學過程。其中，差異基因主要調控了細胞增殖負調控過程、細胞程序性死亡調控、細胞凋亡過程的調控、細胞因子應答反應這幾類生物學過程。目前，已有一些研究表明，藻藍蛋白能夠抑制另一類非小細胞肺癌A549細胞的增殖[21-23]，而本研究的分析結果進一步證實了前期的報道，也反映了轉錄組測序結果的客觀性和準確性。

表 3 排名前10位的差異基因的GO功能分析Table 3 Top 10 ranked differentially expressed genes in GO analysis

2.5 差異基因的聚類分析結果

差異基因在不同樣本中具有不同的表達量，表達模式相似的基因通常具有功能的相關性，因此根據差異基因的表達情況進行了聚類分析。圖5顯示了2 532 個差異基因的聚類分析結果，根據表達量的不同，除9 個基因不具有明顯的表達規律以外，大部分差異基因能夠聚成4大類，分別為：表達顯著下調的基因類別A（1 022 個基因），表達顯著上調的基因類別B（1 393 個基因），表達極顯著下調的基因類別C（14 個基因），以及表達極顯著上調的基因類別D（94 個基因），4 類基因的表達模式如圖6所示。

在這些差異基因中，挑選出了10 個感興趣的差異基因并進行了分類，結果發現，Cdk2、Cdc25、PCNA、TLR4等影響細胞增殖的基因均出現了顯著下調（A類）；p27、p21等抑制細胞增殖的基因出現了顯著上調（B類）；Bcl-2、NKD1等癌基因出現了極顯著下調（C類）；而CCT6、GBP2等促凋亡基因出現了極顯著上調（D類）。這10 個差異基因的轉錄組分析結果如表4所示。這些結果表明，藻藍蛋白能夠調控PCNA等多種基因的表達而抑制H460細胞的增殖，并促進其的凋亡。研究結果為探究藻藍蛋白在非小細胞肺癌中的調控提供了參考，也為肺癌治療提供了潛在的靶點。

圖 6 4 類差異基因表達的聚類模式圖Fig. 6 Four cluster patterns of differentially expressed genes

表 4 10 個感興趣差異基因的轉錄組表達情況Table 4 RNA-seq analysis of 10 differentially expressed genes

2.6 定量PCR驗證差異基因的表達

對篩選得到的上述幾個關鍵基因進行了定量PCR的驗證。如圖7所示，細胞周期調控基因Cdk2、Cdc25、PCNA以及TLR4在藻藍蛋白處理后出現了顯著下調，周期抑制基因p27和p21則出現了上調；促凋亡基因CCT6和GBP2在藻藍蛋白處理后出現了顯著上調，而抑凋亡基因Bcl-2和NKD1的表達趨勢出現了相反的情況。此結果與轉錄組測序的基因表達量結果相一致，進一步證實了這些關鍵調控基因的表達受到了藻藍蛋白的調控，進而引起了H460細胞的增殖抑制和凋亡效應，為解釋藻藍蛋白在非小細胞肺癌的調控機制提供了重要的理論依據。

圖 7 差異基因的定量PCR結果Fig. 7 qPCR analysis of differentially expressed genes

2.7 藻藍蛋白調控H460細胞的信號通路分析結果

圖 8 差異基因的KEGG富集分析Fig. 8 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

采用KEGG數據庫對差異基因可能參與的信號通路進行了富集分析，圖8顯示了富集程度排在前20位的信號通路。結果表明，在篩選得到的差異基因中，主要參與了與腫瘤生長和凋亡相關的TNF信號通路、IL-17信號通路、Wnt信號通路、NF-κB信號通路以及PI3K-Akt信號通路等。其中PI3K-Akt信號通路所含有的差異基因的數量最多。Kim等通過研究發現，p21可以作為一個下游調控因子參與Akt信號通路，從而調節細胞周期[24]，Chen等也在血細胞癌U937細胞中發現Akt與p21具有相互調控的效應[25]，這表明藻藍蛋白可能通過調控Akt信號通路影響細胞周期進程，進而抑制H460細胞的增殖。此外，也有相關研究報道Akt與Bcl-2在卵巢癌、胃癌和喉癌中具有相互調控的作用[26-28]，表明Akt也參與了細胞凋亡過程。因此，KEGG分析表明Akt可能是藻藍蛋白調控H460細胞增殖和凋亡的一個重要途徑。

此外，在轉錄組分析結果中，一些典型的參與Akt信號通路的上游調控因子如TLR2、TLR4以及IRS1也被作為差異基因刪選出來，它們的轉錄組分析結果如表5所示。藻藍蛋白處理后，這些基因的轉錄水平出現了極顯著下調。隨后，對其中2 個差異基因（TLR2和TLR4）以及PI3K-Akt信號通路中的兩個經典蛋白AKT和磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的磷酸化水平進行了檢測（圖9）。PTEN是一種非常重要的腫瘤抑制蛋白，同時也是PI3K-Akt信號通路的抑制子，磷酸化后被激活[29-30]。圖9顯示，藻藍蛋白處理H460細胞后，TLR2、TLR4和IRS1的蛋白水平出現了明顯降低，與轉錄組結果一致，同時，PTEN的磷酸化水平出現了顯著增加，并且Akt的磷酸水平出現了顯著降低。以上研究結果表明，藻藍蛋白能夠顯著降低PI3K-Akt信號通路的活性，進而對細胞增殖起到抑制作用。

表 5 與Akt信號通路相關的3 個差異基因的轉錄組表達情況Table 5 RNA-seq analysis of 3 differentially expressed genes related to Akt signal pathway

圖 9 藻藍蛋白處理H460細胞后Akt信號通路的檢測Fig. 9 Akt pathway analysis in H460 cells after phycocyanin treatment

3 結 論

本研究以高通量轉錄組技術為研究手段，對藻藍蛋白處理后的H460細胞進行了轉錄組測序。結果表明，藻藍蛋白處理后，共篩選得到2 532 個表達量顯著差異的基因，其中顯著上調基因1 491 個，占差異基因總數的58.9%；顯著下調基因1 041 個，占差異基因總數的41.1%。這些差異基因主要參與了細胞增殖和凋亡相關的生物學調控過程；對差異基因進行聚類分析顯示，4 類不同的基因表達模式被聚類，包含了與細胞增殖和凋亡相關的重要基因：Cdk2、Cdc25、PCNA、TLR4、p27、p21、CCT6、GBP2、Bcl-2、NKD1；定量PCR驗證結果顯示，差異基因的表達趨勢與轉錄組結果一致；此外，差異基因的KEGG富集分析顯示，藻藍蛋白能夠參與調控TNF、IL-17、Wnt、NF-κB以及PI3K-Akt等信號通路，其中PI3K-Akt信號通路富集的差異基因數量最多；Western Blot結果進一步確認了藻藍蛋白能夠顯著降低H460細胞中Akt信號通路的活性，進而抑制細胞增殖并促進凋亡。本研究全面探究了藻藍蛋白在H460細胞中的調控機制，為抗腫瘤類功能性食品因子的開發和利用提供了重要的依據，同時也為非小細胞肺癌的靶向治療提供了理論參考。