鎳對紅裸須搖蚊幼蟲的毒性效應

石雅峰 龍辰 趙樅 李若群 閆春財 劉文彬

摘要??[目的]以紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi）幼蟲為暴露對象，研究重金屬鎳對紅裸須搖蚊幼蟲的毒性及其對抗氧化酶系統的影響。[方法]采用急性毒性試驗方法，計算半數致死濃度（LC50）。采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量，采用可見光法測定CAT活性，采用WST-1法測定SOD活性，采用比色法測定POD活性。[結果]重金屬鎳對紅裸須搖蚊4齡幼蟲24、48、72、96 h LC50分別36.58、 12.36、2.21和0.66 mmol/L。鎳脅迫紅裸須搖蚊24 h后，各濃度組SOD和CAT活性均沒有顯著變化。48 h和72 h后，各濃度組與對照組存在顯著差異;96 h后，SOD活性僅在高濃度時表現為顯著增強的效應，各濃度組CAT活性表現為增強效應。

在24 h和48 h后，POD活性均沒有顯著變化，72 h后各濃度組POD活性呈現增強的趨勢，96 h后POD 活性逐步下降。[結論]CAT和SOD活性在急性暴露期受到顯著誘導，表現出相似的變化規律。POD活性表現為先下降后上升的趨勢。

關鍵詞??紅裸須搖蚊;重金屬鎳;急性毒性試驗;抗氧化酶

中圖分類號??X??174文獻標識碼??A

文章編號??0517-6611（2020）04-0084-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.025

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Toxic Effects of Nickel Exposure on Propsilocerus akamusi Larva

SHI Ya-feng，LONG Chen，ZHAO Cong et al??（College of Life Sciences，Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract??[Objective] To investigate the toxicity of heavy metal Ni to the larvae of Propsilocerus akamusi and its influences on the antioxidant enzymes system with P.akamusi as exposure object.[Method] Using acute toxicicity test method，the medium lethal concentration （LC50） was calculated by using SPSS software.The protein content was determined by Coomassie Brilliant Blue G-250 method，CAT activity was determined by visible light method，SOD activity was determined by WST-1 method，and POD activity was determined by colorimetry.[Result]LC50 of heavy metal nickel to 4-instar larva of P.akamusi for 24，48，72 and 96 h were 36.58，12.36，2.21，and 0.66 mmol/L，respectively.There was no significant change in SOD and CAT activities after Nickel exposure to P.akamusi larvae 24 h. After 48 and 72 h， there were significant differences between each concentration group and the control group.After 96 h，SOD activity was only significantly enhanced at high concentrations，while CAT activity was enhanced in each concentration group. POD activity showed no significant change after 24 h and 48 h，and POD activity ?in each concentration group ?showed an enhanced trend after 72 h and POD activity gradually decreased after 96 h.[Conclusion]The activities of CAT and SOD were significantly induced during acute exposure，showing similar changes.POD activity presented an first decreasing and then increasing trend.

Key words??Propsilocerus akamusi;Heavy metal Nickel;Acute toxicity test;Antioxidant enzymes

在過去的幾十年里，有毒重金屬導致的水體污染引起了人們的廣泛關注[1-3]，與有機污染物不同的是重金屬污染物無法被生物降解、具有很強的生物富集效應且對土壤的污染不可逆，對環境有較大的破壞力[4]。鎳是一種在自然界中廣泛存在的重金屬，鎳和鎳化合物有較高的生產價值，比如鎳礦的開采和提純、電鍍和鎳鎘電池的生產等[5]。工業化進程加重了水生生態系統的重金屬污染狀況。在常規水體環境中，Ni2+濃度為1～10 μg/L，但在一些嚴重污染的水體中鎳的排放量會增加50～100倍[6]。

搖蚊幼蟲是典型的水生無脊椎動物，主要生活于淡水水域的底棲環境中，不僅是經濟魚類的餌料，而且是水環境生物監測良好的指示生物[7]。紅裸須搖蚊幼蟲抗逆性強、易于獲取、價格低廉，具有廣闊的市場前景。目前對紅裸須搖蚊幼蟲的毒理學研究主要集中在重金屬銅、鉻、汞等、農藥及其他有機污染物方面，以單一或復合污染物暴露的方式開展急性和慢性毒性試驗，并對污染物脅迫下抗氧化酶系和解毒酶系的活性水平進行了廣泛深入的研究[8-10]。此外，在基因組學、蛋白質組學方面也取得了一定的進展[11]。

動物體內的抗氧化酶系，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等是抗氧化應激的第一道防線，可以在個體遭遇不良環境時，清除體內不斷產生的氧自由基，保護細胞免受氧化損傷，從而使個體耐受性增強。關于逆境脅迫下紅裸須搖蚊幼

蟲體內酶活性的變化，耿飛飛等[8]研究發現紅裸須搖蚊對Hg2+脅迫的敏感性較強，Hg2+刺激后其體內過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉氨酶（GST）都有顯著變化。鄭先云等[12]研究發現紅裸須搖蚊對Cd2+脅迫的敏感性較低，在Cd2+短時間作用下CAT活性沒有顯著變化。

綜上可知，國內外學者對重金屬Cd2+、Cd2+、Hg2+及多種有機物的毒性試驗[13-14]已取得較大進展，但Ni2+脅迫下紅裸須搖蚊的毒性效應研究較少涉及。筆者探究紅裸須搖蚊體內不同抗氧化酶對重金屬鎳的響應水平，旨在為紅裸須搖蚊的生物監測及Ni2+的排放標準制定提供理論依據，為進一步揭示Ni2+對水生無脊椎動物的毒性作用機理提供數據支撐。

1??材料與方法

1.1??材料

紅裸須搖蚊幼蟲購于天津花鳥魚蟲市場，以頭殼寬度鑒定齡期，選取活性較高、體長一致的4齡搖蚊幼蟲作為試驗材料。幼蟲的平均體重為（0.017±0.004）g，平均體長為（0.95±0.11）cm。在開始試驗前，幼蟲用曝氣除氯48 h的自來水（pH 8.2，溶解氧含量7.7～9.6 mg/L，總硬度7.1 mmol/L，水體溫度20 ℃）在自然光照下馴養7 d，試驗期間每天換水1次，每天多次監測水質指標，發現異常時及時換水并將死亡的搖蚊幼蟲挑出，直至幼蟲的自然死亡率穩定且小于1%時開展試驗，馴養期間水體持續曝氣，幼蟲采用饑餓處理。

氯化鎳（NiCl2·6H2O），由天津市津科精細化工研究所提供。過氧化物酶（POD）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、過氧化氫（CAT）試劑盒、Bradford蛋白質定量試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2??方法

1.2.1??重金屬的急性毒性試驗。

試驗依據《化學品 沉積物-水系統中搖蚊毒性試驗》國家標準[15]以及OECD[16]等相關規定進行，嚴格遵守實驗室安全規范。采用靜水染毒法進行毒性測定，在預試驗的基礎上，用蒸餾水等比例配制成鎳離子濃度分別為4.21、8.42、16.84、33.68、67.36 mmol/L的5個劑量組，在200 mL燒杯中進行試驗，每個容器中放入50只搖蚊幼蟲并以蒸餾水作為空白對照。每個濃度設置3個重復，試驗期間不投喂餌料。在試驗開始后24、48、72、96 h，觀察并記錄紅裸須搖蚊幼蟲的存活情況及活動狀態。用玻璃棒以中等力度觸碰搖蚊幼蟲腹部5～6節處，若搖蚊幼蟲未出現蜷縮運動則視為死亡。

1.2.2??酶活的測定。

1.2.2.1??酶液的制備。在急性毒性試驗的基礎上，以96 h LC50為參照，設置0、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mmo/L的鎳離子濃度梯度進行急性暴露試驗。在暴露24、48、72、96 h時取不同Ni2+濃度脅迫下存活的搖蚊幼蟲12只，各濃度組和對照組均進行3次重復，取出的搖蚊幼蟲用濾紙吸干體表水分，按照1∶9（m/V）的比例加入生理鹽水，在冰水浴條件下用研磨棒將搖蚊幼蟲研磨成10%的組織勻漿，2 500 r/mi下離心10 min后，取上清液進行測定。

1.2.2.2??酶活測定方法。嚴格按照SOD、POD、CAT試劑盒所標示的方法測定酶活，采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量，采用可見光法測定CAT活性，采用WST-1法測定SOD活性，采用比色法測定POD活性。

1.2.3??數據處理。

采用SPSS軟件中的Probit模塊計算紅裸須搖蚊在不同濃度、不同時間處理下的半數致死濃度（LC50）、線性回歸方程、95%置信區間和相關系數。采用ANOVA方差分析進行LSD多重比較，分析同一時間不同濃度以及不同時間相同濃度條件處理下各種酶活的變化。

2??結果與分析

2.1??紅裸須搖蚊幼蟲的中毒表現

接觸重金屬鎳溶液初期，試驗組搖蚊幼蟲活動劇烈，出現蟲體間纏繞的現象;暴露24 h后，各濃度組幼蟲活動情況與對照組均無顯著差異，但體色由紅色變為偏棕黃色;暴露48～72 h時，各濃度組搖蚊幼蟲活力顯著降低，處于靜止狀態，但觸碰活體搖蚊幼蟲腹部仍能觀察到蜷縮反應，對照組搖蚊自由游動。暴露96 h后，觀察到死亡的紅裸須搖蚊幼蟲身體發黑變軟，漂浮于溶液表面。

2.2??金屬鎳對紅裸須搖蚊幼蟲的急性毒性

由表1可知，重金屬鎳對紅裸須搖蚊4齡幼蟲24、48、72、96 h的LC50分別為36.58、 12.36、2.21和0.66 mmol/L。

2.3??紅裸須搖蚊幼蟲抗氧化酶對Ni2+的脅迫響應

2.3.1??鎳脅迫對紅裸須幼蟲不同暴露時間蛋白質含量的影響。

由表2可知，24 h時，低濃度組的鎳離子對蛋白質含量無顯著影響，而高濃度組會使蛋白質含量顯著降低，當鎳離子達到最高濃度（1.6 mmol/L）時蛋白質含量降至（35.35±0.18） g/L。48 h時，與對照組相比，高濃度組的蛋白質含量存在顯著變化，而其余組別與對照組無明顯差異。72 h時，隨著Ni2+濃度的增大，Ni2+誘導蛋白質含量升高的作用增強。96 h時，與對照組相比，各濃度組蛋白質含量均顯著升高。由此可見，高濃度的鎳短時間內可對紅裸須搖蚊幼蟲的靶標酶產生抑制作用，但隨著作用時間的延長，體內其他靶標酶被誘導增強，提高了蛋白質濃度。

2.3.2??鎳脅迫對紅裸須搖蚊幼蟲體內抗氧化酶活性的影響。

紅裸須搖蚊幼蟲在不同濃度梯度的Ni2+脅迫24、48、72、96 h后體內抗氧化酶活性的變化見表3。

2.3.3??鎳脅迫對紅裸須搖蚊幼蟲體內SOD活性的影響。

如圖1所示，鎳脅迫紅裸須搖蚊24 h時，各濃度組的SOD活性與對照組相比沒有顯著變化。48 h后，各濃度組的SOD活性均顯著升高，當Ni2+濃度為1.6 mmol/L時SOD活性達到最大值。72 h，在0.80 mmol/L的Ni2+脅迫下SOD受到的誘導程度最大，為（76.75±0.005） U/mg。96 h，SOD活性在高濃度時顯著下降，但SOD活性仍高于對照組。

2.3.4??鎳脅迫對紅裸須搖蚊幼蟲體內CAT活性的影響。由圖2可知，24 h時各濃度組CAT活性無顯著變化;48 h時，Ni2+濃度分別為0.2、0.4、0.8 mmol/L的試驗組CAT活性顯著增強（P<0.01）。72和96 h，各濃度組CAT活性均極顯著升高（P<0.01）。72 h，各濃度組CAT活性均高于對照組;96 h，CAT活性相對于72 h時有所下降，但始終高于對照組。

2.3.5

鎳脅迫對紅裸須搖蚊幼蟲體內POD活性的影響。從圖3可以看出，24、48 h時各濃度組POD活性與對照組相比無明顯變化;72 h，POD活性明顯下降（P<0.01）;96 h，POD活性顯著增強（P<0.01）。POD活性整體上呈現出前期無明顯變化、中后期先下降后上升的變化趨勢。

3??討論

通過急性毒性試驗發現，重金屬鎳對紅裸須搖蚊4齡幼蟲24、48 h的LC50分別為36.58和12.36 mmol/L，與閆賓萍等[17]研究鎳對羽搖蚊幼蟲的急性毒性結果相比，紅裸須搖蚊幼蟲比羽搖蚊幼蟲對鎳有更強的耐受性。Wentsel等[18]的研究結果為搖蚊具有較強耐受重金屬的能力提供了數據支撐。

近年來，大量研究結果表明，抗氧化酶活性可作為環境監測的生物標志物。該試驗通過鎳對紅裸須搖蚊幼蟲進行24、48、72、96 h的急性暴露試驗，監測幼蟲體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性的變化，進而揭示環境水體中重金屬鎳的生物響應情況。該試驗結果表明，短時間內紅裸須搖蚊幼蟲對鎳的敏感程度低，隨著作用時間的延長，SOD活性呈現顯著增強的趨勢，誘導產生的SOD用來消除鎳對紅裸須搖蚊幼蟲的活性損傷，96 h后氧自由基減少，SOD活性又逐漸恢復到正常狀態。CAT活性的變化趨勢與SOD活性大致相同，但96 h后CAT活性仍被顯著誘導，用來清除SOD作用氧自由基后產生的H2O2。72 h后，各濃度組POD活性與對照組相比顯著降低，但96 h POD活性又逐漸回升至顯著高于對照組的水平。

綜上所述，重金屬鎳對紅裸須搖蚊體內抗氧化酶活性有較大影響，CAT、SOD和POD活性均可作為監測重金屬鎳對環境影響的指標，CAT活性與SOD活性具有相同的變化趨勢，但CAT活性的變化響應在SOD活性之后表現出協同作用。

POD活性呈現出先下降后上升的變化趨勢，有可能是CAT、SOD活性的顯著增強抑制了POD的活性，隨著作用時間的延長，SOD活性在逐步減弱的同時，POD活性顯著上升。然而，此變化的分子機理還有待進一步研究。

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