榆干離褶傘溶栓酶對酒精損傷血管內皮細胞的保護作用

李芳芳，叢 賀，沈明花

（延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002）

酒精作為各種酒類飲品的主要成分，與心腦血管疾病的發生密切相關。長期大量飲酒可引起血壓的升高[1-2]、脂質代謝的紊亂及心肌細胞的損傷，從而增加罹患心血管疾病的風險和心血管疾病意外的發生[3-6]。血管內皮細胞作為血管系統的重要組成部分，在心血管疾病的病理生理過程中起至關重要的作用。血管內皮細胞不僅起到機械屏障作用，還通過分泌一些活性物質參與機體的凝血及血管的舒縮等反應[7-8]。飲酒后，經胃腸道的吸收進入血液循環的酒精可直接作用于血管內皮細胞。酒精對血管內皮細胞具有雙向調節作用，低劑量酒精可以保護血管內皮細胞[9]，而高劑量則起到抑制作用[10]。研究表明，血管內皮細胞通過自身的乙醇脫氫酶及多種氧化酶的催化作用參與酒精的代謝過程[11-12]。當長期大量飲酒時，血管內皮細胞作為血管最內層結構，直接接觸血液中的酒精或其代謝產物，因此成為直接或間接遭受酒精毒性作用的靶點。

榆干離褶傘（Lyophyllum ulmarium），又名榆生離褶傘、榆干側耳、大榆蘑等，主要分布于河北、吉林、黑龍江、河南等地。研究發現，榆干離褶傘具有抗氧化[13]、保肝[14]、溶栓、降血脂[15]等作用。榆干離褶傘溶栓酶（fibrinolytic enzyme from Lyophyllum ulmarium，LUFE）是從榆干離褶傘菌絲體中分離純化的分子質量為50 kDa的溶栓酶，它在體外可以水解纖維蛋白及纖維蛋白原[16]。近年來的研究表明，LUFE具有保護血管內皮細胞[17]、抑制血小板活化作用[18]。鑒于大量飲酒對血管內皮細胞的危害性，本實驗將以酒精誘導血管內皮細胞的損傷，探討LUFE對酒精所致血管內皮細胞損傷的保護作用，旨在為榆干離褶傘對心腦血管系統保護作用的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 武漢博士德生物工程有限公司；LUFE（比活力為750.6 U/mg pro）由延邊大學醫學院生物化學與分子生物學研究室分離純化[16]。

澳洲胎牛血清和DMEM培養基 美國Gibco公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）、雙氫羅丹明123（dihydrorhodamine 123，DHR123） 美國Sigma公司；吖啶橙/溴化乙啶（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）雙染色試劑盒北京索萊寶生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒 碧云天生物技術公司；兔抗細胞色素c、cleaved半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-3、cleaved caspase-9、Bax和Bcl2抗體 美國Santa Cruz公司；乙醇 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RT-2100型酶標儀 深圳雷杜公司；激光共聚焦顯微鏡SP5II 德國徠卡儀器有限公司；二氧化碳細胞培養箱 美國Shel Lab公司；凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

HUVECs培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3.2 LUFE對HUVECs活力的影響

將細胞密度為1×105/mL的HUVECs接種到96 孔板中，分為對照組、損傷組、LUFE低劑量組和LUFE高劑量組，每組設8 個復孔。待細胞貼壁后棄去陳舊培養液。損傷組及LUFE各劑量組均加入含200 mmol/L乙醇的無血清培養液，以誘導內皮細胞的損傷。對照組以等容生理鹽水代替乙醇。乙醇作用4 h后，LUFE低、高劑量組分別加入1 μg/mL和4 μg/mL的LUFE，對照組和損傷組以無血清培養基代替LUFE。培養24 h后，MTT法[17]測定490 nm波長處的OD值（OD490nm），按照下式計算各組HUVECs存活率。

將細胞接種于6 孔板，細胞分組與處理同上。將各組細胞培養24 h后，取上清液檢測LDH活力，其操作按試劑盒說明書進行。

1.3.3 SOD、GSH-Px活力及MDA含量的檢測

將細胞接種于6 孔板，細胞分組與處理同1.3.2節。各組細胞培養24 h后用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞兩次，用細胞刮板刮下細胞，1 000 r/min離心10 min。棄去上清液，收集細胞，反復凍融破碎細胞。再次離心10 min，取上清液，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。按試劑盒說明書測定細胞裂解液的SOD、GSH-Px活力及MDA含量。

1.3.4 細胞ROS水平的檢測

細胞ROS水平的檢測采用DHR123染色法。將細胞接種于6 孔板，細胞分組及處理同1.3.2節。將各組細胞培養12 h后用胰蛋白酶消化，各組收集1×106個細胞，用PBS重懸，然后以終濃度為1 μmol/L的DHR123避光條件下孵育45 min。收集細胞，以PBS漂洗2 次，重懸后在激發波長488 nm、發射波長525 nm條件下在流式細胞儀檢測各樣本平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI），該值代表細胞ROS水平。

1.3.5 AO/EB染色法觀察細胞凋亡

取對數生長期細胞接種于6 孔板爬片內，細胞分組及處理同1.3.2節。培養24 h后用PBS洗滌，加入20 μL/mL AO/EB工作液（100 mg/L AO和100 mg/L EB等體積混合液），室溫染色5 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6 細胞跨膜電位的檢測

跨膜電位檢測采用Rh123染色法。實驗分組及處理過程同1.3.2節。10 μg/mL的Rh123染液代替1 μmol/L的DHR123，其余操作同1.3.4節。用流式細胞儀檢測細胞的MFI，該值代表細胞的跨膜電位。

1.3.7 Western blot法檢測細胞細胞色素c、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達

將細胞接種于6 孔板，實驗分組及處理方法同1.3.2節。將各組細胞培養24 h后分別收集細胞，加入裂解液在4 ℃靜置30 min后以12 000 r/min離心20 min。取上清液，使用BCA法進行蛋白定量。取40 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電轉至聚偏氟乙烯膜，質量分數5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后分別加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h，沖洗，最后顯影。

1.4 數據統計分析

數據用 ±s表示，用SPSS統計軟件處理，流式細胞儀分析結果中熒光強度及其他實驗結果的差異性比較采用單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 LUFE對細胞活力的影響

表 1 LUFE對細胞存活率和LDH活力的影響Table 1 Effect of LUFE on viability and LDH activity in HUVECs

如表1所示，與對照組相比，損傷組細胞存活率明顯下降，細胞培養上清液LDH活力升高；與損傷組相比，LUFE低、高劑量組細胞存活率不同程度地升高、細胞培養上清液LDH活力下降，結果表明，LUFE對酒精誘導的HUVECs的損傷具有保護作用。

2.2 LUFE對細胞SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響

表 2 LUFE對細胞SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響Table 2 Effect of LUFE on SOD and GSH-Px activity and MDA contents

由表2可知，與對照組比較，損傷組細胞的SOD和GSH-Px活力極顯著降低，而MDA水平極顯著升高（P＜0.01）。與損傷組相比，LUFE高劑量組SOD和GSH-Px活力極顯著升高，MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。

2.3 LUFE對細胞ROS的影響

細胞中產生的ROS可將DHR氧化成Rh123而發出熒光，其熒光強度反映細胞內ROS水平。對照組（圖1A）細胞的熒光強度平均值為286.80，損傷組（圖1B）的熒光強度為484.97，是對照組的1.7 倍，這就說明酒精作用后細胞內ROS水平極顯著升高（P＜0.01）。LUFE低、高劑量組細胞熒光強度平均值分別為396.66、356.43，與損傷組相比不同程度地減少，差異顯著（P＜0.05）（圖1C、D）。這就提示LUFE可以抑制酒精所致的ROS水平的升高。

圖 1 LUFE對細胞ROS的影響Fig. 1 Effect of LUFE on intracellular ROS level

2.4 LUFE對細胞線粒體跨膜電位的影響

用Rh123染色，以流式細胞儀檢測線粒體跨膜電位。圖2顯示，與對照組（910.21）相比，損傷組的細胞熒光強度下降至633.42，差異極顯著（P＜0.01），這就說明酒精作用以后細胞線粒體跨膜電位顯著降低。而LUFE低、高劑量組的熒光強度分別為828.52、896.21，與損傷組相比極顯著升高（P＜0.01），并隨著用藥劑量的增加呈升高趨勢。

圖 2 LUFE對細胞內線粒體跨膜電位的影響Fig. 2 Effect of LUFE on mitochondrial transmembrane potential in HUVECs

2.5 細胞AO/EB染色結果

AO/EB染色中AO透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光。在凋亡細胞中因染色質固縮或斷裂，因此AO使其染上致密濃染的黃綠色熒光。EB僅能透過破損的細胞膜嵌入DNA而呈橘紅色。AO/EB染色結果表明，對照組的細胞形態正常，細胞核發出綠色均勻熒光。損傷組細胞數明顯減少，細胞呈現凋亡形態學改變-細胞核固縮、呈濃染的黃綠色熒光。與損傷組相比，LUFE低、高劑量組細胞數量增多，凋亡細胞明顯減少，這一結果表明LUFE能抑制酒精所致的HUVECs凋亡（圖3）。

圖 3 LUFE對酒精誘導的HUVECs凋亡的影響（×200）Fig. 3 Effect of LUFE on apoptotic morphology in HUVECs induced by alcohol (× 200)

2.6 LUFE對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

圖 4 LUFE對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of LUFE on the expression of Bax and Bcl-2 in HUVECs

如圖4所示，與對照組相比，損傷組Bax表達增加，而Bcl-2表達減少，具有顯著性差異。與損傷組相比，LUFE低、高劑量組Bax表達略減少，而Bcl-2表達明顯增加，這就說明LUFE降低Bax/Bcl-2比值，即具有抗凋亡作用。

2.7 LUFE對細胞色素c、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表達的影響

與對照組相比，損傷組細胞色素c、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表達均增加。與損傷組相比，LUFE低、高劑量組細胞細胞色素c、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表達均減少，并隨著劑量的增加，其表達程度越低（圖5）。

圖 5 LUFE對細胞色素c、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of LUFE on the expression of cytochrome c, cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 in HUVECs

3 討 論

長期過量飲酒是心血管病的危險因素[19]。研究表明過量飲酒可引起酒精性心肌病[20]、心血管意外等[21]。心血管系統是酒精作用的主要靶器官之一。在心血管疾病的發生過程中內皮細胞的損傷起重要作用。酒精代謝過程中產生的大量ROS[22-23]，引發氧化應激，氧化損傷細胞膜、DNA、酶、蛋白質等結構[24]，最終引起細胞凋亡或細胞壞死[25-26]。在前期研究中發現LUFE對過氧化氫誘導的氧化應激有保護作用[17]，由此設想LUFE是否對酒精誘導的HUVECs損傷有保護作用。為此，本實驗探討了LUFE對酒精干預后的HUVECs的影響及其相關機制。

實驗結果表明，酒精作用后血管內皮細胞的存活率下降、細胞培養上清液LDH漏出量增多。同時對細胞凋亡的檢測結果（AO/EB染色結果）顯示，酒精作用后細胞數減少、其形態發生變化、部分細胞發生凋亡。而LUFE干預后細胞存活率上升，凋亡細胞數明顯減少，提示LUFE對酒精誘導的細胞損傷具有保護作用。

酒精在代謝過程中產生大量ROS，引起組織細胞的損傷。本實驗中酒精作用后ROS水平顯著升高。高水平的ROS消耗大量抗氧化酶，導致SOD、GSH-Px活力下降；同時因活性氧所致的脂質過氧化作用增強，引起其產物MDA水平增高。本研究中，不同劑量LUFE作用于損傷HUVECs后抑制ROS的生成，說明LUFE可通過降低ROS水平，來保護酒精所致的內皮細胞氧化應激損傷。SOD、GSH-Px水平是反映機體氧化應激反應的重要指標，其水平的高低反映機體的抗氧化能力。LUFE干預后提高SOD、GSH-Px活力，同時抑制脂質過氧化作用，這提示LUFE可能通過提高抗氧化酶活力來抑制ROS的生成。

線粒體是ROS產生的主要場所，也是容易受ROS攻擊的目標[27]。酒精可損傷mtDNA，影響細胞能量代謝、增加ROS的生成[28]。本實驗中，酒精代謝過程中產生的大量ROS破壞線粒體膜的完整性，降低線粒體跨膜電位，這與其他文獻結果一致[29]。研究表明，線粒體膜電位下降是線粒體途徑細胞凋亡發生的早期事件之一[30]。本實驗中酒精作用后促凋亡蛋白Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，而這種Bax/Bcl-2比值的增加引起線粒體膜通透性轉換孔的開放，細胞色素c釋放到胞質中，后者通過介導凋亡復合體的生成，促進cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的活化而啟動線粒體途徑的細胞凋亡。本研究結果表明，LUFE降低Bax/Bcl-2比值，提高線粒體跨膜電位，抑制線粒體細胞色素c釋放，從而抑制cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的活化，即抑制線粒體途徑的細胞凋亡。

綜上所述，LUFE對酒精所致的血管內皮細胞有保護作用，其機制可能與其抗氧化、抑制酒精誘導的線粒體途徑細胞凋亡有關。