病原相關分子模式對人3D皮膚皮脂腺模型表皮細胞增殖與分化影響的研究

李 昕 曹 珂 魏子妤 侯霄梟 胡婷婷 潘展硯 吳 瓊 Christos C. Zouboulis 鞠 強

1上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院皮膚科，上海，200127；2上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院南院皮膚科，上海，201112；3 Departments of Dermatology, Venereology, Allergology and Immunology, Dessau Medical Center, Brandenburg Medical School Theodor Fontane, Germany

人皮膚上定殖了多樣的微生物菌群，可能與痤瘡、玫瑰痤瘡、特應性皮炎、銀屑病等皮膚疾病有關[1-3]。作為寄居在人表皮的正常生物菌群，微生物也參與了皮膚正常生理功能的發揮與調節如參與皮膚屏障功能[4，5]，但微生物對于表皮的作用是否具有普遍性以及與微生物的量之間的關系還缺乏相關研究。病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)是病原微生物表面結構恒定且進化保守的分子結構，包括革蘭氏陽性菌的細胞壁成分脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)和肽聚糖(peptidoglycan，PGN)以及革蘭氏陰性菌的細胞壁的成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，為微生物生存必需和宿主天然免疫細胞特異性識別的分子基礎和微生物致病的主要結構。為了探究皮膚微生物對表皮的增殖與分化的影響以及微生物的量與其之間的關系，我們使用了皮膚和皮脂腺細胞共培養的3D離體皮膚模型。研究不同濃度的PAMPs對皮膚表皮細胞增殖及分化的影響，評估皮膚微生物作為皮膚屏障的一部分，對人表皮的保護與調節作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 LPS(Sigma，來源于大腸桿菌055：B5)，溶于磷酸鹽緩沖液中，分裝后-20℃備用；LTA(Sigma，來源于金黃色葡萄球菌)，溶于雙蒸水中，分裝后-20℃備用；PGN(Sigma，來源于金黃色葡萄球菌)，溶于PBS中配成混懸液，分裝后-20℃備用；兔抗人Ki67一抗(Servicebio，GB13030-2)，鼠抗人CK10(Cytokeratin 10)一抗(Santa Cruz Biotechnology，sc-23877)。免疫組化試劑盒(博士德)，DAB顯色劑(博士德)，石蠟包埋機(Leica)，自動脫水機(Leica)，石蠟切片機(Leica)，正置熒光顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SZ95人皮脂腺細胞由德國Dessau臨床醫學中心皮膚科Zouboulis教授饋贈，將穩定傳代的30～40代細胞用于實驗。細胞培養在Sebomed基礎培養基中(德國 Biochrom公司)，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生長因子、100 U/mL青霉素、100 mg/L 鏈霉素(美國Gibco公司)、l mM CaCl2(美國Sigma公司)。置于37℃、5% CO2培養箱中，培養液每兩天更換一次。新鮮配制工作培養基。

共培養之前，先將細胞按照3.5×105個/孔接種至24孔板中，培養基換為無激素培養基(Sebomed基礎培養基中加入10%無激素胎牛血清，5 μg/L表皮生長因子、100 U/mL青霉素、100 mg/L 鏈霉素、l mM CaCl2)培養24 h，直至細胞密度長至100%。

1.2.2 離體皮膚準備 10份皮膚標本取自20～70歲志愿者頭面部，皮膚標本新鮮健康，無皮膚炎癥，創傷，腫瘤等。皮膚取下后，在PBS中進行處理，去除皮下脂肪血管等結締組織后將皮膚切開均分為相同大小直徑為3～5 mm的等份。制備好的皮膚表皮朝上將其漂浮在無激素培養基中進行單獨培養過夜。

1.2.3 皮膚與SZ95皮脂腺細胞共培養 將過夜培養后的皮膚表皮層朝上移至24孔板中直接接觸密度為100% 的SZ95皮脂腺細胞。培養基換為無血清培養基(Sebomed基礎培養基中加入0.1% 牛血清白蛋白，5 μg/L表皮生長因子、100 U/mL青霉素、100 mg/L 鏈霉素、l.5 mM CaCl2， 1.5×10-7M亞油酸，10-6M視黃醇)，每孔250 μL，并根據皮膚的不同性別年齡加入相應激素，具體方法見參考文獻[6]。

1.2.4 石蠟切片，蘇木素-伊紅染色 培養7天后，皮膚組織立即放入4% 多聚甲醛中固定24 h以上。固定完全后對組織進行脫水和包埋，在石蠟切片機切出連續完整的3～5 μm的切片，進行HE(Haematoxylin-eosin)染色，水洗5 min，梯度過酒精和二甲苯后用中性樹脂封片，通風櫥吹干，次日顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫組化(immunohistochemistry，IHC) 取待用切片，脫水后在檸檬酸鈉溶液中微波爐高火10 min進行抗原修復，冷卻至室溫。滴加3% 過氧化氫，室溫孵育10 min，PBS洗3次。取出切片，滴加5% BSA，室溫封閉30 min，甩去血清，滴加用PBS稀釋的一抗，濕盒中4℃過夜，次日轉入PBS中洗3次。滴加二抗，室溫孵育1 h后PBS洗3次。顯微鏡下進行DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，梯度脫水過二甲苯后中性樹脂封片，次日顯微鏡下觀察。

1.2.6 統計學方法 每個組織在相同放大倍數下隨機選取6個不重復視野，HE染色圖片用Photoshop軟件勾選出每個視野中所見的表皮面積，表皮面積下界為真皮乳頭與基底細胞邊界，上界為皮膚角質層表面[6]。免疫組化使用ImageJ軟件計算染色面積，Image-Pro Plus軟件計算每張圖片的累積光密度(IOD)，采用SPSS 19.0進行數據分析，兩組間比較采用t檢驗，每組實驗至少重復3次，結果以P<0.05有統計學意義。采用Graphpad 7.0作圖。

2 結果

2.1 3D皮膚皮脂腺模型更好的維持了表皮完整性 為了證實該模型下表皮的完整性，我們采用HE染色和Ki67研究體外培養7天后表皮完整性的情況(見圖1)。結果顯示：A組 與皮脂腺共培養(A2)的皮膚與單獨培養(A3)相比較，其表皮表現出更加完整的皮膚結構和增殖活性。共培養的離體皮膚組織具有完整的基底細胞帶和表皮角質層(圖A2黑箭頭)；單獨培養的皮膚組織基底細胞出現空泡變性(圖A3紅箭頭)，退化甚至局部基底細胞帶消失(圖A3藍箭頭)同時皮膚組織角質層變薄，角質層與表皮發生脫離(圖A3黑箭頭)。B組 共培養的皮膚組織(B2)與新鮮皮膚組織(B1)具有相似的Ki67表達(圖B1，B2黑箭頭)，表明共培養模型可以保持表皮細胞增殖活性，單獨的離體皮膚組織(B3紅箭頭)幾乎檢測不到Ki67表達。

2.2 LTA，LPS，PGN呈濃度依賴性誘導表皮增厚 為觀察PAMPs在不同濃度下對表皮厚度的影響，體外組織培養7天后，HE染色并計算表皮面積，兩組間比較使用t檢驗。結果顯示：在0～200 μg/mL濃度間，PAMPs對表皮增厚(面積，單位μm2)的影響呈濃度依賴性增長。各濃度相對于對照組，增長的差異均有統計學意義(P<0.05)，其中，LTA在200 μg/mL 時表皮面積為43401±754.9 μm2，表皮面積增長較2 μg/mL(31404±1542 μm2) 和2 μg/mL(18477±691.7 μm2)有明顯差異(P<0.0001)； LPS在200 μg/mL時表皮面積為86178±6656 μm2，表皮面積增長較2 μg/mL(65388±1222 μm2) 和2 μg/mL(69814±6842 μm2)有明顯差異(P<0.01)；PGN在20 μg/mL濃度時表皮增厚(54363±3104 μm2)高于2 μg/mL(35859±1083 μm2)(P<0.001)，與200 μg/mL濃度時表皮增厚(46617±1725 μm2)比較無統計學差異(見圖2)。

2.3 LTA，LPS，PGN對表皮細胞增殖與分化影響的研究 為確認PAMPs對表皮細胞增殖和分化的影響，我們對組織進行增殖指標Ki67 和分化指標CK10免疫組化染色，并使用ImageJ軟件分析染色面積，Image-Pro Plus軟件分析累積光密度(IOD)。結果見圖3。在濃度為2、20、200 μg/mL的LTA， LPS，PGN刺激下，表皮基底層及角質層Ki67及CK10的表達增加。LTA在20 μg/mL濃度時Ki67的染色面積(75.67±3.288 μm2)和IOD(17.01±0.7255)均最大，結果與2 μg/mL (染色面積:52.7±2.591 μm2；IOD：11.74±0.4534)時有顯著差異(P<0.01)，與200 μg/mL(染色面積：67.2±2.935 μm2；IOD：15.77±1.463)無明顯差別；LPS和PGN均在200 μg/mL時染色面積和IOD值最大，結果相較于其他兩個濃度有明顯差異(P<0.01)。LTA在200 μg/mL濃度下CK10的染色面積(10.13±0.3602 μm2)最大，在2 μg /mL時IOD(119±1.174)最大，數據相較于其他兩個濃度有顯著差異(P<0.01)；LPS在20 μg /mL濃度時染色面積(3.933±0.087 μm2)和IOD(55.31±5.844)均最大，染色面積數值較2 μg/mL(1.074±0.097 μm2)有顯著差異(P<0.01)，但與200 μg/mL(3.824±0.1047 μm2)間無統計學意義。PGN在20 μg/mL時染色面積和IOD值均最大，與其他兩個濃度比較，均有明顯差異(P<0.01)。

A組：A1 新鮮對照組，A2 皮膚與皮脂腺細胞共培養7天，A3 單獨培養離體皮膚7天(HE，×400)； B組：Ki67免疫組化染色，B1 新鮮對照組，B2 皮膚與皮脂腺共培養7天，B3 單獨培養離體皮膚7天(免疫組化，×400)

圖1 3D皮膚皮脂腺模型對表皮完整性與基底細胞增殖活性的影響

圖2 2 μg/mL、20 μg/mL、200 μg/mL的磷壁酸，脂多糖，肽聚糖對表皮增厚的影響 (HE，×400)

3 討論

表皮具有防止水分流失、維持體溫、隔離病原體的重要功能[7]。皮膚微生物是人體微生態的重要組成，包括葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬、馬拉色菌屬以及鏈球菌屬等等[8]，微生物群廣泛參與了皮膚的免疫調節和維持局部穩態[7，9]，不同的皮膚微生物可以以不同的分布和數量穩定分布[10]在皮膚各層，構成不同的微生物群落，參與皮膚生理學作用。痤瘡丙酸桿菌主要聚集在毛囊皮脂腺單位，具有調節皮脂腺的分化及脂質合成，維持皮膚表面溫度和脂質平衡[11]；葡萄球菌屬和鏈球菌分布在角質層深層，可能在表皮修復方面有重要作用[12]。不僅如此，皮膚微生物還可以分解代謝產物和調節免疫反應[13，14]，其自身和分解的代謝產物可以調節淋巴細胞歸巢和脂質代謝[15]。已有研究證實，馬拉色菌和益生菌均可以促進表皮分化蛋白的表達，為微生物對表皮屏障的保護作用提供了依據[16，17]。

3D皮膚皮脂腺模型是近年來發展起來的用于皮膚生理病理及藥物評價的體外模型[18]。該方法在原皮膚組織培養的基礎上，增加了和永生化SZ95人皮脂腺細胞共培養[19]。皮脂腺具有向皮脂腺細胞和角質形成細胞雙向分化潛能的干細胞功能[20]，帶有完整皮脂腺的模型可以更好地維持表皮的完整性，為實驗的可持續性提供可能。我們對該模型進行形態學及基底細胞增殖評估，驗證了該模型比單純的皮膚組織培養可以更好的維持表皮完整和生物學活性。

我們在該模型上進一步探索微生物對表皮增殖與分化的作用。結果表明，三種PAMPs在0～200 μg/mL范圍內劑量依賴性地促進表皮增殖。其中，LTA和LPS在200 μg/mL濃度時表皮增厚最大，而PGN在20 μg/mL即達到最高值，我們推測，革蘭氏陽性菌的胞壁成分對促進表皮細胞分化可能具有更加明顯的作用。PGN是革蘭氏陽性菌如包括丙酸桿菌細胞壁的重要組成部分，在一項通過膠帶粘貼剝離的表皮屏障損傷模型中，在皮膚去除角質層后的起始階段觀察到了丙酸桿菌的相對增加[19]，我們推測，相對于其他皮膚微生物，丙酸桿菌在皮膚修復方面可能具有更加即時的反應[12]。此外，LTA和LPS在較低濃度時即可對表皮細胞產生明顯的促分化作用，但兩者的表皮增厚最明顯在200 μg/mL濃度，可能LTA和LPS在較低濃度時促進表皮細胞的分化，但只有在高濃度時才可以最大程度地促進表皮細胞增殖，說明微生物濃度的變化影響了表皮增殖和分化。PGN在20 μg/mL濃度時表皮增殖及促分化作用均達到最大，這可能是痤瘡丙酸桿菌定殖與增殖的變化在皮膚疾病中具有明顯作用的原因之一。

A組：新鮮對照，空白對照及在2、20、200 μg/mL濃度刺激下，LTA，LPS，PGN增殖指標Ki67免疫組化染色(IHC，×400)；B組：表皮在對照組及不同濃度LTA，LPS，PGN刺激下，分化指標CK10免疫組化染色(IHC，×400)

圖3 病原相關分子模式對表皮細胞增殖和分化的影響

人皮膚微生物的種類和數量會隨著年齡性別的不同而產生差異。新生兒皮膚的微生物是獲得性的，根據生產的方式可以從母體獲得一定的微生物[21]，到青春期時，由于激素水平的刺激，皮膚微生物的菌群結構和分布會發生很大的改變，例如，促進皮脂分泌的痤瘡丙酸桿菌就會占主導作用[22，23]。另外，由于年齡性別以及與疾病易感性的個體差異，不同年齡段會發生不同，最常見的就是青春期痤瘡的高發率[24]；特應性皮炎常常起病于兒童或青春期前，并可能持續終生[25]。這表明微生物的種類和量的變化可以對人皮膚生理產生不同的影響，一旦微生物的種類或者微生物的量發生了實質性改變，就有可能會造成病理變化。我們的實驗結果也說明了微生物可以促進表皮增厚，這可能是微生物對表皮細胞增殖和分化影響的結果。

總之，本研究探討了皮膚微生物對表皮細胞有促進增殖和調節分化的作用，并劑量依賴性誘導表皮增厚，這可能是微生物參與皮膚生理、保護皮膚屏障的機制之一。微生物是皮膚屏障和功能的重要組成，對于相關疾病，我們不應以單純消滅微生物為治療目的。