基于NLRP3-IL-1β-NF-κB信號軸研究野菊花總黃酮對脂多糖誘導HK-2細胞炎性反應及自噬的影響

楊彬，黃俊卿△，孟慶良，袁威起，梁新

痛風為臨床常見代謝疾病，單鈉尿酸鹽晶體沉積過多為痛風發生的重要物質基礎，人體中大部分尿酸鹽均經過腎臟排出，當腎小管重吸收異常后，會造成尿酸鹽累積，引發痛風、高尿酸血癥等［1］。既往研究發現核苷酸結合域樣受體蛋白3（NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3，NALP3）在受到尿酸鹽作用下分泌大量白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）促炎性因子等擴大炎癥反應參與痛風關節炎的發生、發展［2］。近期有研究發現核因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）也可活化NLRP3炎性體，進一步激活caspase-1、IL-1β后又作用于NF-κB，促進炎癥反應，推測NLRP3-IL-1β-NF-κB信號軸可能參與痛風關節炎的發生［3］。野菊花屬于菊科植物提取物，具有提高冠脈血流、降血壓、增強免疫力的作用，現代藥理學顯示其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效［4］。臨床研究發現野菊花提取物可通過抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）活性進而抑制尿酸的形成來發揮抗痛風的作用，然而具體分子機制目前尚不明確［5］。本研究旨在探究野菊花總黃酮對LPS誘導后人腎小管上皮HK-2細胞炎性的抑制、自噬誘導作用，并初步探究可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人腎小管上皮HK-2 細胞購于上海斯信生物科技有限公司，用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的DMEM培養基在37 ℃、5%CO2條件下培養，隔日傳代1次，傳代3次后取對數生長期細胞進行實驗。

1.2 試劑與儀器 野菊花總黃酮（Total flavonoids of chrysanthemum indicum，TFC）（貨號：170217，總黃酮含量＞70%）購于西安昌岳生物科技有限公司；NLRP3 激活劑（4'-O-Methylresveratrol）購于美國 MCE 公司（貨號：33626-08-3）；FBS（A3160802）、DMEM培養基（C11995500BT）購于美國Gibco公司；CCK-8細胞增殖測定試劑盒（貨號：KTC011001）購于美國Sigma 公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）試劑（貨號：L8880）購于索萊寶科技有限公司；Hoechst33342染色劑（貨號：C1018）購于上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人NLRP3（15101）、caspase-1（24232）、Beclin-1（3495）購于美國CST公司；兔抗人Asc（ab175449）、β-actin（ab179467）、LC3Ⅱ（ab48394）、LC3Ⅰ（ab52628）購于英國Abcam公司；兔抗人p-IκB（MAB7226）、IκB（AF5078）購于美國R&D公司。800TS酶標儀購于美國Biotek公司；BX51熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；F20 透射電鏡購于美國 FEI 公司；PROTEAN Tetra 垂直電泳儀購于美國伯樂公司；Gelstudio touch 凝膠成像儀購于德國AnalytikJena AG公司。

1.3 細胞分組 取對數期細胞分為陰性對照組（Control組）、LPS 處理組（LPS 組）、野菊花總黃酮預處理組（TFC 組）、NLRP3 激活劑預處理組（4-MET 組）、TFC 聯合4-MET 預處理組（TFC+4-MET組），每組均設定6個重復。Control組細胞不進行任何處理；LPS組：正常培養基基礎上添加100μmol/L LPS［6］；TFC 組：正常培養基基礎上添加 50 mg/L TFC［7］，預處理2 h后加入100μmol/L LPS進行誘導；4-MET組：正常培養基基礎上添加10μmol/L 4-MET［8］，預處理2 h后加入100μmol/L LPS 進行誘導；TFC+4-MET 組正常培養基基礎上添加TFC（50 mg/L）與4-MET（10μmol/L）預處理2 h后加入LPS誘導。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 CCK-8 法檢測細胞增殖率 以上各組細胞繼續培養24 h后收集細胞，密度調節為1.0×106個/孔接種至96孔板，每組設定6個重復孔，各組細胞分別繼續培養24、48、72、96 h后添加10%（體積分數）的CCK-8檢測試劑，在細胞培養箱內繼續孵育4 h，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度值，細胞增殖率=實驗組吸光度值/Control組吸光度值×100%，實驗重復3次。

1.4.2 Hoechst 33342 染色觀察細胞形態變化 取以上各組對數期細胞，制備單細胞懸液，細胞數量調整為1.0×106個/mL，添加4%甲醛固定10 min，在培養液中添加2μL Hoechst 33342 細胞染液，在細胞培養箱內孵育1 h 后，吸除含染料的培養液，用培養液或PBS洗滌3次，置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態變化情況。

1.4.3 免疫印跡法檢測各組細胞NLRP3/NF-κB 信號通路、自噬蛋白表達 以上各組細胞培養48 h后，除去上層培養液后添加含PMSF 的RIPA 細胞裂解液，冰上放置1 h 后，采用BCA 法檢測蛋白總含量，添加上樣緩沖液煮沸后，統一定量20μg 行SDS-PAGE，半干法轉膜反應后添加BSA 封閉液封閉，依據抗體說明書，稀釋 NLRP3、Asc、caspase-1、p-IκB、IκB、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1一抗，工作濃度為1∶500，在4 ℃下用一抗對膜孵育過夜，經PBST 緩沖液清洗后添加含HRP標記的二抗室溫下孵育1～2 h，經PBST 緩沖液清洗后，用ECL 化學發光液進行曝光顯影后，在凝膠成像儀內采集圖像，利用Image-J軟件定量分析各蛋白相對表達量。

1.4.4 酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測細胞IL-1β、IL-18 含量 以上各組細胞培養48 h 后，收集上清，采用 ELISA 法檢測上清中 IL-1β、IL-18 含量，具體參考試劑盒說明書進行操作。

1.4.5 透射電鏡觀察細胞超微結構 收集各組細胞，用胰蛋白酶消化后采用PBS 清洗細胞3 次，添加2%戊二醛預固定48 h，用1%鋨酸再固定，采用梯度乙醇脫水、環氧樹脂包埋，制備100 nm超薄切片，經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染后，置于透射電鏡下觀察細胞自噬情況。

1.5 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 21.0 進行數據分析。計量資料采用表示，2 組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用析因設計的方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 野菊花總黃酮對LPS誘導HK-2細胞增殖率的影響 與Control組相比，培養24～96 h內LPS組細胞增殖率顯著降低（P＜0.05）。與LPS 組相比，TFC 組細胞增殖率顯著升高，4-MET 組細胞增殖率顯著降低（P＜0.05）。TFC+4-MET 組細胞增殖率顯著高于4-MET組（P＜0.05），見表1。

2.2 各組細胞Hoechst 33342 染色情況 Control 組細胞形態無明顯變化；LPS 組部分細胞染色質凝聚和核碎裂，呈現凋亡狀，熒光染色增強，細胞凋亡率升高；與LPS 組相比，TFC 組細胞和破碎程度降低，熒光強度降低，細胞凋亡率降低；4-MET 組熒光強度增強，凋亡狀細胞增多，細胞凋亡率升高；TFC+4-MET 組細胞核破碎程度低于4-MET組，熒光強度降低，細胞凋亡率降低。見圖1、表2。

Fig.1 Hoechst staining showing morphological changes of cells(×100)圖1 Hoechst染色觀察細胞形態變化（×100）

2.3 野菊花總黃酮對LPS誘導HK-2細胞NLRP3信號通路蛋白的影響 與Control 組相比，LPS 組細胞NLRP3、Asc、caspase-1 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。與 LPS 組相比，TFC 組細胞 NLRP3、Asc、caspase-1 蛋白表達顯著降低，4-MET 組細胞NLRP3、Asc、caspase-1 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。TFC+4-MET 組 NLRP3、Asc、caspase-1 蛋白表達顯著低于4-MET 組（P＜0.05）。見圖2、表2。

Fig.2 Immunoblotting results of expressions of NLRP3,Asc and caspase-1 in cells圖2 免疫印跡法檢測細胞NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表達

2.4 野菊花總黃酮對LPS誘導HK-2細胞NF-κB信號通路蛋白的影響 與Control 組相比，LPS 組細胞IκB蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）。與LPS組相比，TFC組細胞IκB蛋白磷酸化水平顯著降低，4-MET 組細胞 IκB 蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）。TFC+4-MET 組 IκB 蛋白磷酸化水平顯著低于4-MET組（P＜0.05），見圖3、表4。

2.5 野菊花總黃酮對LPS誘導HK-2細胞炎性因子表達的影響 與Control 組相比，LPS 組細胞IL-1β、IL-18水平顯著升高（P＜0.05）。與LPS組相比，TFC組細胞IL-1β、IL-18 水平顯著降低，4-MET 組細胞IL-1β、IL-18 水平顯著升高（P＜0.05）。TFC+4-MET 組IL-1β、IL-18 水平顯著低于4-MET 組（P＜0.05），見表5。

Tab.1 Comparison of cell proliferation rates between five groups表1 各組細胞增殖率比較 （n=6，%，）

Tab.1 Comparison of cell proliferation rates between five groups表1 各組細胞增殖率比較 （n=6，%，）

＊P＜0.05；t 值為Control 組與LPS 組比較結果；FTFC=74.139，F4-MET=177.902＊，F時間=51.271＊，FTFC+4-MET=7.809＊，FTFC+時間=2.842，F4-MET+時間=6.721，FTFC+4-MET+時間=18.046＊；a與Control組比較，b與LPS組比較，c與4-MET組比較，P＜0.05

組別Control組LPS組TFC組4-MET組TFC+4-MET組t 24 h 100.01±0.32 82.63±4.55a 88.07±4.47abc 72.62±2.75ab 80.62±4.65ac 9.333＊48 h 100.12±0.15 74.64±3.78ac 81.24±4.05abc 66.41±3.41ab 73.15±3.53ac 16.498＊72 h 100.22±0.14 66.52±4.54ac 74.07±4.23abc 63.68±2.57ab 64.76±4.69ac 18.174＊96 h 100.29±0.11 51.32±4.36ac 67.16±4.75abc 59.71±3.16ab 47.92±4.23ac 27.503＊

Tab.2 Comparison of expressions of NLRP3,Asc and caspase-1 and the apoptosis rates between five groups表2 各組細胞細胞凋亡率及NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表達比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of expressions of NLRP3,Asc and caspase-1 and the apoptosis rates between five groups表2 各組細胞細胞凋亡率及NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表達比較 （n=6，）

＊P＜0.05；t 值為 Control 組與 LPS 組比較結果；a 與 Control 組比較，b與LPS組比較，c與4-MET組比較，P＜0.05

組別Control組LPS組TFC組4-MET組TFC+4-MET組t FTFC F4-MET FTFC+4-MET細胞凋亡率（%）8.11±0.97 26.73±4.17ac 15.07±1.66abc 40.96±5.36ab 24.55±4.18ac 10.937＊58.743＊56.050＊2.308 NLRP3/β-actin 0.18±0.03 0.86±0.07ac 0.48±0.05abc 0.97±0.09ab 0.83±0.06ac 21.871＊66.944＊72.407＊7.144＊組別Control組LPS組TFC組4-MET組TFC+4-MET組t FTFC F4-MET FTFC+4-MET Asc/β-actin 0.21±0.04 0.73±0.07ac 0.28±0.04abc 0.87±0.08ab 0.72±0.06ac 15.799＊98.082＊117.715＊20.997＊caspase-1/β-actin 0.15±0.04 0.59±0.09ac 0.26±0.04abc 0.86±0.07ab 0.61±0.08ac 10.943＊179.689＊155.636＊7.576＊

Fig.3 Immunoblotting results of the expressions of p-IκB and IκB in cells圖3 免疫印跡法檢測細胞p-IκB、IκB蛋白表達

2.6 電鏡觀察各組HK-2細胞自噬情況 電鏡結果顯示，Control 組細胞結構、形態基本正常，未發生明顯自噬；LPS 組出現少量自噬小體；與LPS 組相比，TFC 自噬小體數量增多；4-MET 組自噬程度降低；TFC+4-MET組自噬小體、自噬溶酶體數多于4-MET組，見圖4。

Fig.4 Electron microscopic observation of autophagy of HK-2 cells(×5 000)圖4 電鏡觀察HK-2細胞自噬情況（×5 000）

Tab.4 Comparison of expressions of p-IκB and IκB between five groups表4 各組細胞p-IκB、IκB蛋白表達比較 （n=6，）

Tab.4 Comparison of expressions of p-IκB and IκB between five groups表4 各組細胞p-IκB、IκB蛋白表達比較 （n=6，）

＊P＜0.05；a與Control 組比較，b與LPS 組比較，c與 4-MET 組比較，P＜0.05

組別Control組LPS組TFC組4-MET組TFC+4-MET組t FTFC F4-MET FTFC+4-MET p-IκB/β-actin 0.22±0.05 0.83±0.04ac 0.43±0.05abc 1.45±0.13ab 0.81±0.06ac 23.335＊132.156＊113.267＊0.976 IκB/β-actin 1.28±0.10 1.32±0.05 1.36±0.06 1.34±0.03 1.29±0.09 0.876 0.001 0.754 2.442 p-IκB/IκB 0.17±0.05 0.62±0.04ac 0.37±0.04abc 1.05±0.08ab 0.64±0.06ac 17.215＊107.313＊107.607＊6.859＊

Tab.5 Comparison of IL-1β and IL-18 levels between five groups表5 各組細胞IL-1β、IL-18水平比較 （n=6，）

Tab.5 Comparison of IL-1β and IL-18 levels between five groups表5 各組細胞IL-1β、IL-18水平比較 （n=6，）

＊P＜0.05；t值為Control組與LPS組比較結果；a與Control組比較，b與LPS組比較，c與4-MET組比較，P＜0.05

組別Control組LPS組TFC組4-MET組TFC+4-MET組t FTFC F4-MET FTFC+4-MET IL-1β（ng/L）17.03±3.18 103.25±21.36ac 68.25±14.84abc 134.53±16.79ab 98.39±18.65ac 9.780＊35.974＊16.630＊1.713 IL-18（ng/L）14.34±3.26 129.28±22.65ac 72.47±14.32abc 153.62±19.44ab 123.56±21.07ac 12.303＊22.125＊15.438＊6.390＊

2.7 野菊花總黃酮對LPS誘導HK-2細胞自噬蛋白表達的影響 與Control 組相比，LPS 組細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達降低（P＜0.05）。與LPS 組相比，TFC 組細胞 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達升高，4-MET 組細胞 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達降低（P＜0.05）。TFC+4-MET 組LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表達高于4-MET 組（P＜0.05）。見圖5、表6。

Fig.5 Immunoblotting detection of the expressions of LC3Ⅱ,LC3Ⅰand Beclin-1 protein in cells圖5 免疫印跡法檢測細胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達

Tab.6 Comparison of expressions of LC3Ⅱ,LC3Ⅰ and Beclin-1 between five groups表6 各組細胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達比較 （n=6，）

Tab.6 Comparison of expressions of LC3Ⅱ,LC3Ⅰ and Beclin-1 between five groups表6 各組細胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達比較 （n=6，）

＊P＜0.05；t 值為 Control 組與 LPS 組比較結果；a 與 Control 組比較，b與LPS組比較，c與4-MET組比較，P＜0.05

Beclin-1/β-actin 0.89±0.08 0.53±0.06ac 0.67±0.07abc 0.33±0.04ab 0.50±0.05ac 8.818＊44.262＊87.383＊1.199組別Control組LPS組TFC組4-MET組TFC+4-MET組t FTFC F4-MET FTFC+4-MET LC3Ⅱ/Ⅰ0.72±0.08 0.37±0.06ac 0.58±0.07abc 0.29±0.04ab 0.39±0.06ac 8.573＊33.413＊64.757＊11.820＊

3 討論

高濃度的尿酸是造成痛風關節炎發作的重要物質，患者一般伴有關節紅腫、劇烈疼痛，且持續反復發作，嚴重影響患者生活質量，因此深入探究痛風的發生機制，對于尋找疾病的治療靶點具有十分重要意義。機體內尿酸大多經腎臟排泄，臨床發現多數痛風患者均伴有腎損傷，其主要發病機制與腎小管細胞尿酸鹽排泄異常有關［9］。人腎小管上皮細胞HK-2是研究炎癥反應模型常用的細胞，LPS又稱內毒素，對細胞均有一定的毒性，在細胞炎癥反應造模中應用較多［10］。本研究通過采用 LPS 刺激HK-2 細胞誘導建立炎癥反應模型，結果發現與Control 組相比，LPS誘導后細胞增殖率明顯降低，且細胞培養上清液中炎癥因子IL-1β、IL-18水平顯著升高，表明一定濃度LPS可抑制腎小管細胞生長，上調炎癥因子釋放，提示LPS誘導HK-2細胞炎癥反應模型建立成功。

黃酮是野菊花中重要的活性成分之一，在野菊花中含量較高，可改善心臟、腎臟等重要器官供血情況，且不良反應較小。黃酮類化合物在降尿酸方面具有較好的效果，繆明星等［11］研究發現芹菜素中的黃酮類化合物能夠明顯降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平，發揮對腎臟的保護作用。濮尊琴等［12］研究顯示高良姜素中的黃酮類化合物能夠明顯降低高尿酸小鼠血尿酸水平，此外還可降低肝臟中XOD 活性。然而野菊花總黃酮在痛風中的作用目前尚不明確。本研究首先采用野菊花總黃酮預處理HK-2 細胞，隨后進行LPS誘導，結果發現與LPS組相比，野菊花總黃酮預處理后細胞增殖率升高，且細胞培養液中炎性因子IL-1β、IL-18 水平降低，提示野菊花總黃酮可抑制LPS誘導細胞產生的炎癥反應。

NLRP3 屬于胞漿蛋白家族成員之一，與TLR4具有類似的作用，廣泛參與宿主免疫及炎癥反應過程。NLRP3 與LRR 結合后發生活化，使其構象改變，暴露NACHT 結構域，經ATP 聚合后生成NLRP3炎性復合體，與PYD 效應結構域結合后招募Asc、caspase-1 前體形成炎性復合體，進一步激活caspase-1 前體形成caspase-1，分泌至胞外促進IL-1β 和IL-18 的成熟及釋放，進一步擴大炎癥反應。已有研究證實NLRP3可經LRR識別尿酸鹽，促使無活性的NLRP3 活化，進一步誘導炎性因子IL-1β 和IL-18 的分泌［13］。Dinesh 等［14］研究發現抑制 NLRP3信號通路可明顯降低尿酸鹽晶體誘導的大鼠炎癥反應。Lee等［15］研究發現抑制NLRP3炎癥激活和線粒體DNA 合成可預防急性痛風的發生。本研究發現與Control組相比，LPS處理組NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表達進一步升高，經野菊花總黃酮干預后NLRP3、Asc、caspase-1 蛋白表達降低，提示野菊花總黃酮可能通過抑制NLRP3信號通路進而抑制LPS誘導HK-2細胞的炎性反應。NLRP3除參與炎癥反應調節外還參與NF-κB 通路調節，caspase-1 及IL-1β 均可激活 NF-κB，而 NF-κB 激活后又可促進NLRP3 炎性體通路的激活，放大炎癥反應。Molagoda等［16］和Sun等［17］研究發現抑制細胞NF-κB信號通路表達后，可抑制IL-1β因子釋放，進而降低NLRP3/Asc/caspase-1 信號通路的活化。本研究發現與 Control 組相比，LPS 處理組細胞 IκB 蛋白磷酸化水平升高，經野菊花總黃酮預干預后IκB 蛋白磷酸化水平降低，提示野菊花總黃酮可能是通過抑制NLRP3 信號通路活化，進而抑制NF-κB 信號通路，降低細胞炎性反應。為證實這一推測，本研究采用NLRP3 激活劑 4-MET 處理 HK-2 細胞，結果發現LPS 誘導后細胞增殖進一步受到抑制，細胞炎性水平升高，且NLRP3、Asc、caspase-1、IκB 蛋白磷酸化水平升高，提示激活NLRP3后可進一步激活NF-κB信號通路，加重細胞炎性反應。而采用野菊花總黃酮聯合NLRP3 激活劑處理后，可提高細胞增殖活性，降低炎性水平，降低NLRP3/NF-κB 通路蛋白表達，提示野菊花總黃酮可通過抑制NLRP3/NF-κB通路活化，降低LPS誘導HK-2細胞炎性反應。

自噬在真核細胞中普遍存在，炎癥疾病的發生與細胞自噬活性缺陷密切有關。近期研究發現尿酸鹽刺激炎性體活化過程中伴隨著自噬的發生，且自噬可通過負調節炎性小體進而抑制炎性因子IL-1β釋放，推測自噬在痛風發生過程中發揮重要作用［18］。研究證實NF-κB作用于NLRP3啟動子促進其轉錄，進而調控自噬蛋白，而干擾NLRP3表達后能夠降低自噬活性［19］。另有研究發現自噬可通過降解炎性體進而負調控炎性體活性，降低炎性因子IL-1β、IL-18 水平［20］。本研究經透射電鏡檢測發現，LPS 誘導后細胞中出現一定的自噬小體，而經野菊花總黃酮處理后細胞自噬活性增強；NLRP3激活劑4-MET處理后細胞自噬活性降低，4-MET 聯合野菊花總黃酮處理后自噬活性進一步增強，表明野菊花總黃酮可通過抑制NLRP3/NF-κB 通路活化誘導HK-2 細胞自噬。LC3 蛋白是自噬活性檢測的重要標志物，定位自噬體膜上，LC3 經Agt4 催化后形成LC3-Ⅰ，與PE 偶聯轉變為LC3-Ⅱ，穩定存于內膜上，因此LC3Ⅱ/Ⅰ水平可反映細胞自噬程度。Beclin-1是哺乳動物參與自噬的特異基因之一，當細胞發生自噬后，其水平迅速升高，可反映細胞自噬程度［21］。本研究發現野菊花總黃酮干預后細胞中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達明顯升高，經4-MET 干預后兩者蛋白表達進一步降低，野菊花總黃酮聯合4-MET處理后LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表達高于4-MET組，提示野菊花總黃酮可通過抑制NLRP3/NF-κB 通路降低LPS誘導HK-2炎性細胞中自噬蛋白表達水平。

綜上所述，野菊花總黃酮能夠抑制LPS 誘導的HK-2細胞炎性反應，誘導細胞自噬，其機制可能與抑制NLRP3-IL-1β-NF-κB通路有關。然而本研究也存在一定的不足，僅在體外證實野菊花總黃酮對腎小管上皮細胞的炎癥抑制作用，未在體內進行驗證，這還有待后續完善實驗方案進一步深入探究。