主動自發氣調對桃吉爾霉抑制效果的影響

劉莎莎，張玉笑，王 亮，員麗蘋，陳 勇，張新華，郭衍銀

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）是具有廣泛宿主的一種霉菌，可以侵染梨[1]、番茄[2]、海南蒲桃[3]、樹莓[4]、木瓜[5]、茄子[6]等，而且是導致桃[7]、火龍果[8-9]貯藏過程中出現軟腐病的重要病原菌之一，可造成巨大經濟損失。目前，控制采后微生物危害的主要措施是化學殺菌劑和生物防治。但殺菌劑易造成化學殘留、降低食品安全性及病原菌產生耐藥性等問題[10]，而生物防治則存在抑菌效果不穩定、易被環境因子干擾的問題[11]。因此在果蔬貯藏過程中，尋求一種綠色安全有效的控制桃吉爾霉生長的方法顯得尤為重要。

研究表明，氣調不僅對果蔬具有較好的保鮮作用，同時對微生物侵染也有一定的控制作用[12-13]。基于一般氣調使用O2、CO2和N23 種氣體，但主要起保鮮作用的是O2和CO2兩種氣體（N2主要起平衡作用）的觀點，本實驗室系統研究了O2/CO2氣調對果蔬保鮮效果的影響，并取得不錯效果。如在10 ℃下，50%（體積分數，下同）O2+50% CO2不僅能提高西蘭花能量利用效率[14]，且可降低含硫化合物異味代謝[15]，體現出O2/CO2氣調的獨特保鮮優勢。同時，90% O2+10% CO2不僅對生姜具有很好的保鮮作用[16]，且可有效抑制生姜貯藏期間姜蛆帶來的危害[17]。

主動自發氣調是將需要貯藏的果蔬放在密閉的容器中，依靠初始充入的氣體及果蔬自身的呼吸作用，快速達到預定的氣體環境條件的一種保鮮方式，非常適合現代物流運輸保鮮。本課題組在蒜薹保鮮研究中得出，80% O2+20% CO2主動自發氣調在20 ℃下具有很好的保鮮效果[18]，但O2/CO2主動自發氣調能否在微生物控制方面起到應有作用需要進一步研究。為此，本實驗通過研究密封容器內不同初始O2/CO2氣體比例對桃吉爾霉生長的影響，探究主動自發氣調對桃吉爾霉的調控作用及其在果蔬保鮮中的潛在價值，為果蔬貯藏過程中病害的控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）分離自新鮮桃子，所分離菌株經山東泓迅生物科技有限公司Blast比對鑒定，確定為桃吉爾霉菌株。

葡萄糖 天津市化學試劑研究所；瓊脂、果膠、羧甲基纖維素鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市光復精細化工有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸、乙酸鈉、無水乙醇 煙臺市雙雙化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、鄰苯三酚、鄰苯二酚、濃鹽酸、愈創木酚、過氧化氫、果膠、硫酸鎂、氯霉素、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉 天津市凱通化學試劑有限公司；苯酚、氫氧化鈉、鹽酸 萊陽市康德化工有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DDS-307A電導率儀 上海精科雷磁儀器；MR-07825-00 O2/CO2測定儀 丹麥丹圣貿易公司；UV-1750紫外-可見分光光度計 日本島津國際貿易有限公司；GL-20G-2臺式高速冷凍離心機 上海安亭儀器制造廠；XW-80A漩渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；AL-1D4精密分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；XS-212-20光學顯微鏡 蘇州勝視電子設備有限公司；GXZ-260B光照生化培養箱 寧波江南儀器廠；SW-CJ-1D超凈工作臺、LS-50HD立式自動電熱壓力滅菌鍋濟南來寶醫療器械有限公司；RDL380P氣調包裝機成都羅迪博爾機械設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桃吉爾霉的培養與處理

將在4 ℃下保存的桃吉爾霉活化3 次后，于PDA培養基上擴大培養[19]，配制成濃度為106CFU/mL的孢子懸浮液，取20 μL孢子懸浮液接種于培養皿（直徑9 cm）中央。待菌懸液晾干后將培養皿置于氣調袋內，每個氣調袋放4 個培養皿。然后，每個氣調袋經RDL380P氣調包裝機分別充入80% O2+20% CO2、90% O2+10% CO2、100% O2和自然空氣，以自然空氣作為對照，每個處理10 個氣調袋，置于（20.0±0.5）℃恒溫培養箱內培養，于第4、6、8、10、12、14天進行相關指標的測定，實驗做3 次重復。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 桃吉爾霉菌落形態觀察

第5、10天時，將培養皿從氣調袋內拿出，轉移到無菌操作臺上，進行拍照，重點觀察菌落顏色、菌絲生長范圍、孢子生長狀況。

1.3.2.2 桃吉爾霉微觀形態觀察

第5、10天時，將培養皿從氣調袋內拿出，在無菌操作臺上，滴一滴無菌水于載玻片中央，用無菌接種環在培養皿內挑取桃吉爾霉菌絲置于載玻片上，蓋上蓋玻片。在光學顯微鏡下進行霉菌的微觀形態觀察，重點觀察桃吉爾霉的菌絲體、囊軸、孢子囊的形態。

1.3.2.3 CO2體積分數測定

利用O2/CO2測定儀定期測定氣調袋內的CO2體積分數。

1.3.2.4 桃吉爾霉孢子量計數

孢子量計數參考郭宇歡[20]的方法。在超凈工作臺中，用打孔器（直徑6 mm）在菌落邊緣處隨機打取3 塊菌碟，置于50 mL離心管中，并加入15 mL無菌水，振蕩10 min后兩層紗布過濾，然后加10 mL水，分兩次沖洗紗布和離心管，制成孢子懸浮液，顯微鏡下對孢子進行計數。

1.3.2.5 桃吉爾霉孢子DNA釋放量、電導率的測定

孢子DNA釋放量、電導率的測定按照Zeng Xinping等[21]的方法。在菌落邊緣用直徑6 mm的打孔器隨機取3 塊菌碟，加入10 mL無菌水，漩渦混合器振蕩過濾后去除菌絲，用0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸緩沖液15 mL分3 次沖洗，轉移到20 mL的緩沖液中，后配制成相同濃度（106CFU/mL）的孢子懸浮液。12 000 r/min離心3 min除去菌體，上清液于260 nm波長處測定OD值，以磷酸緩沖液作為空白，以OD260nm表征孢子DNA的釋放量；采用電導率儀測定上清液的電導率。

1.3.2.6 桃吉爾霉細胞壁降解酶活力測定

取1.3.2.5節制備的8 mL 106CFU/mL孢子懸浮液，超聲波粉碎機破壁15 min，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測酶液。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（pectin methylgalacturonase，PMG）活力測定分別以果膠、果膠酸鈉為底物，在各自體系中加入酶液后混勻，在50 ℃下水浴10 min，然后利用DNS顯色法測定540 nm波長處的吸光度[22]。以50 ℃下每毫升粗酶液每分鐘分解底物釋放1 μg還原糖所需要的酶量表征酶活力，單位為U/mL。

1.3.2.7 桃吉爾霉抗氧化酶活力測定

在2 組離心管中均加入4 mL 106CFU/mL的孢子懸浮液，4 ℃ 10 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的提取用預冷的0.2 mol/L pH 7.8磷酸鹽緩沖液洗滌，過氧化物酶（peroxidase，POD）的提取用0.2 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液洗滌，洗滌3 次后，棄去上清液收集菌體。后將兩者所得的菌體各自重懸于3 mL預冷的0.2 mol/L pH 7.8和0.2 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，再進行冰浴超聲波破壁15 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液用于測定酶活力。SOD活力采用鄰苯三酚自氧化法，定義25 ℃時抑制50%鄰苯三酚自氧化速率時所需的量為1 個酶活力單位（U）；POD活力測定采用愈創木酚氧化法測定470 nm波長處的吸光度，將吸光度每秒改變0.001定義為1 個酶活力單位（U）。SOD和POD活力單位均為U/mL[22]。

1.4 數據統計與處理

所得數據使用SPSS 19.0軟件采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進行顯著性分析及相關性分析，P＜0.05表示差異顯著，并用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 主動自發氣調對桃吉爾霉菌落形態的影響

圖 1 不同處理下桃吉爾霉在培養基上的生長狀況Fig. 1 Growth status of Gilbertella persicaria on medium under different treatments

由圖1可知，初始O2/CO2比例對桃吉爾霉生長影響極大，CK組在第5天時培養皿內就長滿了菌絲及黑色孢子，100% O2處理組的菌絲及孢子生長量與CK組類似。隨著CO2比例的升高，桃吉爾霉生長受到的抑制越大，90% O2+10% CO2處理組的培養皿內雖然長滿了菌絲、孢子，但其顏色明顯淡于CK組，80% O2+20% CO2處理組雖然有菌絲生成，但無黑色孢子產生。

2.2 主動自發氣調對桃吉爾霉微觀形態的影響

圖 2 桃吉爾霉在顯微鏡下的菌絲和囊軸形態（×400）Fig. 2 Mycelia and columella morphology of Gilbertella persicaria (× 400)

圖 3 桃吉爾霉在顯微鏡下孢子囊及釋放孢子的形態（×400）Fig. 3 Morphology of sporangia and released spores of Gilbertella persicaria (× 400)

如圖2、3所示，第5天時，CK組的菌絲體粗細均勻，表面光滑，囊軸圓滑飽滿，孢子囊破裂后可釋放分生孢子；100% O2處理組菌絲體較為粗壯，囊軸飽滿且較CK組更大，孢子囊破裂可釋放大量分生孢子；90% O2+10% CO2處理組的菌絲體與CK組無明顯差別，但囊軸出現畸形，呈葫蘆狀，且孢子量減少，孢子囊釋放的分生孢子較少；80% O2+20% CO2處理組的菌絲體開始出現分枝，孢子囊在菌絲頂端未成熟且呈現畸形，未發現脫落的孢子囊，因此沒有其孢子囊及釋放孢子的圖片。第10天時，CK、100% O2處理組的菌絲體較5 d時更粗大，囊軸更加飽滿，但孢子囊釋放的孢子數目減少，這可能與桃吉爾霉完成一個生長周期有關。與第5天相比，90% O2+10% CO2處理組的菌絲體變細，囊軸較之前更小，少量孢子囊破裂；80% O2+20% CO2處理組則出現菌絲體分枝增多、孢子囊破裂畸形、自溶等現象。

2.3 氣調袋內CO2體積分數和O2體積分數的變化

如圖4A所示，CO2體積分數隨桃吉爾霉處理時間延長呈現逐漸上升趨勢，并在第10天達到平穩階段。80% O2+20% CO2、90% O2+10% CO2處理組在培養末期（14 d）CO2體積分數分別達到了32.6%、18.1%。而CK、100% O2處理組CO2體積分數上升較慢，直到末期仍維持較低水平，且CO2體積分數均低于20%。100% O2處理組CO2體積分數低于CK組，其他O2/CO2組處理高于CK組，各處理組間差異顯著（P＜0.05）。如圖4B所示，O2體積分數隨桃吉爾霉處理時間延長呈現逐漸下降趨勢，除CK處理組外，其他3 個處理組的O2體積分數雖有下降，但其體積分數均高于65%。

圖 4 不同處理氣調袋內CO2（A）和O2（B）體積分數變化Fig. 4 Changes in CO2 (A) and O2 (B) contents in normal and modified atmospheres

2.4 主動自發氣調對桃吉爾霉孢子量的影響

圖 5 不同處理對桃吉爾霉孢子量的影響Fig. 5 Effect of different treatments on the amount of Gilbertella persicaria spores

桃吉爾霉在生長繁殖過程中，孢子萌發，產生菌絲，菌絲頂端生成孢子囊并散發分生孢子。如圖5所示，各處理組孢子量隨著處理時間的延長呈先上升后下降的趨勢。CK、100% O2、90% O2+10% CO2處理組均在第12天時出現峰值，且90% O2+10% CO2處理組孢子量顯著低于CK組（P＜0.05）。培養12 d后孢子量下降，可能與后期培養基營養成分減少或CO2濃度過高抑制有關。80% O2+20% CO2處理組因無孢子產生，故圖中未出現該組折線。

2.5 主動自發氣調對桃吉爾霉孢子電導率和DNA釋放量的影響

在霉菌培養過程中，自身衰老或者外部環境因素的影響會導致細胞膜透性的增加。電導率是反映膜透性的指標[23]。從圖6A可以看出，隨著處理時間延長，桃吉爾霉電導率呈現逐漸增大的趨勢。與CK組相比，100% O2處理顯著降低了電導率，90% O2+10% CO2處理顯著增大了電導率（P＜0.05），對細胞膜的破壞最嚴重。因此高O2高CO2氣調處理可導致細胞膜透性增加，CO2濃度越高，對菌細胞損傷越嚴重。

圖 6 不同處理對桃吉爾霉孢子電導率（A）、孢子DNA釋放（B）的影響Fig. 6 Effects of different treatments on conductivity (A) and spores DNA release (B) of Gilbertella persicaria

孢子DNA釋放量可以反映細胞膜破壞程度及細胞內成分的外泄情況。如圖6B所示，各處理組孢子內DNA釋放量均呈現先快速增長、再平緩過度、最后下降的趨勢。整個處理過程中，100% O2處理組DNA釋放量顯著低于CK組（P＜0.05），說明100% O2對桃吉爾霉細胞膜無破壞效果；在處理前10 d，90% O2+10% CO2處理組DNA釋放量高于CK組，說明主動自發氣調對細胞造成了傷害，但末期低于CK組，可能與末期90% O2+10% CO2處理組孢子量大幅度減少有關。因此主動自發氣調處理可破壞細胞膜的完整性，導致孢子內DNA流出，從而達到抑菌效果。后期桃吉爾霉孢子DNA釋放減少，可能與末期孢子量下降有關。

2.6 主動自發氣調對桃吉爾霉SOD、POD活力的影響

SOD和POD是生物機體防御活性氧傷害的關鍵酶類[24]。由圖7A可知，隨著處理時間的延長，SOD活力呈現先升后降再升的趨勢，在第6天時呈現一個峰值。在各處理組中，100% O2處理組SOD活力最高，而90% O2+10% CO2處理組最低，100% O2、CK和90% O2+10% CO2處理組的SOD平均活力分別為1 474.1、1 171.4、956.8 U/mL。如圖7B所示，POD活力也是第6天出現峰值，然后稍下降，10 d后有所上升，100% O2、CK和90% O2+10% CO2處理組的POD平均活力分別為0.318、0.253、0.203 U/mL，且達到顯著差異水平（P＜0.05）。

圖 7 不同處理對桃吉爾霉SOD（A）、POD（B）活力的影響Fig. 7 Effects of different treatments on the activities of SOD (A) and POD (B) of Gilbertella persicaria

2.7 主動自發氣調對桃吉爾霉PG、PMG活力的影響

圖 8 不同處理對桃吉爾霉PG（A）、PMG（B）活力的影響Fig. 8 Effects of different treatments on the activities of PG (A) and PMG (B) of Gilbertella persicaria

PG、PMG作為水解酶可以分解果膠類物質，在降解植物細胞壁中發揮著重要作用[25]。由圖8可知，隨著處理時間的延長，PG、PMG活力基本呈現下降趨勢。就整個培養期間的活力而言，100% O2組PG、PMG活力均最高，CK組其次，90% O2+10% CO2處理組最低，這3 個處理組PG和PMG的平均活力分別為3.32、2.94、2.71 U/mL和0.99、0.81、0.73 U/mL，差異達顯著水平（P＜0.05）。說明高CO2環境可抑制PG和PMG活力，降低桃吉爾霉的致病性。

3 討 論

研究表明，氣調能抑制果蔬表面的病原物侵染，Sitton等[26]指出‘旭’、‘元帥’和‘金冠’蘋果在CO2體積分數高于2.8%時進行氣調貯藏，能顯著抑制由灰葡萄孢菌引發的灰霉病；蘋果在5% CO2+3% O2或3% O2的氣調條件下貯藏可顯著降低炭疽病菌的生長及其細胞壁降解酶的活性[27]。但是低O2和高CO2的貯藏易造成CO2傷害、異味等問題[28-29]，影響貯藏品質。自高氧氣調被提出以來，其已在蘑菇[30]、桑葚[31]等果蔬保鮮方面體現出優勢，但對香蕉保鮮沒有效果甚至產生負面影響[32]。有研究指出，氣調過程中O2、CO2比例具有明顯的交互作用，增加O2含量可減輕CO2傷害，增加CO2含量可抑制高O2引起的呼吸作用[33]。為此，本課題組前期對O2/CO2氣調保鮮技術進行了研究，并在西蘭花、生姜保鮮方面取得不錯效果[34-36]，且主動自發氣調在蒜薹保鮮方面也具有積極作用[18]。為此，本實驗選擇以O2/CO2氣體作為桃吉爾霉的處理方式，以期為O2/CO2的主動自發氣調控制微生物危害提供依據。本實驗結果表明，與CK組相比，100% O2處理有利于霉菌菌絲及孢子的生長，這與桃吉爾霉是好氧性微生物有關，而90% O2+10% CO2處理對霉菌生長有抑制作用，80% O2+20% CO2處理則完全抑制了霉菌孢子的產生，表明O2/CO2的主動自發氣調對霉菌具有很好的抑制效果。

Amanatidou等[37]研究發現，90% O2+10% N2能顯著降低敏感性乳酸菌L. sakesens的生長速率和生活力，而對耐性乳酸菌L. sakeins的生長卻沒有影響。進一步研究指出，在細胞生長穩定期，L. sakesens胞質超氧陰離子的濃度是L. sakeins中的10 倍，而L. sakeins胞質中SOD活力比L. sakesens高10～20 倍，表明活性氧清除能力在L. sakeins抵御氣調脅迫中起重要作用。郭衍銀等[38]研究指出，與100% O2相比，15 ℃下40% O2+60% CO2氣調貯藏可減少活性氧積累，保持SOD和POD活力，并能有效延長西蘭花保鮮期，表明CO2結合O2具有抑制活性氧產生或消除活性氧的作用，也為O2/CO2氣調保鮮提供了理論依據。植物細胞壁是植物與其病原真菌相互作用的場所，病原真菌在識別寄主過程中，會分泌細胞壁降解酶來降解植物細胞壁以便入侵，PG和PMG則是微生物侵染寄主并致病的水解酶類[39]。為了降解植物細胞壁，病原真菌分泌的細胞壁降解酶必須通過真菌質膜向胞外分泌[40]，PG則是真菌最先向胞外分泌的酶之一，PMG在隨后侵染中起致病作用[39]。本實驗結果表明，O2/CO2主動自發氣調處理降低了桃吉爾霉SOD、POD、PG和PMG活力，且隨著CO2比例的升高而增強，表明桃吉爾霉應對環境能力的減弱和致病能力的降低。Kader等[41]研究表明高氧可抑制某些細菌和霉菌生長，但如果將高氧配合高二氧化碳（15%～20% CO2）使用會比僅使用任意一種氣體處理所得到的抑菌效果更為顯著。Hoogerwerf等[42]研究表明80% O2+20% CO2處理能顯著抑制灰葡萄孢菌的生長，且效果顯著優于100% CO2處理，這與本研究結果一致，其可能原因是O2促使菌體呼吸代謝的同時，吸入CO2的量也增多，在二者協同作用下造成更大的傷害。

自發氣調可分為被動自發氣調和主動自發氣調兩類[43]，被動自發氣調主要是利用果蔬本身的呼吸作用平衡氣調袋中的O2、CO2濃度，對于透氣包裝材料選擇因果蔬種類而異，且達到所需氣體環境的時間周期長，目前市場上保鮮膜種類繁多、透氣特性差異較大，難以制定統一的保鮮標準；而主動自發氣調具有氣體平衡快、不必考慮包裝材料透氣特性等優點，易于制定統一標準。且主動自發氣調是在密閉容器中進行，而密閉容器易于搬運，特別適于現代物流運輸的保鮮。

O2/CO2主動自發氣調對于控制桃吉爾霉致病性有良好的效果，在O2、CO2的協同作用下，可造成桃吉爾霉菌絲損傷、電導率及孢子DNA釋放量增加，SOD、POD、PG和PMG活力降低，甚至致使桃吉爾霉不能產生孢子，進而降低其在果蔬貯藏中的危害，特別是當O2/CO2主動自發氣調的CO2比例超過10%情況下，抑制效果更為顯著。該研究結果為果蔬貯藏過程中霉菌的控制提供了理論參考。