6 種5,7-二羥基黃酮對巨噬細胞M1極化的影響

鄭夢菲，劉 健，屈 瑋

（合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009）

巨噬細胞是機體最重要的免疫細胞之一，在炎癥反應中發揮著重要作用，而炎癥又與代謝性疾病的發生與發展息息相關[1-3]。在不同的微環境影響下，巨噬細胞可以極化為不同的亞型，發揮不同的作用[4]。在體外培養條件下，不同的刺激方式也可以誘導巨噬細胞向不同方向極化。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以誘導巨噬細胞轉化為經典活化型巨噬細胞，也稱作M1型巨噬細胞[5]。LPS通過與細胞膜表面Toll樣受體4結合，進而激活炎癥信號通路，促進細胞高表達表面抗原分化簇（cluster of differentiation，CD）274、CD38、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），并且分泌多種促炎性因子，如白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP1）等[6-8]。

黃酮類化合物泛指由2 個苯環（A環與B環）通過中間三碳原子相連而成的一系列化合物（圖1），水果、蔬菜以及茶、紅酒等植物來源的飲品是人體攝取黃酮類化合物的主要食物來源[9-10]。黃酮類化合物根據其結構不同可分類為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、異黃酮類等亞型[11]。有研究報道，目前發現數目最多且最常見的天然黃酮主要是黃酮類和黃酮醇類，木犀草素、芹菜素、白楊素和槲皮素、楊梅素、山柰酚是食物中最常見的黃酮類和黃酮醇類化合物[9,12]。另一方面，這6 種黃酮類化合物還都具有5,7-二羥基黃酮的結構特征，如圖1所示，它們的結構差異僅在于C環3位有無羥基取代和B環上的羥基取代數目不同。

圖 1 6 種黃酮的結構Fig. 1 Chemical structures of six flavonoids

本研究以LPS刺激RAW264.7細胞建立炎癥模型，考察木犀草素、芹菜素、白楊素、槲皮素、楊梅素及山柰酚這6 種最為常見的食物源黃酮抑制巨噬細胞向M1極化的活性強弱，并探究其抗炎活性與結構特征的關系，為黃酮化合物抗炎的構效關系研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7 中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。

木犀草素（純度≥98%，生產批號Lot.RQ3018R205） 上海華壹生物科技有限公司；芹菜素（純度≥98%） 南京春秋生物工程有限公司；槲皮素（純度≥95%，生產批號Lot. SLBH4526V）、楊梅素（純度≥99%，生產批號Lot. BCBS7165V）、山柰酚（純度≥97%，生產批號Lot. BCBS9762V）、白楊素（純度≥97%，生產批號Lot. STBF6934V）（均為色譜純）及二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、LPS、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；APC標記鼠抗CD274、PE標記鼠抗CD38美國BioLegend公司；β-actin抗體、核因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa-B，IκB）α抗體、pIκBα抗體、二抗 美國Cell Signaling Technology公司；TRIzol、逆轉錄試劑盒、SYBR Green Mix 日本TaKaRa公司；異丙醇、氯化鈉等其他試劑（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司；Forma Series II Water Jacket細胞培養箱、Multiskan GO全波長酶標儀 美國Thermo Scientific公司；MoFlo XDP流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司；Mini-PROTEAN Tetra Western blot電泳轉膜儀、IQ2熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；ImageQuantLAS 400 mini熒光成像系統 瑞典GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

采用含10% FBS的DMEM高糖培養基，將RAW264.7細胞于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3.2 MTT法檢測細胞活性

(3)良好的前期旅游基礎優勢。主題文化游、鄉村休閑游、農耕體驗游、現代工業游等旅游業態基本形成，豐富了旅游內涵，為大力發展全域旅游打下了堅實的基礎。長沙市望城區將旅游景點與體育賽事結合，已舉行千龍湖國際龍舟賽、黑麋峰世界自行車速降賽、環法自行車中國賽等具有國際影響力的體育賽事。寧鄉市統籌規劃美麗鄉村建設，已打造關山古鎮、湘都農業生態園、豐收灣、稻花香農趣園、石侖關等特色鄉村旅游產品，而且寧鄉的灰湯已于2016年獲批全國首批“國家康養旅游示范基地”。長沙縣的開慧鎮則結合“楊開慧故居”和“瓜果采摘體驗游”，形成了“紅色旅游+綠色旅游”的特色旅游路線。

將RAW264.7細胞接入96 孔板中，細胞貼壁后，分別加入終濃度20 μmol/L的6 種黃酮溶液（DMSO配制），培養24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液繼續孵育4 h。吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結晶充分溶解。用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定各孔的光密度值。以不接種細胞的等體積DMEM高糖培養基為空白組，以加入與黃酮溶液等體積的DMSO為對照組。細胞存活率按下式計算。

1.3.3 流式細胞分析

將RAW264.7細胞接入12 孔板中，待細胞長至約80%融合時，同時加入終濃度20 μmol/L的6 種黃酮溶液（DMSO配制）和終質量濃度為100 ng/mL的LPS處理24 h，以添加等體積DMSO為對照，處理結束后吸去上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗1 遍，每孔加入1 mL含體積分數5% FBS的PBS，用移液槍吹打細胞使其脫落，并將細胞懸液轉移至1.5 mL的離心管中，4 ℃、400×g離心4 min，棄去900 μL上清液，加入封閉液后重懸，于冰上搖床封閉20 min，再在避光條件下加入CD274和CD38熒光抗體，于冰上搖床避光標記40 min。標記結束后加入400 μL含5% FBS的PBS，吹勻細胞后用流式細胞儀檢測。APC通道接收CD274熒光信號，PE通道接收CD38熒光信號，用流式細胞分析軟件FlowJo處理得到不同信號通道的抗體平均熒光強度。

1.3.4 總蛋白質提取及Western blot檢測

將RAW264.7細胞接入24 孔板中，待細胞長至約80%融合時，加入終濃度20 μmol/L的6 種黃酮溶液（DMSO配制）或等體積DMSO處理12 h，再加入終質量濃度為100 ng/mL的LPS處理30 min后，立即吸去上清液，用PBS清洗1 遍，每孔加入300 μL含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RTPA裂解液，用移液槍反復吹打細胞并轉移至1.5 mL的離心管中。充分裂解后，4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液并轉移至新的離心管中，再加入上清液體積1/4的5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，于100 ℃煮沸10 min，等體積等蛋白質量上樣，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。轉膜結束后，將PVDF膜放入含質量分數5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉2 h。封閉結束后，將膜轉移至一抗（1∶2 000，用含質量分數5%牛血清白蛋白的TBST稀釋）中，4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3 次，每次10 min，然后轉移至二抗（1∶5 000，用含質量分數5%牛血清白蛋白的TBST稀釋）中，室溫孵育2 h。洗膜后進行化學發光顯影，放入熒光成像系統曝光拍照。利用圖像處理軟件ImageJ進行灰度分析，pIκB/IκB表達量以pIκB條帶與IκB條帶灰度的比值表示。

1.3.5 總RNA提取及定量PCR分析

將RAW264.7細胞接入24 孔板中，待細胞長至約80%融合時，先加入終濃度20 μmol/L的6 種黃酮溶液（DMSO配制）或等體積的DMSO處理12 h，再加入終質量濃度為100 ng/mL的LPS處理4 h，處理結束后吸去上清液，用PBS清洗1 遍，利用TRIzol試劑提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書步驟合成cDNA。建立20 μL定量PCR反應體系：10 μL SYBR Green Mix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、8.2 μL雙蒸水和1 μL cDNA。混勻體系，5 000×g離心3 min后進行定量PCR分析。采用ΔΔCt閾值循環法，以β-actin為內參計算樣本間基因表達水平的相對差異。定量PCR引物序列詳見表1。

表 1 定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

1.4 數據處理及分析

實驗結果用平均值±標準差表示。采用Origin軟件進行數據統計學分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 6 種黃酮對巨噬細胞活性的影響

圖 2 6 種黃酮對RAW264.7細胞活性的影響Fig. 2 Effect of six flavonoids on the viability of RAW264.7 cells

由圖2可知，與對照組相比，20 μmol/L的6 種黃酮溶液處理對RAW264.7細胞活性均無顯著影響，說明這6 種黃酮化合物在20 μmol/L條件下不影響巨噬細胞的正常生長。因此后續實驗采用20 μmol/L的木犀草素、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山柰酚及白楊素處理經100 ng/mL LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型，并比較它們的抗炎活性。

2.2 6 種黃酮對LPS誘導的巨噬細胞表面標記蛋白的影響

圖 3 6 種黃酮對LPS誘導的巨噬細胞表面標記蛋白表達的影響Fig. 3 Effect of six flavonoids on the expression of LPS-induced macrophage markers CD274 and CD38

由于RAW264.7細胞從接受LPS刺激到表面抗原CD的轉錄翻譯需要較長的時間，因此，選擇在LPS處理24 h后檢測RAW264.7細胞表面標記蛋白的表達情況。如圖3所示，LPS處理極顯著增強了CD274和CD38抗體的平均熒光強度，而在LPS刺激同時分別添加6 種黃酮化合物處理，對LPS引起的CD274和CD38抗體熒光強度的增加均具有不同程度的抑制效果。其中，添加木犀草素、芹菜素或白楊素對LPS誘導的M1巨噬細胞CD274和CD38表達的抑制作用較強（P＜0.01）；槲皮素對CD274和CD38表達也有一定程度的抑制效果（P＜0.05，P＜0.01）。以上結果表明，木犀草素、芹菜素和白楊素3 種黃酮類化合物抑制LPS誘導巨噬細胞表面標記蛋白表達的活性強于槲皮素、楊梅素和山柰酚這3 種黃酮醇類化合物，說明在其他位點的取代情況相同時，C環上3位的羥基取代可能不利于黃酮類化合物的活性。

2.3 6 種黃酮對LPS誘導的巨噬細胞中IκB磷酸化的影響

核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路對調控巨噬細胞的極化及炎癥反應的發生都發揮著重要作用[24-25]。在靜息狀態的巨噬細胞中，NF-κB與IκB結合而滯留在細胞質中。當LPS與巨噬細胞表面受體結合，觸發胞內級聯信號轉導，能夠激活IκB激酶（IκB kinase，IKK），活化的IKK促使IκB發生磷酸化而被降解，進而導致NF-κB解除抑制并轉位入核，與相關基因啟動子上NF-κB的結合序列結合，從而啟動基因轉錄[26-27]。為探討6 種膳食黃酮對NF-κB信號通路活化的影響，通過Western blot檢測巨噬細胞中IκB總蛋白及其磷酸化蛋白pIκB的表達水平。如圖4所示，LPS處理30 min時極顯著上調了IκB的磷酸化水平，導致IκB水平降低；在LPS刺激前，用木犀草素、槲皮素或芹菜素預處理12 h能夠顯著降低LPS誘導的IκB磷酸化水平的上調，抑制IκB降解，即降低pIκB/IκB表達量，說明木犀草素、槲皮素和芹菜素可以抑制LPS誘導的巨噬細胞中NF-κB信號通路的激活，其中木犀草素的抑制效果最明顯；而用楊梅素、山柰酚或白楊素預處理的巨噬細胞中pIκB/IκB表達量有所降低，但與LPS組差異不顯著。綜上說明木犀草素、槲皮素和芹菜素可以有效抑制巨噬細胞中NF-κB信號通路的激活。

圖 4 6 種黃酮對LPS誘導的巨噬細胞中IκB磷酸化的影響Fig. 4 Effect of six flavonoids on LPS-induced IκB phosphorylation

2.4 6 種黃酮對LPS誘導的M1型巨噬細胞標記基因表達水平的影響

圖 5 6 種黃酮對LPS誘導的M1型巨噬細胞標記基因表達的影響Fig. 5 Effect of six flavonoids on the expression of M1-type macrophage marker genes

經LPS刺激后，M1型巨噬細胞標記基因iNOS mRNA相對表達水平顯著升高（P＜0.05）。在LPS刺激前用木犀草素、芹菜素或白楊素預處理12 h，可以極顯著降低LPS誘導的iNOS mRNA表達水平的升高（P＜0.01），此外槲皮素、楊梅素和山柰酚預處理也有一定程度的改善作用（P＜0.05）（圖5A）。木犀草素、槲皮素或芹菜素預處理均極顯著抑制了LPS誘導的M1型巨噬細胞促炎性因子IL-1β和MCP1 mRNA相對表達水平的升高（P＜0.01），白楊素預處理使IL-1β和MCP1 mRNA相對表達水平顯著降低（P＜0.05），其抑制作用不如木犀草素、槲皮素和芹菜素明顯；楊梅素也在一定程度上抑制了IL-1β和MCP1的mRNA相對表達水平（圖5B、C）。結果表明，木犀草素、槲皮素和芹菜素對炎性基因IL-1β和MCP1 mRNA表達的抑制活性顯著強于楊梅素、山柰酚和白楊素，這一結果與上述6 種黃酮抑制IκB磷酸化的活性強弱趨勢基本一致，這可能是因為NF-κB信號通路參與調控炎性基因IL-1β和MCP1的轉錄[28]。另外，木犀草素、芹菜素和白楊素對M1型巨噬細胞標記物iNOS表達的抑制活性強于槲皮素、楊梅素和山柰酚，這與上述6 種黃酮抑制CD274和CD38表達的活性強弱趨勢一致，進一步說明了木犀草素、芹菜素和白楊素這3 種黃酮類化合物對LPS誘導的巨噬細胞M1極化的抑制活性強于另外3 種黃酮醇類化合物（槲皮素、楊梅素和山柰酚），表明C環上3位的羥基取代可能不利于黃酮類化合物抑制巨噬細胞的M1極化。

3 討 論

目前，對黃酮類化合物抗炎活性的研究大多通過檢測炎性信號通路中相關蛋白的表達及炎性因子的水平。本實驗考察了NF-κB信號途徑中關鍵蛋白IκB的磷酸化水平及促炎性因子iNOS、IL-1β和MCP1 mRNA相對表達水平。結果表明，6 種黃酮在抑制IκB磷酸化和IL-1β及MCP1 mRNA相對表達水平這兩方面的活性強弱趨勢一致，木犀草素、槲皮素和芹菜素能夠有效抑制巨噬細胞中NF-κB信號通路的活化，山柰酚和白楊素對IκB磷酸化沒有顯著抑制作用，這與之前研究結果[21,27,29]一致，而楊梅素對IκB磷酸化的影響目前鮮見報道。

NF-κB信號通路激活所調控的核內相關基因的轉錄以及PCR檢測結果都只反映了其在巨噬細胞中的轉錄水平，不足以證明巨噬細胞的最終極化狀態。表面抗原CD是細胞分化不同階段及活化過程中出現或消失的細胞表面標記蛋白，為不同類型或分化階段細胞所特有，其表達水平反映了細胞的分化程度和功能狀態[30]，因此，采用流式細胞術檢測細胞表面抗原CD可以更精確地定義細胞類型。M1型巨噬細胞表面高表達CD274、CD38，而M2型巨噬細胞表面高表達CD206、CD301，所以根據表面標記蛋白的表達水平可區分M1和M2型巨噬細胞[31-32]。本實驗通過流式細胞術分析了6 種黃酮對巨噬細胞表面標記蛋白CD274和CD38表達的影響，結果表明，木犀草素、芹菜素和白楊素抑制LPS誘導的M1型巨噬細胞CD274或CD38表達的活性均強于槲皮素、楊梅素和山柰酚，這與木犀草素、芹菜素和白楊素對M1型巨噬細胞另一標記物iNOS的mRNA相對表達抑制作用結果一致。綜合上述結果可以發現，木犀草素抑制巨噬細胞向M1型極化的活性較槲皮素強，芹菜素的抑制活性也較山柰酚強。分析6 種5,7-二羥基黃酮的結構特征（圖1）發現，木犀草素和槲皮素、芹菜素和山柰酚在B環上的羥基取代數目和位置相同，而槲皮素較木犀草素在C環3位多出一個羥取代基；芹菜素和山柰酚的結構差異與此相同，推測當B環的羥基取代情況相同時，C環上3位的羥基取代不利于黃酮類化合物抑制巨噬細胞的M1極化。

進一步分析，當C環的羥基取代情況相同時，B環上的羥基取代對黃酮化合物抑制巨噬細胞M1極化的影響，本實驗通過測定發現，3 種黃酮類化合物對IκB磷酸化水平的抑制活性為木犀草素＞芹菜素＞白楊素，對炎性因子IL-1β、MCP1 mRNA表達水平的抑制活性為木犀草素/芹菜素＞白楊素。根據三者的結構（圖1）可知，與木犀草素相比，芹菜素缺少3’位的羥基取代，白楊素缺少3’、4’位的羥基取代，這說明3’、4’位的羥基有利于增強黃酮類化合物抑制巨噬細胞炎性的活性。在3 種黃酮醇類化合物中，與槲皮素相比，山柰酚缺少3’位的羥基取代，其活性遠低于槲皮素，也同樣說明3’、4’位羥取代基的重要作用。

天然黃酮化合物的活性作用取決于其結構類型、羥基化程度及其他官能團的取代情況[33]。因此，針對黃酮類化合物的生物活性進行構效關系的探討尤為重要。本實驗對6 種5,7-二羥基黃酮抑制巨噬細胞M1極化的活性與其結構特征的關系進行了總結，以期為食物源黃酮化合物的進一步開發與利用提供思路。