腫瘤相關巨噬細胞CD163在乳腺癌組織中的表達及對乳腺癌細胞生物學特性的影響

陳馨，張薇，張偉杰，趙怡欣，吳鴻雁，姚永忠

作為一種高度異質性的惡性腫瘤，乳腺癌在我國的發生率和病死率逐年上升，發病率在(50～60)/10萬，且其發病率與年齡成正相關，其早期檢出率低，往往到中晚期才被發現[1-2]。隨著醫療水平的綜合發展，盡管該病已得到較好的治療及預后，但局部復發或遠處轉移甚至死亡的患者仍較多。文獻報道腫瘤轉移是引起乳腺癌患者死亡的主要原因[3]，而腫瘤微環境在腫瘤轉移過程中起著極其重要的作用，免疫細胞是腫瘤微環境重要組成部分，腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)作為免疫細胞代表，與腫瘤細胞相互作用，從而促進腫瘤的侵襲和轉移[4]。巨噬細胞分為2種類型，其中經典活化巨噬細胞稱之為M1巨噬細胞，主要分泌促炎介質，介導Th1型免疫應答;替代性活化細胞稱之為M2巨噬細胞，主要分泌抗炎介質，介導Th2型免疫應答[5]。研究表明,CD163特異性表達于M2型巨噬細胞[6]。文獻報道,在直腸癌、平滑肌肉瘤中CD163巨噬細胞浸潤密度與患者預后密切相關，且可作為疾病發生發展、轉移的預測指標[7-8]，而CD163在乳腺癌中的作用機制尚存在爭議，因此本研究采用免疫組織化學檢測CD163在乳腺癌組織中的表達，并分析其與臨床病理學參數的關系，同時干擾乳腺癌細胞中CD163的表達，觀察乳腺癌細胞增殖、侵襲及凋亡周期的變化，旨在為乳腺癌的防治和預后評估提供新的思路，報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2010年1月—2012年12月于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院普外科行乳腺外科手術切除的乳腺癌組織及其癌旁(距癌組織≥5 cm)正常組織標本各160份，所有入選患者在術前均未進行放化療和其他治療，且6年隨訪資料完整。160例患者，年齡25～83(48.32±12.23)歲；所有組織標本均在4%中性福爾馬林液中固定，然后常規取材石蠟包埋，用于后續免疫組織化學法檢測。

1.2 材料和試劑 乳腺癌細胞株MCF-7、巨噬細胞MH-S采購自美國ATCC公司，熒光標記的2'-O-甲基 siRNA CD163-FAM、穩定陰性對照siRNA CD163-NC和CD163、GAPDH 引物購自上海吉瑪生物技術有限公司。兔抗人CD163單克隆抗體采購自上海長島生物技術有限公司，辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG購自上海滬峰化工有限公司，鏈霉抗生物素蛋白—過氧化物酶(SP)試劑盒購自美國Abcam公司，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒采購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 免疫組織化學檢測CD163蛋白表達：將石蠟包埋的組織標本切成5 μm厚度的切片，放入40%酒精中，40℃水浴處理4 min，展開后置于60℃烘箱中進行烘片。采用二甲苯進行脫蠟20 min，然后梯度酒精進行水化，然后加入3%H2O2，室溫10 min，從而阻斷內源性過氧化物酶的活性，再對CD163蛋白進行高溫高壓組織修復，PBS進行沖洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封閉液，加入一抗，置于4℃冰箱過夜，PBS代替一抗作為陰性對照，次日取出使用PBS沖洗，每張切片滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗5次，每次3 min，加入DAB顯色水使用PBS沖洗終止顯色，沖洗10 min，鹽酸酒精分化后，梯度酒精脫水干燥，光鏡下觀察組織標本。

1.3.2 CD163蛋白表達判定標準及分組：CD163的陽性表達位于細胞膜，少量表達于胞質和細胞外間質中，光學顯微鏡下觀察制備好的切片，陽性表達為細胞內出現黃色、棕黃色或黃褐色顆粒。采用雙盲法由2名病理科醫師獨立進行評估，每張切片先在低倍鏡下(×100)確定3個陽性染色高密度區及熱點區，然后隨機選取5個高倍鏡視野(×400)在光鏡下觀察計數陽性細胞數，取平均數作為密度計數結果。依據染色結果，根據cut-off值選中位數作為低表達和高表達的決斷點[9]。其中CD163+巨噬細胞數>28個/400倍鏡定為高表達，≤28個/400倍鏡為低表達。

1.3.3 細胞培養：乳腺癌細胞株MCF-7、巨噬細胞MH-S于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養至對數期，然后調整細胞濃度，以1×105個細胞/平皿接種于25 ml培養皿中，置于恒溫培養箱中培養，培養條件為37℃，5%CO2，濕度95%。

1.3.4 細胞轉染：將生長良好的巨噬細胞MH-S消化后加含10%胎牛血清的高糖培養基，均勻鋪至6孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中，待細胞融合度達70%左右時換為無血清培養基待轉染用。采用Lipofectamine2000轉染試劑并參照說明書，分別將陽性質粒siRNA CD163-FAM和陰性對照siRNA CD163-NC轉染至MH-S細胞，48 h后用Western-blot法檢測CD163的表達效率。并設立無轉染的MH-S細胞為空白對照組(control)。

1.3.5 Western-blot法檢測CD163的表達：提取各自細胞中總蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒測定含量。制備蛋白樣品，配制SDS-PAGE凝膠，電泳后轉PVDF模，加含5%BSA的封閉液室溫下孵育2 h。分別加適量用封閉液稀釋的CD163一抗，4℃冰箱過夜孵育。次日復溫后用PBST將PVDF膜洗滌干凈，分別加適量稀釋好的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，室溫作用2 h，PBST洗滌后加ECL避光5 min，暗室曝光并拍照，同時以GAPDH作為內參蛋白。

1.3.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲：用無血清RPMI1640培養基按1∶5稀釋基質膠Matrigel，并向每個Transwell小室中加50 μl，37℃靜置2 h凝固后備用。取對數期的MCF-7和MH-S細胞，然后按照10∶1的比例，調整細胞密度為5×105/ml，取250 μl細胞懸液至Transwell小室中，600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640加至下室，并保證下層完全培養基與Transwell小室間無氣泡產生。置于37℃、5%CO2培養箱內培養24 h后將Transwell小室取出，棄培養液加PBS洗滌，4%多聚甲醛固定下室面，PBS洗滌，加0.1%結晶紫染液室溫避光染色15 min，用棉簽輕輕擦掉小室上層未遷移細胞，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下取5個高倍視野觀察拍照，并計數穿過微孔膜的細胞數。重復實驗3次，每組取平均數。

1.3.7 平板克隆形成實驗檢測細胞增殖：取對數期的MCF-7和MH-S細胞，然后按照10∶1的比例，以50%匯合率接種于6孔板中，每組設置5個復孔，置于恒溫培養箱中培養，培養條件為37℃，5%CO2，濕度95%，培養2周，將培養液棄去，PBS洗滌，加入1 ml甲醇固定10 min，棄去固定液，結晶紫染色，晾干后計數。

1.3.8 流式細胞術檢測細胞周期：取對數期的MCF-7和MH-S細胞，然后按照10∶1的比例，以50%匯合率接種于96孔板中，每組設置5個復孔，置于恒溫培養箱中培養，培養條件為37℃，5%CO2，濕度95%，培養24 h后， 離心棄上清，重懸細胞并計數，然后取195 μl Annexin V-FITC緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，加入10 μl 碘化丙啶(PI)染色液，混勻。同時，設置Annexin V-FITC和碘化丙啶單染為對照管。室溫下，避光孵育15 min，孵育過程中重懸細胞2次，隨后置于冰浴中。流式細胞儀檢測DNA合成前期(G1)、DNA合成期(S)與DNA合成后期(G2)，實驗重復3次。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織和癌旁正常組織中CD163+巨噬細胞浸潤數量比較 乳腺癌組織中CD163+巨噬細胞浸潤數量為(52.39±3.24)，明顯高于癌旁正常組織(13.25±1.76)，差異具有統計學意義(t=134.273,P<0.001)。

學生對這兩門課學習缺乏主動性。因為這兩門課程聯系實際應用很難，由于課程本身就具有理論強，與實踐聯系困難，特別是《信號與系統》課程研究的是連續時間信號，與實際嚴重脫軌，相對來說《數字信號處理》中還提到的有限長和無限長數字濾波器設計的方法和基本應用，所以大部分本科生在學習這門信號處理課程中，反應難點大，不愛學，學習缺乏主動性，存在及格就行的不良思想，尤其有產生對未來就業和考研毫無用處的錯誤思想。同時再學課程之前沒有復習相關數學，對課程中的表達式就不理解和分析，學生不會，就會導致興趣缺乏和沒有主動性，這樣就形成了惡性循環，課程掌握的難度就越來越大和越難了。

2.2 CD163+巨噬細胞與乳腺癌臨床病理參數的關系 CD163+巨噬細胞在不同年齡及腫瘤直徑中的浸潤數量差異無統計學意義(P均>0.05)，而在不同分化程度、TNM分期及淋巴結轉移間存在統計學意義(P<0.01)， 見表1。

表1 CD163+巨噬細胞與乳腺癌臨床病理參數的關系 [例(%)]

2.3 轉染后各組MH-S中CD163蛋白表達比較 siRNA-FAM亞組CD163明顯低于siRNA-NC亞組，差異具有統計學意義(t=12.164,P<0.01)，提示成功構建了CD163低表達的MH-S巨噬細胞。見圖1。

2.4 巨噬細胞中CD163對乳腺癌細胞MCF-7增殖能力的影響 平板克隆形成實驗結果顯示，siRNA-FAM亞組細胞克隆形成數明顯低于siRNA-NC亞組，差異具有統計學意義(t=11.960,P<0.01)，見圖2。

2.5 巨噬細胞中CD163對乳腺癌細胞MCF-7侵襲能力的影響 Transwell實驗結果顯示，siRNA-FAM亞組細胞侵襲能力明顯低于siRNA-NC亞組，差異具有統計學意義(t=18.397，P<0.05)，見圖3。

2.6 巨噬細胞中CD163對乳腺癌MCF-7細胞周期的影響 流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-FAM組G1期MCF-7 細胞所占的比例明顯增高，差異具有統計學意義(t=6.398，P<0.01)，而 G2 期細胞所占的比例明顯低于siRNA-NC組，具有顯著的統計學意義(t=9.542，P<0.01)，見圖4。

3 討 論

乳腺癌作為臨床常見腫瘤，是引起女性癌癥相關死亡的主要原因，文獻報道[10]，腫瘤發生發展過程中會伴隨炎性細胞浸潤，而巨噬細胞是主要的炎性細胞，其作為機體固有免疫反應重要組成成分，在不同組織微環境中可分化為不同亞型，從而發揮不同的生物學作用，研究發現口腔癌、食管癌等惡性腫瘤組織中高水平的巨噬細胞患者預后往往較差[11-12]，因此近年來腫瘤相關巨噬細胞浸潤成為醫學工作者研究的熱點。

圖3巨噬細胞中CD163對乳腺癌細胞MCF-7侵襲能力的影響(結晶紫染色，×400)

綜上所述，乳腺癌組織中CD163+巨噬細胞數量明顯升高，與臨床分期、淋巴結轉移、分化程度密切相關，且CD163能夠增強乳腺癌細胞增殖、侵襲能力，可為臨床評估乳腺癌患者預后提供依據。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

陳馨、姚永忠：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，提出研究思路，分析實驗數據，論文審核；張薇、張偉杰、趙怡欣、吳鴻雁：實施研究過程，資料收集整理