血清miR-124、miR-143水平與高血壓性視網(wǎng)膜病變關(guān)系的研究

韓月圣，焦瑞雪，張愛雪，崔迎欣，張乘瑞

高血壓性視網(wǎng)膜病變(hypertensive retinopathy，HRP)是由動脈血壓升高，引發(fā)全身小動脈硬化，進而造成視盤水腫、視網(wǎng)膜水腫、滲出等各種臨床癥狀，且具有較高病變率特點的眼科疾病，對患者日常生活及工作造成不良影響[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在外周血中廣泛存在的高度保守的小分子RNA，其在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中表達異常，可作為疾病診斷的潛在臨床指標[2]。患者發(fā)生高血壓后，外周血miRNA水平會發(fā)生改變，患者長期處于高血壓狀態(tài)，可引起視網(wǎng)膜病變[3]。Matsuoka等[4]研究顯示，微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)在腦卒中傾向的自發(fā)性高血壓中呈低表達，可通過影響緊密連接蛋白CLDND1水平，進而參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。微小RNA-143(microRNA-143，miR-143)在原發(fā)性高血壓患者外周血白細胞中表達上調(diào)，較高的miR-143水平為原發(fā)性高血壓的危險因素，其可能與原發(fā)性高血壓的發(fā)病進程有關(guān)[5]。但miR-124、miR-143在HRP患者血清中的表達情況及與HRP的關(guān)系尚未見相關(guān)研究報道。基于此，現(xiàn)觀察miR-124、miR-143在HRP患者血清中的相對表達水平，以期為HRP早期診療提供可靠臨床依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月—2019年6月中國核工業(yè)北京四○一醫(yī)院眼科診治HRP患者113例為研究對象(HRP組)，男57例，女56例，年齡50～63(56.47±5.79)歲；體質(zhì)量指數(shù)19.55～26.78(22.92±3.69)kg/m2；病程3～15(8.23±4.12)年。并以同期醫(yī)院健康體檢者115例為健康對照組，男59例，女56例，年齡51～64(57.06±5.93)歲；體質(zhì)量指數(shù)19.04～26.90(23.06±3.74)kg/m2。2組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)診斷標準：依據(jù)“中國高血壓防治指南2010”[6]修訂的高血壓視網(wǎng)膜病變的判定標準。(2)納入標準：①所有患者均經(jīng)眼底病專業(yè)醫(yī)生進行眼底檢查，均符合HRP診斷標準；②生理病理檢查資料完整者。(3)排除標準：①合并糖尿病、脂肪代謝異常、肥胖者；②合并嚴重肝腎功能不全、重度慢性肺阻塞者；③合并心肌梗死、心功能不全、不穩(wěn)定性心絞痛者；④合并酗酒、吸煙者；⑤合并青光眼、視神經(jīng)損傷等其他眼科疾病者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 臨床資料搜集：收集、統(tǒng)計一般資料；檢測所有研究對象收縮壓、舒張壓；采用葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖，胰島素釋放試驗測定空腹胰島素，生化儀器自動檢測總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇。

1.3.2 血清miR-124、miR-143表達檢測：2組受試者清晨空腹抽取肘靜脈血5～6 ml，室溫下靜置約40 min，離心收集上層血清，于-80℃保存待測。采用實時熒光定量法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測2組血清miR-124、miR-143表達水平。取出凍存血清，冰上解凍，加適量TRIzol(美國Qiagen公司)，參照其試劑說明書操作流程提取血清總RNA，檢測總RNA的完整性、純度、濃度。依據(jù)qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Ⅱ RT kit(德國QIAGEN公司)操作流程、注意事項配制逆轉(zhuǎn)錄反應體系20 μl，將血清總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應程序37.2℃ 60 min，活化反應體系中的逆轉(zhuǎn)錄酶;逆轉(zhuǎn)錄94.8℃ 6 min，抑制逆轉(zhuǎn)錄酶作用，終止逆轉(zhuǎn)錄反應。將反應體系置于冰上8 min，加無酶水，混勻，于-20℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR擴增檢測采用miScript SYBR Green PCR Kit(德國QIAGEN公司)，反應體系配制依照其說明書進行，擴增程序為：94.8℃ 12 min；94℃ 20 s，62℃ 40 s，40個循環(huán)。待測miRNA、內(nèi)參分別設置3個復孔進行定量檢測。miR-124、miR-143均以U6為內(nèi)參，對應引物序列見表1，兩者相對表達量均采用2-△△CT計算[7]。

表1 miR-124、miR-143及內(nèi)參U6的引物序列

1.3.3 VEGF、TNF-α、IL-6水平檢測：上述血清采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測VEGF、TNF-α、IL-6水平，具體操作參照相應試劑盒說明書(試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床資料比較 與健康對照組比較，HRP組患者收縮壓、舒張壓明顯升高(P<0.05)，空腹血糖、空腹胰島素、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 2組受試者臨床資料比較

2.2 2組血清 miR-124、miR-143水平比較 與健康對照組比較，HRP組患者血清miR-124表達水平顯著降低，miR-143表達水平顯著升高(P均<0.01)，見表3。

2.3 2組血清VEGF、TNF-α、IL-6水平比較 與健康對照組比較，HRP組患者血清VEGF、TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.01)，見表4。

表3 2組受試者血清miR-124、miR-143水平比較

表4 2組受試者血清VEGF、TNF-α、IL-6水平比較

2.4 血清miR-124、miR-143水平與SBP、DBP、VEGF、TNF-α、IL-6水平關(guān)系 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HRP患者血清miR-124與VEGF水平呈負相關(guān)(P<0.01)，miR-143與VEGF水平呈正相關(guān)(P<0.01)；血清miR-124、miR-143表達水平與SBP、DBP、TNF-α、IL-6水平均無明顯相關(guān)性(P>0.05)， 見表5。

表5 血清miR-124、miR-143水平與SBP、DBP、VEGF、TNF-α、IL-6水平的關(guān)系

2.5 HRP危險因素的Logistic回歸分析 以是否發(fā)生HRP為因變量，以SBP、DBP、VEGF、TNF-α、IL-6及血清miR-124、miR-143水平為自變量，行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示SBP、DBP、VEGF、miR-143是HRP的危險因素(P<0.01)，miR-124是HRP的保護因素(P<0.01)， 見表6。

2.6 血清miR-124、miR-143對HRP的診斷價值 ROC曲線顯示，血清miR-124對HRP預測診斷的曲線下面積(AUC)為0.838(95%CI0.787～0.889)，截斷值為0.91，其敏感度、特異度分別為84.1%、71.3%，約登指數(shù)為0.554；血清miR-143對HRP預測診斷AUC為0.870(95%CI0.823～0.918)，截斷值為1.28，其敏感度、特異度分別為84.2%、78.3%，約登指數(shù)為0.625；兩者聯(lián)合對HRP診斷的AUC為0.947(95%CI0.920～0.975)，其敏感度、特異度分別為94.7%、82.7%，約登指數(shù)為0.774，見圖1。

表6 Logistic回歸分析HRP的影響因素

3 討 論

HRP是高血壓持續(xù)一段時間后引起眼底血管及相關(guān)部位發(fā)生可視變化的心血管疾病，其在高血壓患者群體中發(fā)病率較高，可對患者視覺造成不可逆的損害[7]。因此，尋找可靠且高效的診斷指標及影響因素，對提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。

miRNA是廣泛存在于人體內(nèi)各器官、組織及血液中的單鏈核苷酸RNA分子，在細胞增殖、炎性反應、信號轉(zhuǎn)導、組織分化等生物學過程中起一定調(diào)控作用[8]。miRNA參與高血壓性心力衰竭、腎衰竭、腎纖維化、心臟肥大、出血性腦卒中及眼病等高血壓相關(guān)的病理過程[9]。miR-192-5p主要分布于腎臟中，其在高血壓患者中低表達，可預防高血壓的發(fā)展[10]。miR-7-5p在伴左心室肥大的高血壓患者血清中表達上調(diào)，其可能在高血壓性左心室肥大的發(fā)病進展中發(fā)揮重要作用[11]。miR-21在高血壓腎損傷患者尿液中表達異常，與腎損傷的功能標志物相關(guān)，可作為高血壓腎損傷和纖維化的潛在生物標志物[12]。以上研究證明，miRNA表達異常與高血壓及高血壓相關(guān)性疾病的發(fā)病進程密切相關(guān)，miR-124在青光眼中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可促進Müller細胞衍生的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞生長，具有治療青光眼的潛力[13]。Caruso等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在肺動脈高壓患者肺血管、內(nèi)皮細胞中呈低表達，其可作為治療肺動脈高壓的新型治療靶標[14]。以上研究表明，miR-124在動脈血壓升高的疾病中發(fā)揮重要作用。本研究中HRP組患者血清miR-124表達水平顯著下調(diào)，與miR-124在腦卒中傾向的自發(fā)性高血壓中趨勢類似[4]，提示血清miR-124表達水平可能影響HRP的發(fā)生發(fā)展過程。推測miR-124可能是通過調(diào)節(jié)鹽皮質(zhì)激素受體基因NR3C2的表達，降低腎素—血管緊張素系統(tǒng)的傳導信號，進而降低血壓[15],從而影響HRP的發(fā)生發(fā)展。miR-143-3p是miR-143家族成員，其在妊娠期高血壓中呈過表達，可用于篩選心血管疾病后期發(fā)展風險較高的患者[16]。miR-143在高血壓發(fā)展過程中表達失調(diào)，其可能參與并影響高血壓發(fā)生與發(fā)展[17]。以上研究表明，miR-143表達失調(diào)與高血壓疾病有關(guān)。本研究中HRP組患者血清miR-143表達水平明顯上調(diào)，提示miR-143可能在HRP發(fā)展進程中起到重要調(diào)節(jié)作用。miR-143可維持血管收縮性，參與動脈血壓的變化[15]，進而HRP發(fā)病進程。

微血管形成是視網(wǎng)膜發(fā)生病變的重要環(huán)節(jié)，VEGF是血管形成不可或缺的相關(guān)因子，能夠促進血管內(nèi)皮細胞分裂，加速血管新生[18]。HRP是一種炎性疾病，TNF-α、IL-6是重要的促進炎性的細胞因子，兩者可反映炎性程度[19]。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)VEGF、TNF-α在重度子癇前期患者視網(wǎng)膜中表達水平上調(diào)，表明VEGF、TNF-α可能在重度子癇前期引起的視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮作用。IL-6在HRP患者血清中呈高水平表達，經(jīng)非諾貝特治療后，其水平降低，表明IL-6可能參與HRP的發(fā)生、發(fā)展[19]。本研究中HRP組患者血清VEGF、TNF-α、IL-6水平明顯升高，提示HRP的發(fā)生與血管內(nèi)皮調(diào)節(jié)、炎性因子的作用關(guān)系密切。推測VEGF過表達可促進血管內(nèi)皮細胞增殖，其可能通過增加血管通透性，促進血管內(nèi)皮細胞遷移及血管新生，進而參與HRP發(fā)生發(fā)展；TNF-α可一定程度損害血—視網(wǎng)膜屏障，增強視網(wǎng)膜血管通透性，引起血管內(nèi)皮細胞增殖及血管外基質(zhì)產(chǎn)生過量，進一步引發(fā)視網(wǎng)膜血管增殖，從而在視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮促進作用；IL-6可通過誘導VEGF增加血管通透性，且其可通過細胞肌絲重排增加血管內(nèi)皮細胞通透性，從而促使視網(wǎng)膜病變加重。

本研究顯示，HRP患者血清VEGF水平與miR-124表達水平呈負相關(guān)，與miR-143表達水平呈正相關(guān)，提示miR-124、miR-143可能與VEGF相互作用，進而共同影響HRP的發(fā)病進展。分析原因，miR-124、miR-143作為miRNA成員，可能通過影響VEGF表達，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞增殖、分化、遷移，進而影響血管新生，從而影響HRP發(fā)病進程。進一步研究發(fā)現(xiàn)，SBP、DBP、VEGF、miR-143是HRP的危險因素，miR-124是HRP的保護因素，提示SBP、DBP、VEGF、miR-143等水平過高，miR-124表達水平過低，均可能增加HRP患病風險，及時動態(tài)監(jiān)控血清中miR-124、miR-143水平，有助于早期判斷并及早控制HRP的病情發(fā)展。血清中miR-124、miR-143水平對HRP的預測AUC分別為0.838、0.870，當血清miR-124相對表達量低于0.91或血清miR-143相對表達量高于1.28時，HRP患病幾率較高，提示血清miR-124、miR-143對HRP有一定診斷價值，血清miR-124、miR-143聯(lián)合診斷HRP的AUC為0.947，其敏感度94.7%，特異度為82.7%，提示miR-124、miR-143聯(lián)合診斷價值高于單獨診斷，兩者聯(lián)合可增加對HRP診斷的效能。

綜上所述，HRP患者血清中miR-124表達下調(diào)，miR-143表達上調(diào)，兩者可能參與HRP的發(fā)病發(fā)展過程，兩者聯(lián)合可增加HRP診斷價值，具有臨床參考價值。但該研究試驗樣本較少，結(jié)果可能存在一定偏差，且本研究檢測指標血清miR-124、miR-143對HRP的診斷價值未與SBP、DBP及臨床診斷指標做比較，后續(xù)研究將加大樣本量進行較深入的研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

韓月圣：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；焦瑞雪：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；張愛雪：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；崔迎欣：進行統(tǒng)計學分析；張乘瑞：課題設計，論文撰寫