miR-141-3p和miR-22-3p在胰腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

秦瑞峰，薛佳棟，霍浩然，張佳，袁增江

胰腺癌是臨床惡性程度較高的惡性腫瘤，手術后生存時間較短，目前發病率逐年上升且有年輕化趨勢，嚴重危害患者的生命安全[1-2]。如何改善胰腺癌患者的預后是目前臨床研究的重點，但相關突破有限，分子靶向干預成為新思路。miRNA是一種不能編碼蛋白質的單鏈RNA，在轉錄后水平調控基因表達，在細胞分化、增殖及凋亡的調節中發揮重要作用[3-4]。miR-141可抑制腦膠質瘤細胞生長并誘導其凋亡，miR-141-3p作為其重要亞型可能也有相似作用[5]；miR-22-3p可通過靶向膠質細胞升高基因-1(AEG-1)抑制非小細胞肺癌細胞的表達[6]，但目前關于上述2種miRNA在胰腺癌中扮演的角色研究極少。本研究檢測胰腺癌組織中miR-141-3p、miR-22-3p的表達量，探討其與疾病特征、預后的內在聯系，旨在尋找與胰腺癌發生發展關系密切的分子并為后續靶向治療提供新思路，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月—2017年1月在河北省邯鄲市中心醫院普外三科進行手術治療的胰腺癌患者92例作為研究對象，納入標準：(1)經術中組織病理確診為原發性胰腺癌；(2)首次確診疾病并接受手術治療；(3)符合手術治療指征且具有完整的臨床資料；(4)年齡≤80歲。排除標準：(1)合并其他原發惡性腫瘤性疾?。?2)合并嚴重營養不良，無法耐受手術創傷；(3)術前接受胰腺癌保守治療；(4)合并嚴重出凝血功能異常和/或自身免疫性疾病；(5)合并肺炎等活動性感染。其中男50例，女42例，年齡32～78(57.29±8.11)歲；腫瘤最大直徑(3.82±0.86)cm；腫瘤位置，胰頭28例，胰體尾64例；TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期27例、Ⅲ～Ⅳ期65例；腫瘤分化程度，低分化40例，中分化39例，高分化13例；淋巴結轉移62例，遠處轉移40例。取患者術中病灶標本及癌旁組織標本各92份進行分析，病灶標本經病理檢查確診為胰腺導管腺癌，癌旁組織標本經病理檢查確診無癌細胞。本研究通過醫院倫理委員會審核，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量PCR檢測miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺組織中的表達 取胰腺組織和癌旁組織適量，采用miRNA提取試劑盒(北京天根，CW0627)提取組織中的miRNA，采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根，SW2142S)將miRNA反轉錄為cDNA，miR-141-3p引物序列為5’-AGCGATTGAGCTGATGTCG-3’, 3’-TTAGGCTGACCAGTGATGAC-5’，miR-22-3p引物序列為5’-CTTGATGATAAGCTGAAGC-3’, 3’-CCTGAAGATGAGCGTAGGA-5’。采用miRNA實時熒光定量PCR檢測試劑盒(北京天根，CW2142S)配置PCR反應體系后按照以下程序進行反應：95℃ 3 min預變性，95℃ 5s、60℃ 15s重復40個循環，根據循環曲線，以U6為內參，計算miR-141-3p、miR-22-3p的表達量。設置癌旁組織中miR-141-3p、miR-22-3p的表達量為標準值100，計算胰腺癌組織中對應miRNA的相對表達量。根據胰腺癌組織中miR-141-3p、miR-22-3p表達量的中位數對胰腺癌患者進行亞分組，具體分為高表達、低表達組各46例。

1.3 預后隨訪 采用門診或住院復查、電話回訪等方式進行隨訪，隨訪截止時間為2019年6月30日，生存時間為確診日期至死亡日期或截止日期的時間。

1.4 統計學方法 使用軟件SPSS 19.0對數據進行統計處理。計量資料符合正態分布，以均數±標準差表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數或率(%)表示，2組間比較采用χ2檢驗；繪制Kaplan-Meier生存曲線，用Log-rank檢驗對2組生存時間的差異進行分析；采用COX多因素風險回歸模型分析預后的危險因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺組織中的表達比較 胰腺癌組織中miR-141-3p、miR-22-3p的表達量分別為75.39±9.12、64.22±8.07，均低于癌旁組織的100.00，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺組織中的表達比較

2.2 miR-141-3p、miR-22-3p表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 不同miR-141-3p表達的胰腺癌患者中，TNM分期、腫瘤分化程度、遠處轉移的分布差異有統計學意義(P<0.05)，性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、淋巴結轉移的分布差異無統計學意義(P>0.05)。不同miR-22-3p表達的胰腺癌患者中，遠處轉移的分布差異有統計學意義(P<0.05)，性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移的分布差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 miR-141-3p、miR-22-3p表達與預后的關系 患者隨訪2～38個月，隨訪中位時間為16個月。miR-141-3p、miR-22-3p高表達組患者的中位生存時間分別為21.2個月、20.8個月，明顯高于miR-141-3p、miR-22-3p低表達組患者的8.8個月、9.0個月，miR-141-3p、miR-22-3p高表達組患者生存率高于低表達組，經Log-rank檢驗，差異有統計學意義(Log-rank χ2/P=6.873/0.009，5.999/0.014)，見圖1。

2.4 胰腺癌患者預后的影響因素分析 建立COX比例回歸模型，因變量為胰腺癌患者預后狀況(存活=0，死亡=1)，根據表2選擇P<0.05的TNM分期、腫瘤分化程度、遠處轉移、miR-141-3p、miR-22-3p為自變量?；貧w過程采用逐步后退法，共有TNM分期、腫瘤分化程度、遠處轉移、miR-141-3p、miR-22-3p納入回歸方程，提示TNM分期較高、腫瘤分化程度較低、遠處轉移、miR-141-3p低表達、miR-22-3p低表達均是導致胰腺癌患者預后不良的危險因素(P<0.05)，見表3。

3 討 論

胰腺癌預后極差，絕大多數患者在確診后短期內死亡[7]。手術切除腫瘤是改善胰腺癌患者預后的最主要方式，但很大一部分患者仍出現術后短期內復發或者全身擴散，尋找在胰腺癌發生發展過程中具有重要作用的分子并進行靶向干預可能是未來該病治療的新手段之一?；谀壳癿iRNA在惡性腫瘤組織中的異常表達及在病情演進過程中發揮的重要作用，推測其在胰腺癌發生發展中也可能發揮一定作用。miR-141-3p、miR-22-3p均是重要的miRNA，國外研究報道，miR-141-3p在多種惡性腫瘤組織中表達不一，如可抑制腎癌細胞生長但對直腸癌細胞具有促生長作用，上調其表達可抑制結直腸癌細胞的生長轉移[8-10]；國內研究指出[11]，miR-141-3p異常表達可影響卵巢癌細胞的惡性生物學行為。miR-22-3p由miR-22前體3’端臂剪切而來，其在多種惡性腫瘤組織中呈異常低表達，可抑制乳頭狀甲狀腺癌進展，可能與其靶向抑制ATP環化酶的作用相關[12-14]；抑制miR-22-3p表達可促進肺腺癌進展，上調miR-22-3p表達可抑制肝癌細胞增殖[15-16]。目前國內關于miR-141-3p、miR-22-3p對胰腺癌發生發展的影響研究極少，本研究檢測胰腺癌組織、癌旁組織中上述miRNA的表達量發現，胰腺癌組織中miR-141-3p、miR-22-3p的表達量較癌旁組織明顯降低，推測異常低表達的miR-141-3p、miR-22-3p參與胰腺癌的發生發展。這與上述2種miRNA對腫瘤的抑制作用吻合，可能與Yoon等[17]的研究中所述靶向STAT4的作用相關，但具體機制未明，有待后續基礎研究深入明確。

表2 miR-141-3p、miR-22-3p表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 [例(%)]

表3 胰腺癌患者預后的影響因素分析

低miR-141-3p、miR-22-3p表達的胰腺癌患者TNM分期較高、腫瘤分化程度較低、遠處轉移發生率較高，而其在性別、年齡、腫瘤最大直徑、淋巴結轉移方面的差異則不明顯。TNM分期較高、腫瘤分化程度較低、遠處轉移均與癌癥惡性程度關系最為密切，以上結果從臨床病理特征方面說明，miR-141-3p、miR-22-3p異常低表達可加劇胰腺癌惡性程度。miR-141-3p低表達促進胰腺癌惡性分化及遠處轉移的機制不明，國外研究認為，可能與其影響PI3K/Akt信號通路活性、調節trim13相關凋亡通路功能等相關[18-19]。在miR-22-3p影響癌細胞惡性進展的機制方面，有研究認為可能與其調控eIF4EBP3、sirt1等基因表達的作用相關[20-21]，但目前尚無結論。關于miR-141-3p、miR-22-3p對胰腺癌細胞生物學行為影響的直接機制研究目前極少，有待后續研究進一步明確。

經COX回歸分析發現，TNM分期較高、分化程度較低、合并遠處轉移是導致胰腺癌患者生存時間縮短的危險因素，與此同時miR-141-3p、miR-22-3p低表達也是胰腺癌患者預后不佳的直接影響因素，這與上述miR-141-3p、miR-22-3p低表達者的病理特點結果一致，說明miR-141-3p、miR-22-3p低表達可促進胰腺癌病情進展。最后繪制生存曲線發現，miR-141-3p、miR-22-3p低表達的胰腺癌患者生存時間較短，進一步佐證了miR-141-3p、miR-22-3p表達變化對患者預后的影響。

綜上所述，胰腺癌組織中存在miR-141-3p、miR-22-3p異常低表達現象，與TNM分期、腫瘤分化程度、遠處轉移共同成為胰腺癌預后不良的獨立危險因素。靶向上調miR-141-3p、miR-22-3p表達量可能成為日后胰腺癌治療的新思路。本次研究也存在以下局限性，如納入病例數較少、未涉及miRNA表達影響胰腺癌病情的分子機制，有待后續大樣本臨床研究、基礎研究進一步探討。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

秦瑞峰：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；薛佳棟：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;霍浩然、張佳：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；袁增江：進行統計學分析