腎衰營養膠囊對腎性骨病大鼠骨代謝及股骨組織BMP-2表達的影響

伍曉輝，尤海巖，胡蓉，劉玲玉，王明清，魏連波,2△

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是一類威脅人類健康的重大疾病，發病率高、危害大且醫療費用昂貴。薈萃分析發現，中國成人CKD患病率為13.4%［1］。腎性骨病（renal osteodystrophy，ROD）又稱腎性骨營養不良，是慢性腎臟病的主要并發癥之一［2］。研究發現，伴隨著 CKD 的進程，ROD 的發病率亦呈增高趨勢，當進展至終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）時，幾乎所有的患者均出現腎性骨病［3］。ROD臨床表現以鈣、磷代謝障礙，酸堿平衡失調、維生素D 代謝異常以及繼發性甲狀旁腺機能亢進等為特征，骨骼損害主要表現為骨質疏松、纖維囊性骨炎、骨軟化或硬化、骨畸形和轉移性鈣化等［4］，這些癥狀嚴重影響了患者的生活質量和生存時間。目前，臨床上治療ROD的主要手段是控制血清磷酸鹽、鈣和甲狀旁腺激素的水平，但療效有限，患者死亡率仍很高［5］。近年有研究顯示，中醫藥在治療ROD 上取得了可觀的進展［6-7］。腎衰營養膠囊是魏連波教授治療慢性腎衰竭導致的營養不良的經驗方，既往的臨床觀察和動物實驗已證明腎衰營養膠囊確實能改善慢性腎衰竭引起的營養不良。本研究擬觀察腎衰營養膠囊對ROD 模型大鼠骨代謝以及股骨組織骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）表達的影響，探討其可能的作用機制，為中醫藥治療腎性骨病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40 只，6～7周齡，體質量（200±20）g，由南方醫科大學實驗動物中心提供（實驗動物中心許可證號：SCXK 2017 - 0167），合格證號：NO.4400210005310。

1.2 主要試劑與儀器 腎衰營養膠囊處方：黨參（25 g）、白術（10 g）、茯苓（15 g）、甘草（5 g）、杜仲（15 g）、黃芪（25 g）、當歸（10 g）、大黃（10 g）、春砂仁（10 g），購自廣東省藥材公司，經南方醫科大學中藥制劑室鑒定，并由中藥新藥實驗室按處方比例提取制成膠囊，每克成藥含生藥5.67 g，將成藥制成質量濃度為0.12 g/mL 的懸濁液。骨化三醇（規格：0.25μg/片）購自海爾藥業，用蒸餾水配制成質量濃度為1 mg/L 的懸濁液。兔抗BMP-2多克隆一抗（美國Santa Cruz 公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（CST 公司），兔抗GAPDH（英國Abcam 公司）。總蛋白提取試劑盒、微型離心機、電泳儀、轉膜儀、血iPTH 免疫檢測試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）。Cobase111自動生化儀（瑞士Roche公司），GE DPX-NT型雙能X射線骨密度床機（美國通用電氣公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物造模和分組 大鼠適應性飼養1周后隨機分為造模組（n=30）和對照組（Control 組，n=10）。造模組大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，俯臥位打開腹腔，暴露左側腎臟，剝離腎包膜，切除左腎上下極各1/3組織，可吸收明膠海綿止血，觀察無出血后關閉腹腔；1周后再次打開腹腔，用縫合線結扎右側腎蒂，摘除右腎，觀察無出血后關閉腹腔。Control組大鼠同樣進行兩期手術，但僅剝離腎包膜，不作腎切除。造模組隨機分為模型組（Model 組，n=10）、腎衰營養膠囊組（SSYYJN 組，n=10）和骨化三醇組（VD 組，n=10）。Model 組、SSYYJN 組和VD 組給予正常飲食和高磷飲水飼養（NaH2PO40.5 g/d）。術后1 個月開始藥物灌胃，大鼠灌胃容量1 mL/（100 g·d）。SSYYJN 組按大鼠等效劑量（成藥1.2 g/kg）灌胃給藥，VD 組按 0.01 mg/kg 灌胃給藥，Control 組和 Model 組等量生理鹽水灌胃，灌胃持續12周。實驗過程中Model組死亡2只，SSYYJN組死亡1只，VD組死亡2只。

1.3.2 造模成功的標準 高磷飲水飼養4周后取血，檢測大鼠血生化指標，造模大鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清磷（P3-）、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）明顯高于對照組，而鈣（Ca2+）明顯低于對照組說明腎性骨病模型造模成功。

1.3.3 觀察指標 （1）一般情況：每天觀察動物的一般狀況，包括外形、精神狀態、飲食等，并于給藥前及給藥后每4周測量一次體質量。（2）標本采集與檢測：分別在大鼠給藥干預前與干預后于眼眶靜脈取血，自動生化儀檢測血清Scr、BUN、ALP、Ca2+、P3-濃度，免疫化學發光法檢測血清全段甲狀旁腺激素（iPTH）濃度。給藥結束后處死大鼠，取完整左側股骨，剝離肌肉，干燥后GE DPX-NT 型雙能X 射線骨密度床機檢測股骨骨密度（BMD）。（3）Western blot 檢測股骨組織BMP-2的表達：提取大鼠股骨組織總蛋白，用BCA法檢測蛋白含量。加上樣緩沖液，PCR 電泳儀99 ℃變性10 min，制備10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣電泳，每孔上樣體積為25μL，進行SDS-PAGE分離，電泳2 h后取膠，在轉膜儀上將蛋白質轉移到PVDF 膜上。轉完后用TBST 清洗3 次，每次10 min，然后轉入5%脫脂奶粉中封閉1 h，用TBST洗滌3次，每次10 min，孵育兔抗BMP-2 多克隆一抗（1∶1 000）、兔抗GAPDH 一抗（1∶1 000），4 ℃冰箱過夜，取出后TBST 洗滌3 次，每次10 min，二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次 10 min，ECL化學發光檢測，Kodak Image Station 2000 MM成像系統曝光，獲取目的條帶圖像。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料數據均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，重復測量數據多組間比較采用重復測量的多因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD-t法，方差不齊時采用Dunnetts’s T3 法，治療前后各項參數比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎衰營養膠囊對大鼠一般狀態的影響 造模后，Model組、VD組大鼠精神狀態萎靡，眼神無力，飲食狀況不佳；SSYYJN 組大鼠精神狀態較Model 組、VD組明顯改善，行動較敏捷，進食良好；Control組飲食、精神狀態正常。

2.2 腎衰營養膠囊對大鼠體質量的影響 時間效應和干預措施對各組大鼠體質量均有影響，且存在交互作用（P＜0.05）。（1）組間比較：0周時，各組大鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）；4、8、12 周時，Model 組、VD 組、SSYYJN 組與 Control 組比較體質量明顯下降（P＜0.05），SSYYJN 組較Model 組及VD 組體質量顯著增加（P＜0.05），VD組與Model組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。（2）組內比較：Control組和SSYYJN 組大鼠體質量隨時間而增加（P＜0.05），Model 組和VD 組在8 周以前體質量隨時間而增加（P＜0.05），8 周到12 周體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 腎衰營養膠囊對大鼠BUN、Scr的影響 （1）組間比較：給藥前，Model 組、VD 組、SSYYJN 組與Control 組比較血 BUN、Scr 明顯升高（P＜0.05），Model 組、VD 組和 SSYYJN 組間差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥后，Model 組、VD 組、SSYYJN 組與Control 組比較血 BUN、Scr 仍升高（P＜0.05），但SSYYJN 組與 Model 組、VD 組比較血 BUN、Scr 降低（P＜0.05），Model組與VD組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。（2）組內比較：給藥前和給藥后血BUN、Scr相比較，Control組差異無統計學意義（P＞0.05），Model 組和 VD 組升高（P＜0.05），SSYYJN 組降低（P＜0.05）。見表2。

2.4 腎衰營養膠囊對大鼠骨代謝指標血清ALP、iPTH、Ca2+、P3-含量的影響 （1）組間比較：給藥前，Model 組、VD 組、SSYYJN 組與 Control 組比較，血清ALP、iPTH、P3-升高，Ca2+降低（P＜0.05），Model 組、VD組和SSYYJN組間差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥后，Model 組與Control 組比較，血清ALP、iPTH、P3-仍升高，Ca2+降低（P＜0.05），而SSYYJN 組及VD組與Model 組比較血清ALP、iPTH、P3-降低，Ca2+升高（P＜0.05），SSYYJN組與VD組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。（2）組內比較：給藥前和給藥后Control 組血清ALP、iPTH、Ca2+、P3-含量變化差異無統計學意義（P＞0.05），Model 組ALP、iPTH、P3-升高，Ca2+降低（P＜0.05），SSYYJN 組和 VD 組 ALP、iPTH、P3-降低，Ca2+升高（P＜0.05）。見表3。

2.5 腎衰營養膠囊對BMD和BMP-2表達水平的影響 Model 組 BMD、BMP-2 蛋白明顯低于 Control 組（P＜0.05）；與 Model 組比較，SSYYJN 組和 VD 組BMD、BMP-2 蛋白水平均明顯增高（P＜0.05）；SSYYJN 組和 VD 組 BMD 差異無統計學意義（P＞0.05），而BMP-2蛋白表達水平升高（P＜0.05），見表4、圖1。

Tab.1 Changes of body weights in four groups of rats表1 各組大鼠的體質量變化 （g，）

Tab.1 Changes of body weights in four groups of rats表1 各組大鼠的體質量變化 （g，）

＊＊P＜0.01；F組間=744.921，F時間=2 422.113，F交互=191.432，均P＜0.01；組間比較：a與Control組比較，b與Model組比較，c與VD組比較，均P＜0.05；組內比較：A與0周時比較，B與4周時比較，均P＜0.05

組別Control組Model組VD組SSYYJN組n 10 8 8 9 0周204.23±7.80 200.43±9.21 197.59±5.89 202.76±8.34 4周303.34±6.45A 260.65±7.32aA 262.13±6.23aA 280.97±7.38abcA 8周400.56±9.20AB 290.42±6.87aAB 295.78±7.89aAB 330.46±7.96abcAB 12周480.78±11.21 292.35±6.43a 301.32±9.21a 370.67±8.45abc

Tab.2 Results of BUN and Scr levels before and after treatment in four groups of rats表2 各組大鼠給藥前后腎功能指標BUN、Scr檢測結果 （）

Tab.2 Results of BUN and Scr levels before and after treatment in four groups of rats表2 各組大鼠給藥前后腎功能指標BUN、Scr檢測結果 （）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與Model組比較，c與VD組比較，均P＜0.05

組別Control組Model組VD組SSYYJN組F n BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）給藥前6.4±0.4 16.5±2.3a 16.1±2.8a 15.7±3.1a 56.981＊＊給藥后6.7±0.5 23.4±3.2a 21.7±2.9a 13.2±2.7abc 154.823＊＊t t 10 8 8 9 1.206 5.266＊＊2.919＊2.778＊給藥前30.4±4.7 64.8±10.2a 61.6±8.9a 60.7±9.3a 36.848＊＊給藥后31.6±5.1 93.5±13.6a 89.3±11.5a 52.4±10.4abc 135.271＊＊0.086 3.381＊8.666＊2.590＊

Tab.3 Comparison of serum levels of ALP,iPTH,Ca2+and P3-before and after treatment between four groups of rats表3 各組大鼠給藥前后血清ALP、iPTH、Ca2+及P3-水平比較 （）

Tab.3 Comparison of serum levels of ALP,iPTH,Ca2+and P3-before and after treatment between four groups of rats表3 各組大鼠給藥前后血清ALP、iPTH、Ca2+及P3-水平比較 （）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與Control組比較，b與Model組比較，均P＜0.05

組別Control組Model組SSYYJN組VD組F n 給藥后126.6±20.4 182.5±29.5a 130.4±24.6b 133.4±26.1b 35.640＊＊iPTH（ng/L）給藥前9.7±1.8 14.0±1.9a 14.2±1.7a 13.9±1.5a 11.371＊＊給藥后10.3±2.0 14.9±2.1a 10.0±1.6b 9.8±2.1b 9.378＊＊t t t Ca2+（mmol/L）給藥前2.7±0.1 2.0±0.3a 1.9±0.2a 2.0±0.1a 49.620＊＊10 8 9 8 ALP（U/L）給藥前132.3±21.3 174.5±26.4a 178.3±23.5a 169.6±26.3a 12.673＊＊給藥后2.7±0.2 1.8±0.2a 2.7±0.1b 2.6±0.2b 67.671＊＊t 0.602 1.047 3.327＊4.121＊＊0.147 0.146 8.783＊＊3.991＊＊0.802 2.938＊15.119＊＊6.216＊＊P3-（mmol/L）給藥前2.0±0.2 3.7±0.4a 3.6±0.2a 3.5±0.3a 71.861＊＊給藥后1.9±0.3 4.0±0.5a 2.1±0.2b 2.8±0.3b 68.931＊＊1.592 2.567＊12.578＊＊3.782＊＊

Tab.4 Comparison of BMD and BMP-2 expression levels in the 12th week between four groups of rats表4 各組大鼠第12周BMD和BMP-2表達水平比較 （）

Tab.4 Comparison of BMD and BMP-2 expression levels in the 12th week between four groups of rats表4 各組大鼠第12周BMD和BMP-2表達水平比較 （）

＊＊P＜0.01；a與Control 組比較，b與Model 組比較，c與 VD 組比較，均P＜0.05

組別Control組Model組VD組SSYYJN組F n 10 8 8 9 BMD（g/cm2）0.169±0.012 0.118±0.011a 0.160±0.016b 0.159±0.017b 21.852＊＊BMP-2蛋白0.79±0.10 0.35±0.11a 0.56±0.09b 0.68±0.10bc 24.037＊＊

Fig.1 The expression levels of BMP-2 in femur of each group圖1 各組大鼠股骨組織BMP-2表達

3 討論

腎性骨病骨骼的主要病理變化包括骨轉換、骨礦化、骨容積、骨線性生長或骨強度異常［8］。在CKD進展過程中，由于飲食中維生素D 攝入不足以及腎臟1-α羥化酶分泌減少，造成1,25-（OH）2-Vit D3生成障礙，從而導致腸道鈣吸收減少，血鈣水平降低，維生素D和鈣的減少使得其對甲狀旁腺細胞的抑制作用減弱，最終引起PTH分泌增多［9］。另一方面，隨著腎小球濾過率（glomerular filtration rate,GFR）的降低，腎臟對磷的排泄減少，造成血磷增多，也會刺激PTH的分泌。PTH的大量分泌使骨骼的代謝呈高轉換狀態，血清ALP 濃度增高，且骨吸收大于骨形成，造成骨質的丟失［10］，而低鈣和高磷血癥又引起骨礦化障礙，以上多種因素共同加速了ROD 的進程。ROD 發病機制復雜，目前臨床上尚缺乏療效確切、不良反應少的治療手段。有研究顯示，中藥復方提取液能改善ROD 大鼠腎功能，提高其骨密度［11］，但機制不十分清楚。近年來隨著對TGF-β 超家族蛋白研究的深入，發現BMP-2是TGF-β超家族中誘導成骨細胞分化最強的蛋白，BMP-2在成骨部位高表達并通過增加骨鈣素及Ⅰ型膠原合成，使細胞外基質礦化，促進間充質細胞向軟骨細胞和成骨細胞分化，加速新生骨的生成來修復軟骨缺損及進行骨重建［12-14］。近期有研究顯示，對循環中BMP-2的干預能減少腎纖維化，延緩 CKD 進展［15］，提示 BMP-2 在CKD及由其發展而來的ROD中發揮重要作用。

本研究結果顯示，各造模組大鼠給藥前腎功能指標血BUN、Scr 水平較對照組明顯升高，骨代謝指標血Ca2+降低，血P3-、iPTH、ALP 上升，說明隨大鼠腎功能下降，其鈣磷代謝紊亂，甲狀旁腺功能亢進，骨重塑與形成減少。給予腎衰營養膠囊干預后，大鼠血 BUN、Scr 水平明顯降低，血 Ca2+升高，血 P3-、iPTH、ALP 降低，表明腎衰營養膠囊能有效改善ROD 大鼠腎功能以及骨代謝。蛋白印跡結果顯示，模型組大鼠股骨BMP-2的表達較對照組減少，給予骨化三醇和腎衰營養膠囊干預后BMP-2 在骨組織中的表達增加，且腎衰營養膠囊對BMP-2的表達增加作用更為明顯，同時，跟BMP-2 表達的增加保持一致，大鼠股骨密度亦升高，表明BMP-2 可能是腎衰營養膠囊的作用靶點。

中醫理論認為：“腎充則髓實”，腎精充沛，則骨骼堅實。若腎精虧虛，則骨髓化生乏源，骨骼脆弱無力，易骨折，腎虛及脾，最終導致脾腎陰陽衰憊，濕濁毒邪內蘊。所以，針對ROD 病機，治法當以補腎健脾泄濁為核心。腎衰營養膠囊中四君子湯加黃芪補氣健脾，杜仲補腎壯陽，大黃、砂仁通腑瀉濁。有研究顯示，黃芪多糖可以延緩腎小球硬化，增加腎小球濾過率和腎臟血流灌注量［16］；杜仲總黃酮具有誘導骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞的作用，可通過促進骨髓基質細胞增殖來促進骨的形成［17］；大黃能祛濁排毒，從多方面延緩慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF），如抑制腎臟高代謝，抑制系膜細胞增生等［18］。既往的研究表明腎衰營養膠囊可以抑制血管炎癥相關因子的水平，改善CRF 微炎癥狀態下血管損傷，同時也能延緩腎小球、腎小管纖維化［19］。

綜上所述，腎衰營養膠囊不但能延緩ROD模型大鼠腎功能的惡化，同時還能改善鈣磷代謝，降低堿性磷酸酶活性，調節PTH 水平，改善骨代謝，增加股骨BMD 等。推測其改善骨代謝途徑可能與上調BMP-2的表達有關，但具體調節機制還有待進一步研究。BMP-2 是腎衰營養膠囊改善ROD 的可能靶點，可為中醫藥干預CKD 及其并發癥的治療提供參考。