腎透明細胞癌基因拷貝數變異與mRNA差異表達的整合分析

朱 進 丁曉飛 周 軍 陳 光

腎透明細胞癌是最為常見的腎癌組織學類型，其占比高達80%～86%，且預后明顯差于其他腎癌的亞型(如乳頭狀癌和嫌色細胞癌)[1]。由于腎透明細胞癌的發生率逐年增長，已成為嚴重危害我國居民健康的疾病之一，故需要對此類腫瘤進行深入研究來提高腎透明細胞癌的治療效果[2]。本研究通過對腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫的腎透明細胞癌組織樣本基因mRNA和拷貝數進行整合分析，挖掘腎透明細胞癌中拷貝數變異的功能，從分子水平推測其對基因表達的影響，為腎透明細胞癌的診斷和治療提供分子標記和靶點。

資料與方法

1.數據下載及篩選:從TCGA數據庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載了腎臟透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)相關基因的拷貝數和表達數據(皆為level3數據)。對樣本進行篩選，僅分析同時具有表達和拷貝數據的癌癥樣本和具有表達數據的正常樣本，數據統計詳見表1。

表1 腎臟透明細胞癌樣本概況

2.拷貝數變異分析:從TCGA下載Affymetrix SNP 6.0的marker文件，用GISTIC 2.0分析拷貝數變異區域，版本號為GISTIC_2_0_22，拷貝數擴增或缺失的閾值設為0.1，顯著性閾值P值設為0.25，其他參數均為默認。

3.差異表達基因數據分析：(1)整理差異表達基因數據：將各個樣本中基因表達的原始計數整合成一個矩陣(行為基因，列為樣本)，然后剔除表達量低的基因。(2)比較癌癥和正常樣本之間的差異表達基因：用R語言包edgeR對表達矩陣進行歸一化處理和差異表達分析，該包采取的是對數表達比率的加權截斷均值(trimmed mean of M values，TMM)歸一化方法[3,4]。P值用Benjamini-Hochberg (BH)方法校正，差異顯著性的篩選閾值為log2 fold-change(logFC)≥2，FDR<0.01。

4.差異表達基因和染色體拷貝數變異整合分析:查看基因拷貝數的擴增和刪失與基因表達上調和下調之間的關系，并計算基因拷貝數與基因表達之間的相關系數，P值用BH方法校正。

5.差異表達基因的功能富集分析：利用R包clusterProfiler(Version 3.2.11, http://www.bioconductor.org/packages/release /bioc/html/clusterProfiler.html)對差異表達mRNA數據進行KEGG pathway及GO功能分析，并對差異表達的mRNA做氣泡圖展示GO和KEGG的P值前15位的分析結果，顯著富集的閾值為P<0.01[5,6]。

6.統計學方法:癌癥和正常樣本之間基因的差異表達利用R軟件Limma包的t檢驗分析，進一步用Benjamini-Hochberg (BH)方法校正P值，差異顯著性的篩選閾值為log2 fold-change(logFC)≥2，FDR<0.01。基因拷貝數的擴增和刪失，與基因表達上調和下調之間的相關性采用R語言計算Pearson相關系數，同樣利用BH方法校正P值,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.腎臟透明細胞癌中顯著的拷貝數變異區域:對所有樣本的片段數據用GISTIC方法進行分析，525例腎臟透明細胞癌全基因組拷貝數變異狀況見圖1A，顯著擴增和缺失區域分別單獨見圖1B和圖1C。

圖1 GISTIC分析結果

2.腎臟透明細胞癌中基因表達差異分析：R語言包分析癌癥樣本與正常組織間的基因表達差異，一共得到1738個差異表達的基因(differntially expressed genes, DEGs)，其中1171個表達上調，567個表達下調。對于這些差異表達基因，筆者做了聚類圖(圖2)，可以看到這些基因能夠將癌癥和正常樣本清晰的分開，分析結果可靠。

3.差異表達基因和染色體拷貝數變異整合分析結果：對上述差異表達基因和染色體拷貝數變異進行整合分析，如圖3的韋恩圖所示，有30個基因的拷貝數變異和表達變化具有相同的趨勢，其中13個癌癥中拷貝數增加的基因，其表達也上調；17個癌癥中拷貝數降低的基因，其表達也下調。30個拷貝數變化和表達變化一致的基因的結果詳見表2。

圖2 腎臟透明細胞癌及正常腎臟組織間差異表達基因聚類圖藍色表示正常樣本，紅色表示癌癥樣本

圖3 差異表達基因和染色體拷貝數變異整合分析的韋恩圖

4.差異表達基因的功能富集分析：(1)KEGG通路富集分析差異表達基因：KEGG通路共富集到18條通路(圖4)，其中顯著富集的通路有細胞因子與細胞因子受體的相互作用通路、吞噬體作用通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性作用通路及細胞黏附分子(CAM)作用通路等。(2)GO功能富集分析差異表達基因：GO功能富集分析發現差異表達基因共富集到382條GO生物過程，顯著富集的GO生物過程包括細胞活化調節、T細胞聚集、淋巴細胞聚集、白細胞聚集、白細胞活化調節、白細胞與細胞黏附(圖5)。

討 論

腎癌是起源于腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤，全稱腎細胞癌，占成人腎臟惡性腫瘤的90%～95%，而腎細胞癌中又以透明細胞癌為主，其占比約為80%～86%。據《衛生統計年鑒》和國家癌癥中心發布的《2017年中國腫瘤的現狀和趨勢》報告顯示，我國腎臟腫瘤發生率為3.8/10萬，每年新發患者約為6.7萬，發生率躍居所有惡性腫瘤的第16位。腎癌在泌尿系統腫瘤相關死亡中已經超過膀胱癌位居第1位，在所有癌癥相關致死中居第14位。中國腎癌發生率在過去20年間，以平均每年6.5%的速度增長，速率遠高于腎癌高發的發達國家[7, 8]。

腎細胞癌對于化療和放療不敏感，手術仍是治療腎癌的唯一可靠方法，外科手術目前仍是腎癌的首選治療方法，但由于早期腎癌常無臨床癥狀，約20%～30%腎癌被確診時既為晚期，另外約有20%～30%的患者在手術后1～2年內出現遠處轉移[9，10]。目前晚期腎癌的治療多采用以藥物為主的綜合治療，但效果參差不齊，有遠處轉移的晚期腎癌患者5年總體生存率僅為10%[9，11]。靶向藥物治療是轉移性腎癌的一線及二線治療手段，2005年美國FDA先后批準了索拉非尼、舒尼替尼、替西羅莫司、依維莫司等多種靶向方案用于轉移性腎癌的治療[12,13]。但是由于腎癌發病機制十分復雜，現有靶向藥物均普遍存在客觀有效率低及改善生存尚有限的問題[14]。因此，揭示腎癌治療新靶標及發現腎癌早期診斷生物學標志物，仍是腎癌基礎與臨床研究的重點。

筆者從TCGA腎癌數據庫下載525例腎癌及72例正常腎臟樣本的拷貝數及mRNA表達數據，并進行整合分析，希望找到差異基因。通過GISTIC對腎癌拷貝數的分析，識別腎癌拷貝數變異區域，其中包含一些公認的致癌基因所在區域，例如MYC、PI3K、NEK9及SOX11等。隨后進一步對這些位于變異區域內的基因進行正常和腫瘤兩類樣本間的比對分析，一共發現30個差異表達基因(P<0.01)，其中有13個上調基因(包括PLK2、ADAM6、GRM8、CCL4、HLA-B、HLA-DQA2、BTNL9、KIR2DL4、MLIP、 CDH4、 NLGN1、SLC2A14、GOLGA8B)和17個下調基因(包含CHL1、SIM1、CA8、CALB1、SFRP1、DLGAP2、PHYHIP、ARC、ESRP1、C8orf4、DUSP26、GRHL2、FAM167A、PKHD1L1、MAL2、SLC26A7、FER1L6)。

表2 30個差異表達基因和染色體拷貝數變異相關性分析

Amp&Up.擴增和表達上調；Del&Down.刪除和表達下調

圖4 差異基因通路富集分析氣泡圖

圖5 差異基因GO富集分析氣泡圖

雖然在拷貝數變異和mRNA差異表達分析中發現一些公認的致癌或抑癌基因包含在本研究的分析結果中，但是上述30個拷貝數和mRNA表達同向變化的基因在腎癌中相關研究較少。其中ESRP1基因已被證實參與于乳腺癌上皮細胞的間質轉化(EMT)過程并影響乳腺癌患者的生存時間，而結直腸癌患者過表達PLK2基因會導致化療耐藥以及較差的預后[15，16]。

殺傷細胞免疫球蛋白樣受體2DL4(killer-cell immunoglobulin-like receptor 2DL4，簡稱KIR2DL4，也稱CD158d)在臨床腎癌樣本中存在明顯的基因拷貝數擴增和RNA水平表達上調。同時，其配體——非經典人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen - G, HLA-G)在腎癌組織中的表達也明顯高于癌旁組織。KIR2DL4為殺傷性細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)基因家族中的一個功能性結構基因，位于人染色體10q13.42，基因全長約10.4kb，其編碼蛋白KIR2DL4分子是自然殺傷性(natural killer,NK)細胞受體(NKR)的一種，主要分布在NK細胞膜，由胞外區、跨膜區和胞質區組成[17]。KIR2DL4與經典KIR2D家族抑制性受體不同，其胞內區只含有一個免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)，而跨膜區還含有一個帶正電荷的精氨酸殘基(協同激活性信號的傳遞)。同時具有胞內“抑制性”ITIM結構域和跨膜區“激活性”精氨酸殘基，顯示其在特定情況下可發揮抑制性或活化性受體的作用，但也提示該受體調控機制的復雜性[17, 18]。人白細胞抗原G(human leukocyte antigen G, HLA-G)是KIR2DL4的唯一配體，HLA-G在多種腫瘤細胞中呈異常高表達，且其表達水平與患者的不良預后相關，提示HLA-G/KIR2DL4功能軸可能參與腫瘤的免疫逃逸[19,20]。

本研究還對差異表達基因進行了KEGG通路富集分析以及GO功能富集分析，發現以趨化因子/受體(CXCL/CXCR)功能軸為代表的細胞因子/受體相互作用通路及非經典人類白細胞抗原G/殺傷細胞免疫球蛋白樣受體2DL4(HLA-G/KIR2DL4)為代表的自然殺傷細胞活性信號通路等在腎透明細胞癌中異常調控。同時發現除VEGF/VEGFR、VHL/HIF、mTOR或PD1/PDL1等信號通路外，趨化因子通路介導的癌細胞遷移、侵襲及NK細胞介導的腫瘤免疫逃逸在腎癌的發生、發展中也發揮重要作用，可能為腎癌靶向治療新策略。

綜上所述，通過對腎臟透明細胞癌基因拷貝數數據和表達數據的整合分析，獲取腎癌的致癌或抑癌信息，可為腎癌發生、發展機制研究、早期診斷和治療提供新的思路。