主動自發(fā)氣調(diào)對桃吉爾霉抑制效果的影響

劉莎莎，張玉笑，王 亮，員麗蘋，陳 勇，張新華，郭衍銀

（山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）是具有廣泛宿主的一種霉菌，可以侵染梨[1]、番茄[2]、海南蒲桃[3]、樹莓[4]、木瓜[5]、茄子[6]等，而且是導致桃[7]、火龍果[8-9]貯藏過程中出現(xiàn)軟腐病的重要病原菌之一，可造成巨大經(jīng)濟損失。目前，控制采后微生物危害的主要措施是化學殺菌劑和生物防治。但殺菌劑易造成化學殘留、降低食品安全性及病原菌產(chǎn)生耐藥性等問題[10]，而生物防治則存在抑菌效果不穩(wěn)定、易被環(huán)境因子干擾的問題[11]。因此在果蔬貯藏過程中，尋求一種綠色安全有效的控制桃吉爾霉生長的方法顯得尤為重要。

研究表明，氣調(diào)不僅對果蔬具有較好的保鮮作用，同時對微生物侵染也有一定的控制作用[12-13]。基于一般氣調(diào)使用O2、CO2和N23 種氣體，但主要起保鮮作用的是O2和CO2兩種氣體（N2主要起平衡作用）的觀點，本實驗室系統(tǒng)研究了O2/CO2氣調(diào)對果蔬保鮮效果的影響，并取得不錯效果。如在10 ℃下，50%（體積分數(shù)，下同）O2+50% CO2不僅能提高西蘭花能量利用效率[14]，且可降低含硫化合物異味代謝[15]，體現(xiàn)出O2/CO2氣調(diào)的獨特保鮮優(yōu)勢。同時，90% O2+10% CO2不僅對生姜具有很好的保鮮作用[16]，且可有效抑制生姜貯藏期間姜蛆帶來的危害[17]。

主動自發(fā)氣調(diào)是將需要貯藏的果蔬放在密閉的容器中，依靠初始充入的氣體及果蔬自身的呼吸作用，快速達到預定的氣體環(huán)境條件的一種保鮮方式，非常適合現(xiàn)代物流運輸保鮮。本課題組在蒜薹保鮮研究中得出，80% O2+20% CO2主動自發(fā)氣調(diào)在20 ℃下具有很好的保鮮效果[18]，但O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)能否在微生物控制方面起到應有作用需要進一步研究。為此，本實驗通過研究密封容器內(nèi)不同初始O2/CO2氣體比例對桃吉爾霉生長的影響，探究主動自發(fā)氣調(diào)對桃吉爾霉的調(diào)控作用及其在果蔬保鮮中的潛在價值，為果蔬貯藏過程中病害的控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）分離自新鮮桃子，所分離菌株經(jīng)山東泓迅生物科技有限公司Blast比對鑒定，確定為桃吉爾霉菌株。

葡萄糖 天津市化學試劑研究所；瓊脂、果膠、羧甲基纖維素鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市光復精細化工有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸、乙酸鈉、無水乙醇 煙臺市雙雙化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、鄰苯三酚、鄰苯二酚、濃鹽酸、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫、果膠、硫酸鎂、氯霉素、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉 天津市凱通化學試劑有限公司；苯酚、氫氧化鈉、鹽酸 萊陽市康德化工有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DDS-307A電導率儀 上海精科雷磁儀器；MR-07825-00 O2/CO2測定儀 丹麥丹圣貿(mào)易公司；UV-1750紫外-可見分光光度計 日本島津國際貿(mào)易有限公司；GL-20G-2臺式高速冷凍離心機 上海安亭儀器制造廠；XW-80A漩渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；AL-1D4精密分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；XS-212-20光學顯微鏡 蘇州勝視電子設備有限公司；GXZ-260B光照生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SW-CJ-1D超凈工作臺、LS-50HD立式自動電熱壓力滅菌鍋濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；RDL380P氣調(diào)包裝機成都羅迪博爾機械設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桃吉爾霉的培養(yǎng)與處理

將在4 ℃下保存的桃吉爾霉活化3 次后，于PDA培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)[19]，配制成濃度為106CFU/mL的孢子懸浮液，取20 μL孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中央。待菌懸液晾干后將培養(yǎng)皿置于氣調(diào)袋內(nèi)，每個氣調(diào)袋放4 個培養(yǎng)皿。然后，每個氣調(diào)袋經(jīng)RDL380P氣調(diào)包裝機分別充入80% O2+20% CO2、90% O2+10% CO2、100% O2和自然空氣，以自然空氣作為對照，每個處理10 個氣調(diào)袋，置于（20.0±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，于第4、6、8、10、12、14天進行相關指標的測定，實驗做3 次重復。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 桃吉爾霉菌落形態(tài)觀察

第5、10天時，將培養(yǎng)皿從氣調(diào)袋內(nèi)拿出，轉(zhuǎn)移到無菌操作臺上，進行拍照，重點觀察菌落顏色、菌絲生長范圍、孢子生長狀況。

1.3.2.2 桃吉爾霉微觀形態(tài)觀察

第5、10天時，將培養(yǎng)皿從氣調(diào)袋內(nèi)拿出，在無菌操作臺上，滴一滴無菌水于載玻片中央，用無菌接種環(huán)在培養(yǎng)皿內(nèi)挑取桃吉爾霉菌絲置于載玻片上，蓋上蓋玻片。在光學顯微鏡下進行霉菌的微觀形態(tài)觀察，重點觀察桃吉爾霉的菌絲體、囊軸、孢子囊的形態(tài)。

1.3.2.3 CO2體積分數(shù)測定

利用O2/CO2測定儀定期測定氣調(diào)袋內(nèi)的CO2體積分數(shù)。

1.3.2.4 桃吉爾霉孢子量計數(shù)

孢子量計數(shù)參考郭宇歡[20]的方法。在超凈工作臺中，用打孔器（直徑6 mm）在菌落邊緣處隨機打取3 塊菌碟，置于50 mL離心管中，并加入15 mL無菌水，振蕩10 min后兩層紗布過濾，然后加10 mL水，分兩次沖洗紗布和離心管，制成孢子懸浮液，顯微鏡下對孢子進行計數(shù)。

1.3.2.5 桃吉爾霉孢子DNA釋放量、電導率的測定

孢子DNA釋放量、電導率的測定按照Zeng Xinping等[21]的方法。在菌落邊緣用直徑6 mm的打孔器隨機取3 塊菌碟，加入10 mL無菌水，漩渦混合器振蕩過濾后去除菌絲，用0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸緩沖液15 mL分3 次沖洗，轉(zhuǎn)移到20 mL的緩沖液中，后配制成相同濃度（106CFU/mL）的孢子懸浮液。12 000 r/min離心3 min除去菌體，上清液于260 nm波長處測定OD值，以磷酸緩沖液作為空白，以OD260nm表征孢子DNA的釋放量；采用電導率儀測定上清液的電導率。

1.3.2.6 桃吉爾霉細胞壁降解酶活力測定

取1.3.2.5節(jié)制備的8 mL 106CFU/mL孢子懸浮液，超聲波粉碎機破壁15 min，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測酶液。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（pectin methylgalacturonase，PMG）活力測定分別以果膠、果膠酸鈉為底物，在各自體系中加入酶液后混勻，在50 ℃下水浴10 min，然后利用DNS顯色法測定540 nm波長處的吸光度[22]。以50 ℃下每毫升粗酶液每分鐘分解底物釋放1 μg還原糖所需要的酶量表征酶活力，單位為U/mL。

1.3.2.7 桃吉爾霉抗氧化酶活力測定

在2 組離心管中均加入4 mL 106CFU/mL的孢子懸浮液，4 ℃ 10 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的提取用預冷的0.2 mol/L pH 7.8磷酸鹽緩沖液洗滌，過氧化物酶（peroxidase，POD）的提取用0.2 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液洗滌，洗滌3 次后，棄去上清液收集菌體。后將兩者所得的菌體各自重懸于3 mL預冷的0.2 mol/L pH 7.8和0.2 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，再進行冰浴超聲波破壁15 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液用于測定酶活力。SOD活力采用鄰苯三酚自氧化法，定義25 ℃時抑制50%鄰苯三酚自氧化速率時所需的量為1 個酶活力單位（U）；POD活力測定采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定470 nm波長處的吸光度，將吸光度每秒改變0.001定義為1 個酶活力單位（U）。SOD和POD活力單位均為U/mL[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進行顯著性分析及相關性分析，P＜0.05表示差異顯著，并用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 主動自發(fā)氣調(diào)對桃吉爾霉菌落形態(tài)的影響

圖 1 不同處理下桃吉爾霉在培養(yǎng)基上的生長狀況Fig. 1 Growth status of Gilbertella persicaria on medium under different treatments

由圖1可知，初始O2/CO2比例對桃吉爾霉生長影響極大，CK組在第5天時培養(yǎng)皿內(nèi)就長滿了菌絲及黑色孢子，100% O2處理組的菌絲及孢子生長量與CK組類似。隨著CO2比例的升高，桃吉爾霉生長受到的抑制越大，90% O2+10% CO2處理組的培養(yǎng)皿內(nèi)雖然長滿了菌絲、孢子，但其顏色明顯淡于CK組，80% O2+20% CO2處理組雖然有菌絲生成，但無黑色孢子產(chǎn)生。

2.2 主動自發(fā)氣調(diào)對桃吉爾霉微觀形態(tài)的影響

圖 2 桃吉爾霉在顯微鏡下的菌絲和囊軸形態(tài)（×400）Fig. 2 Mycelia and columella morphology of Gilbertella persicaria (× 400)

圖 3 桃吉爾霉在顯微鏡下孢子囊及釋放孢子的形態(tài)（×400）Fig. 3 Morphology of sporangia and released spores of Gilbertella persicaria (× 400)

如圖2、3所示，第5天時，CK組的菌絲體粗細均勻，表面光滑，囊軸圓滑飽滿，孢子囊破裂后可釋放分生孢子；100% O2處理組菌絲體較為粗壯，囊軸飽滿且較CK組更大，孢子囊破裂可釋放大量分生孢子；90% O2+10% CO2處理組的菌絲體與CK組無明顯差別，但囊軸出現(xiàn)畸形，呈葫蘆狀，且孢子量減少，孢子囊釋放的分生孢子較少；80% O2+20% CO2處理組的菌絲體開始出現(xiàn)分枝，孢子囊在菌絲頂端未成熟且呈現(xiàn)畸形，未發(fā)現(xiàn)脫落的孢子囊，因此沒有其孢子囊及釋放孢子的圖片。第10天時，CK、100% O2處理組的菌絲體較5 d時更粗大，囊軸更加飽滿，但孢子囊釋放的孢子數(shù)目減少，這可能與桃吉爾霉完成一個生長周期有關。與第5天相比，90% O2+10% CO2處理組的菌絲體變細，囊軸較之前更小，少量孢子囊破裂；80% O2+20% CO2處理組則出現(xiàn)菌絲體分枝增多、孢子囊破裂畸形、自溶等現(xiàn)象。

2.3 氣調(diào)袋內(nèi)CO2體積分數(shù)和O2體積分數(shù)的變化

如圖4A所示，CO2體積分數(shù)隨桃吉爾霉處理時間延長呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，并在第10天達到平穩(wěn)階段。80% O2+20% CO2、90% O2+10% CO2處理組在培養(yǎng)末期（14 d）CO2體積分數(shù)分別達到了32.6%、18.1%。而CK、100% O2處理組CO2體積分數(shù)上升較慢，直到末期仍維持較低水平，且CO2體積分數(shù)均低于20%。100% O2處理組CO2體積分數(shù)低于CK組，其他O2/CO2組處理高于CK組，各處理組間差異顯著（P＜0.05）。如圖4B所示，O2體積分數(shù)隨桃吉爾霉處理時間延長呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，除CK處理組外，其他3 個處理組的O2體積分數(shù)雖有下降，但其體積分數(shù)均高于65%。

圖 4 不同處理氣調(diào)袋內(nèi)CO2（A）和O2（B）體積分數(shù)變化Fig. 4 Changes in CO2 (A) and O2 (B) contents in normal and modified atmospheres

2.4 主動自發(fā)氣調(diào)對桃吉爾霉孢子量的影響

圖 5 不同處理對桃吉爾霉孢子量的影響Fig. 5 Effect of different treatments on the amount of Gilbertella persicaria spores

桃吉爾霉在生長繁殖過程中，孢子萌發(fā)，產(chǎn)生菌絲，菌絲頂端生成孢子囊并散發(fā)分生孢子。如圖5所示，各處理組孢子量隨著處理時間的延長呈先上升后下降的趨勢。CK、100% O2、90% O2+10% CO2處理組均在第12天時出現(xiàn)峰值，且90% O2+10% CO2處理組孢子量顯著低于CK組（P＜0.05）。培養(yǎng)12 d后孢子量下降，可能與后期培養(yǎng)基營養(yǎng)成分減少或CO2濃度過高抑制有關。80% O2+20% CO2處理組因無孢子產(chǎn)生，故圖中未出現(xiàn)該組折線。

2.5 主動自發(fā)氣調(diào)對桃吉爾霉孢子電導率和DNA釋放量的影響

在霉菌培養(yǎng)過程中，自身衰老或者外部環(huán)境因素的影響會導致細胞膜透性的增加。電導率是反映膜透性的指標[23]。從圖6A可以看出，隨著處理時間延長，桃吉爾霉電導率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。與CK組相比，100% O2處理顯著降低了電導率，90% O2+10% CO2處理顯著增大了電導率（P＜0.05），對細胞膜的破壞最嚴重。因此高O2高CO2氣調(diào)處理可導致細胞膜透性增加，CO2濃度越高，對菌細胞損傷越嚴重。

圖 6 不同處理對桃吉爾霉孢子電導率（A）、孢子DNA釋放（B）的影響Fig. 6 Effects of different treatments on conductivity (A) and spores DNA release (B) of Gilbertella persicaria

孢子DNA釋放量可以反映細胞膜破壞程度及細胞內(nèi)成分的外泄情況。如圖6B所示，各處理組孢子內(nèi)DNA釋放量均呈現(xiàn)先快速增長、再平緩過度、最后下降的趨勢。整個處理過程中，100% O2處理組DNA釋放量顯著低于CK組（P＜0.05），說明100% O2對桃吉爾霉細胞膜無破壞效果；在處理前10 d，90% O2+10% CO2處理組DNA釋放量高于CK組，說明主動自發(fā)氣調(diào)對細胞造成了傷害，但末期低于CK組，可能與末期90% O2+10% CO2處理組孢子量大幅度減少有關。因此主動自發(fā)氣調(diào)處理可破壞細胞膜的完整性，導致孢子內(nèi)DNA流出，從而達到抑菌效果。后期桃吉爾霉孢子DNA釋放減少，可能與末期孢子量下降有關。

2.6 主動自發(fā)氣調(diào)對桃吉爾霉SOD、POD活力的影響

SOD和POD是生物機體防御活性氧傷害的關鍵酶類[24]。由圖7A可知，隨著處理時間的延長，SOD活力呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢，在第6天時呈現(xiàn)一個峰值。在各處理組中，100% O2處理組SOD活力最高，而90% O2+10% CO2處理組最低，100% O2、CK和90% O2+10% CO2處理組的SOD平均活力分別為1 474.1、1 171.4、956.8 U/mL。如圖7B所示，POD活力也是第6天出現(xiàn)峰值，然后稍下降，10 d后有所上升，100% O2、CK和90% O2+10% CO2處理組的POD平均活力分別為0.318、0.253、0.203 U/mL，且達到顯著差異水平（P＜0.05）。

圖 7 不同處理對桃吉爾霉SOD（A）、POD（B）活力的影響Fig. 7 Effects of different treatments on the activities of SOD (A) and POD (B) of Gilbertella persicaria

2.7 主動自發(fā)氣調(diào)對桃吉爾霉PG、PMG活力的影響

圖 8 不同處理對桃吉爾霉PG（A）、PMG（B）活力的影響Fig. 8 Effects of different treatments on the activities of PG (A) and PMG (B) of Gilbertella persicaria

PG、PMG作為水解酶可以分解果膠類物質(zhì)，在降解植物細胞壁中發(fā)揮著重要作用[25]。由圖8可知，隨著處理時間的延長，PG、PMG活力基本呈現(xiàn)下降趨勢。就整個培養(yǎng)期間的活力而言，100% O2組PG、PMG活力均最高，CK組其次，90% O2+10% CO2處理組最低，這3 個處理組PG和PMG的平均活力分別為3.32、2.94、2.71 U/mL和0.99、0.81、0.73 U/mL，差異達顯著水平（P＜0.05）。說明高CO2環(huán)境可抑制PG和PMG活力，降低桃吉爾霉的致病性。

3 討 論

研究表明，氣調(diào)能抑制果蔬表面的病原物侵染，Sitton等[26]指出‘旭’、‘元帥’和‘金冠’蘋果在CO2體積分數(shù)高于2.8%時進行氣調(diào)貯藏，能顯著抑制由灰葡萄孢菌引發(fā)的灰霉病；蘋果在5% CO2+3% O2或3% O2的氣調(diào)條件下貯藏可顯著降低炭疽病菌的生長及其細胞壁降解酶的活性[27]。但是低O2和高CO2的貯藏易造成CO2傷害、異味等問題[28-29]，影響貯藏品質(zhì)。自高氧氣調(diào)被提出以來，其已在蘑菇[30]、桑葚[31]等果蔬保鮮方面體現(xiàn)出優(yōu)勢，但對香蕉保鮮沒有效果甚至產(chǎn)生負面影響[32]。有研究指出，氣調(diào)過程中O2、CO2比例具有明顯的交互作用，增加O2含量可減輕CO2傷害，增加CO2含量可抑制高O2引起的呼吸作用[33]。為此，本課題組前期對O2/CO2氣調(diào)保鮮技術進行了研究，并在西蘭花、生姜保鮮方面取得不錯效果[34-36]，且主動自發(fā)氣調(diào)在蒜薹保鮮方面也具有積極作用[18]。為此，本實驗選擇以O2/CO2氣體作為桃吉爾霉的處理方式，以期為O2/CO2的主動自發(fā)氣調(diào)控制微生物危害提供依據(jù)。本實驗結果表明，與CK組相比，100% O2處理有利于霉菌菌絲及孢子的生長，這與桃吉爾霉是好氧性微生物有關，而90% O2+10% CO2處理對霉菌生長有抑制作用，80% O2+20% CO2處理則完全抑制了霉菌孢子的產(chǎn)生，表明O2/CO2的主動自發(fā)氣調(diào)對霉菌具有很好的抑制效果。

Amanatidou等[37]研究發(fā)現(xiàn)，90% O2+10% N2能顯著降低敏感性乳酸菌L. sakesens的生長速率和生活力，而對耐性乳酸菌L. sakeins的生長卻沒有影響。進一步研究指出，在細胞生長穩(wěn)定期，L. sakesens胞質(zhì)超氧陰離子的濃度是L. sakeins中的10 倍，而L. sakeins胞質(zhì)中SOD活力比L. sakesens高10～20 倍，表明活性氧清除能力在L. sakeins抵御氣調(diào)脅迫中起重要作用。郭衍銀等[38]研究指出，與100% O2相比，15 ℃下40% O2+60% CO2氣調(diào)貯藏可減少活性氧積累，保持SOD和POD活力，并能有效延長西蘭花保鮮期，表明CO2結合O2具有抑制活性氧產(chǎn)生或消除活性氧的作用，也為O2/CO2氣調(diào)保鮮提供了理論依據(jù)。植物細胞壁是植物與其病原真菌相互作用的場所，病原真菌在識別寄主過程中，會分泌細胞壁降解酶來降解植物細胞壁以便入侵，PG和PMG則是微生物侵染寄主并致病的水解酶類[39]。為了降解植物細胞壁，病原真菌分泌的細胞壁降解酶必須通過真菌質(zhì)膜向胞外分泌[40]，PG則是真菌最先向胞外分泌的酶之一，PMG在隨后侵染中起致病作用[39]。本實驗結果表明，O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)處理降低了桃吉爾霉SOD、POD、PG和PMG活力，且隨著CO2比例的升高而增強，表明桃吉爾霉應對環(huán)境能力的減弱和致病能力的降低。Kader等[41]研究表明高氧可抑制某些細菌和霉菌生長，但如果將高氧配合高二氧化碳（15%～20% CO2）使用會比僅使用任意一種氣體處理所得到的抑菌效果更為顯著。Hoogerwerf等[42]研究表明80% O2+20% CO2處理能顯著抑制灰葡萄孢菌的生長，且效果顯著優(yōu)于100% CO2處理，這與本研究結果一致，其可能原因是O2促使菌體呼吸代謝的同時，吸入CO2的量也增多，在二者協(xié)同作用下造成更大的傷害。

自發(fā)氣調(diào)可分為被動自發(fā)氣調(diào)和主動自發(fā)氣調(diào)兩類[43]，被動自發(fā)氣調(diào)主要是利用果蔬本身的呼吸作用平衡氣調(diào)袋中的O2、CO2濃度，對于透氣包裝材料選擇因果蔬種類而異，且達到所需氣體環(huán)境的時間周期長，目前市場上保鮮膜種類繁多、透氣特性差異較大，難以制定統(tǒng)一的保鮮標準；而主動自發(fā)氣調(diào)具有氣體平衡快、不必考慮包裝材料透氣特性等優(yōu)點，易于制定統(tǒng)一標準。且主動自發(fā)氣調(diào)是在密閉容器中進行，而密閉容器易于搬運，特別適于現(xiàn)代物流運輸?shù)谋ｕr。

O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)對于控制桃吉爾霉致病性有良好的效果，在O2、CO2的協(xié)同作用下，可造成桃吉爾霉菌絲損傷、電導率及孢子DNA釋放量增加，SOD、POD、PG和PMG活力降低，甚至致使桃吉爾霉不能產(chǎn)生孢子，進而降低其在果蔬貯藏中的危害，特別是當O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)的CO2比例超過10%情況下，抑制效果更為顯著。該研究結果為果蔬貯藏過程中霉菌的控制提供了理論參考。