敲低NEDD9基因表達(dá)對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞體內(nèi)外功能的影響

薛麗莉，吳鐵龍，戴圓圓，王文遠(yuǎn)，盛穎玥，薛育政△

NEDD9 是 Cas 家族蛋白的一員，又稱 HEF1 或CAS-L［1］，其作為骨架蛋白分子可與整合素、趨化因子受體、酪氨酸激酶受體等形成復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)節(jié)和介導(dǎo)多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞黏附、侵襲和趨化過程以及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡［2］，還可誘導(dǎo)形成侵襲偽足、刺激細(xì)胞增殖相關(guān)信號傳導(dǎo)及增加基因組不穩(wěn)定性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移［3］。研究發(fā)現(xiàn)，NEDD9高表達(dá)于結(jié)直腸腫瘤［4］、乳腺癌［5］、骨肉瘤［6］及胰腺癌［7］等多種腫瘤細(xì)胞。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NEDD9在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且NEDD9 的表達(dá)水平與pTNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的分化程度有關(guān)，是潛在的胰腺癌預(yù)后指標(biāo)，其高表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素［8］，但關(guān)于NEDD9在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不明確。本研究擬通過干預(yù)NEDD9表達(dá)，分析胰腺癌BxPC-3 細(xì)胞體內(nèi)外功能的變化，探討NEDD9影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，進(jìn)而為胰腺癌治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級 BALB/C 裸鼠 18 只，體質(zhì)量 18～20 g，鼠齡6 周，購自上海斯萊克實(shí)驗動物有限責(zé)任公司，動物合格證號：SCXK 2007-0005。BxPC-3 胰腺癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。胎牛血清購自Hyclone公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基購自 GIBCO 公司，Opti-MEM 培養(yǎng)基、胰酶購自Invitrogen公司，結(jié)晶紫染色液購自碧云天公司，4%多聚甲醛購自索萊寶公司；Transwell 小室、BD MatrigelTMBasement Membrane matrixTM購自Corning 公司；質(zhì)粒pLKDCMV-G&PR-U6-shRNA 及對照質(zhì)粒和相應(yīng)慢病毒載體及DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自和元生物技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 從液氮罐中取出BxPC-3細(xì)胞的凍存管進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)、消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗。本課題組前期實(shí)驗成功構(gòu)建了針對NEDD9的shRNA干擾質(zhì)粒（Y2602）及相應(yīng)的慢病毒載體以及陰性對照shRNA 干擾質(zhì)粒（Y007）慢病毒載體，成功轉(zhuǎn)染BxPC-3細(xì)胞完成了BxPC-3細(xì)胞穩(wěn)定株的篩選。將細(xì)胞分為敲低表達(dá)組（BxPC-3 Y2602組，轉(zhuǎn)染Y2602）、空白組（BxPC-3 NC組，未轉(zhuǎn)染Y2602）及陰性對照組（BxPC-3 Blank組，轉(zhuǎn)染陰性對照shRNA即Y007），并配制相應(yīng)的細(xì)胞懸液。

1.2.2 克隆形成 將穩(wěn)定株BxPC-3、BxPC-3-NC、BxPC-3-Y2602 組細(xì)胞鋪至 6 孔板中，每孔鋪 1 000 個細(xì)胞，培養(yǎng) 2 周后用結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色，應(yīng)用數(shù)碼相機(jī)拍照（×100），計算克隆形成數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞體外侵襲及劃痕實(shí)驗 轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，接種于鋪有基質(zhì)膠（BD Biosciences）的Transwell 小室（Corning）上層進(jìn)行侵襲實(shí)驗。將含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基加入到小室下層，培養(yǎng)數(shù)小時后去除上層的細(xì)胞和培養(yǎng)基，附著在過濾膜底面的細(xì)胞用甲醇固定后再用0.1%的結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下選取10個100倍視野計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)；每種不同類型的細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，共重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后的BxPC-3 細(xì)胞接種在6 孔板上，37 ℃培養(yǎng)至100%匯合度。用移液槍槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，盡量保證各個劃痕寬度一致。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。在培養(yǎng)板中加入無血清培養(yǎng)基并拍照記錄，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、16、24 h在顯微鏡下拍照并觀察劃痕愈合情況（劃線兩側(cè)的面積為傷口區(qū)域，使用Image-Pro Plus 軟件分析各組細(xì)胞的傷口增加面積）。于顯微鏡下定時拍照、動態(tài)觀察在劃痕兩側(cè)細(xì)胞運(yùn)動的情況。

1.3 構(gòu)建裸鼠人胰腺癌皮下成瘤模型 18只裸鼠隨機(jī)平均分為BxPC-3組、BxPC-3-Y007組及BxPC-3-Y2602組，均在無特定病原體（SPF）條件下飼養(yǎng)，將BxPC-3、BxPC-3-Y007、BxPC-3-Y2602 細(xì)胞混懸液以5×107/mL 的濃度腋下注射0.2 mL，待注射部位出現(xiàn)肉眼可見瘤體后，活體狀態(tài)隔皮通過游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長短徑，每周2次，并按腫瘤體積公式［V=（1/2）×a×b2，a：長徑；b：短徑］計算腫瘤體積，并描繪腫瘤的生長曲線；5周后，脫頸處死裸鼠取出腫瘤，測得最終瘤質(zhì)量，浸泡于生理鹽水中備用，腫瘤稱質(zhì)量計算抑瘤率，抑瘤率=（對照組瘤質(zhì)量-實(shí)驗組瘤質(zhì)量）/對照組瘤質(zhì)量×100%。所取標(biāo)本迅速放進(jìn)-80 ℃冰箱冷凍保存待檢，其余以10%福爾馬林固定，切片待用。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3 組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)與四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，采用廣義估計方程（GEE）比較3組細(xì)胞體外侵襲能力及裸鼠成瘤腫瘤體積變化。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲低NEDD9 對BxPC-3 細(xì)胞體外克隆形成的影響 BxPC-3 Y2602 組、BxPC-3 NC 組及 BxPC-3 Blank 組克隆形成數(shù)分別為（35.000±1.732）個、（87.000±2.646）個 、（86.333±7.506）個（n=3，F(xiàn)=120.744，P＜0.01），其中BxPC-3 Y2602 組明顯低于后兩組（P＜0.01），見圖1。

Fig.1 Comparison of the cell clonality between three groups(Crystal violet stain,×100)圖1 3組克隆形成的比較（結(jié)晶紫染色液，×100）

Fig.2 Comparison of the number of cells between three groups(Crystal violet stain,×400)圖2 3組小室內(nèi)細(xì)胞數(shù)目比較（結(jié)晶紫染色液，×400）

Fig.3 Cell scratch test results of the migration ability of cells in each group(×100)圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗檢測各組細(xì)胞的遷移能力（×100）

2.2 敲低NEDD9 對BxPC-3 細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的影響 BxPC-3 Y2602 組遷移至小室下室面的細(xì)胞數(shù)［（74.333±5.508）個/視野］較BxPC-3 NC 組［（173.000±4.583）個/視野］和 BxPC-3 Blank 組［（164.000±30.512）個/視野］組顯著減少（n=3，F(xiàn)=27.266，P=0.01），見圖2。劃痕實(shí)驗顯示，與BxPC-3 Y2602 組 相 比 ，BxPC-3 Blank（β=- 0.158，95%CI：-0.171～-0.146，P＜0.001）及 BxPC-3 NC組（β=-0.069，95%CI：-0.083～-0.055，P＜0.001）的劃痕距離更小，見表1、2，圖3。

2.3 敲低NEDD9 對BxPC-3 細(xì)胞小鼠成瘤影響 5周時，BxPC-3 Y2602組瘤體質(zhì)量及體積均顯著小于BxPC-3 Blank 組及 BxPC-3 NC 組（均P＜0.05）；BxPC-3 Y2602 組較 BxPC-3 Blank 組和 BxPC-3 NC組的抑瘤率分別為55.56%、42.85%，見表3、圖4。

Tab.1 The scratch distance of three groups表1 3組多時點(diǎn)細(xì)胞劃痕距離變化數(shù)據(jù)

Tab.2 Comparison of the scratch distance in vitro by using GEE between three groups表2 GEE模型比較3組多時點(diǎn)細(xì)胞劃痕距離變化

Tab.3 Comparison of the tumor weight and volume after 5 weeks between three groups of mice表3 5周時3組小鼠瘤體質(zhì)量及體積比較

2.4 3 組不同時點(diǎn)裸鼠腫瘤體積變化 與BxPC-3 Y2602 組相比，BxPC-3 NC 組（β=153.835，95%CI：105.371～202.299，P＜0.001）與BxPC-3 Blank組裸鼠腫瘤體積更大（β=123.319，95%CI：61.104～185.535，P＜0.001），見表4、5。

Fig.3 The tumor mass in three groups of mice圖4 5周后3組小鼠及瘤體

3 討論

胰腺癌是致死率極高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高侵襲性和轉(zhuǎn)移率，預(yù)后較差，同時早期診斷相對困難，NEDD9 被證實(shí)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]，但病理機(jī)制未明，本研究在前期工作基礎(chǔ)上探討敲低NEDD9表達(dá)對BxPC-3胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)外功能的變化，探討調(diào)控NEDD9表達(dá)在胰腺癌患者中的意義。

多項研究證實(shí)，NEDD9過表達(dá)導(dǎo)致多種實(shí)體癌轉(zhuǎn)移，如肝癌、乳腺癌、卵巢癌等，其高表達(dá)與腫瘤的惡性進(jìn)展，轉(zhuǎn)移的傾向以及較低的存活率有關(guān)，是癌癥侵襲的生物標(biāo)志物，也是潛在的評估相關(guān)腫瘤預(yù)后的指標(biāo)［9］。NEDD9激活腫瘤細(xì)胞遷移最主要是整合素依賴性信號級聯(lián)激活，并可通過基質(zhì)金屬蛋白酶14（MMP-14）等金屬蛋白酶激活發(fā)揮作用，此外其也可與關(guān)鍵蛋白相互作用，協(xié)調(diào)控制細(xì)胞凋亡、遷移等過程［9-10］。NEDD9參與肺癌轉(zhuǎn)移依賴于黏著斑激酶（FAK）介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及下調(diào)E-鈣黏蛋白［11］，同時NEDD9參與腫瘤轉(zhuǎn)移也受上游小分 子 RNA 如 miR-5195 - 3p［12］及 抑 癌 基 因liverkinaseB1（LKB1）及 FUS1 調(diào)節(jié)［13］，但 NEDD9 對胰腺癌細(xì)胞侵襲研究尚少，機(jī)制未明。本研究主要通過干擾BxPC-3細(xì)胞NEDD9基因表達(dá)觀察細(xì)胞克隆增殖、遷移及侵襲能力以及對小鼠體內(nèi)成瘤的影響。既往研究發(fā)現(xiàn)，低氧促進(jìn)NEDD9表達(dá)加速乳腺癌細(xì)胞的遷移［14］，而敲除NEDD9表達(dá)后抑制了子宮內(nèi)膜癌的增長及侵襲性［15］。本研究細(xì)胞克隆實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，與BxPC-3 NC組及BxPC-3 Blank組比較，BxPC-3 Y2602組細(xì)胞克隆數(shù)明顯降低，瘤體體積及質(zhì)量均減小、遷移至小室下室面的細(xì)胞數(shù)顯著減少；多時點(diǎn)劃痕實(shí)驗顯示，與BxPC-3 Y2602 組相比，BxPC-3 Blank及BxPC-3 NC組的劃痕距離更小；以上結(jié)果表明下調(diào)NEDD9 表達(dá)后胰腺癌BxPC-3 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均顯著下降。另有研究顯示，NEDD9對癌細(xì)胞運(yùn)動能力的影響依賴于Rac1 信號的激活［14］，同時也可能依賴于下級靶蛋白參與腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，BxPC-3 Y2602組瘤體體積及質(zhì)量均顯著小于BxPC-3 Blank 組及BxPC-3 NC 組，表明敲低NEDD9 表達(dá)后胰腺癌的瘤體質(zhì)量及體積顯著減小，腫瘤生長受到顯著抑制，進(jìn)一步證實(shí)了敲低NEDD9 抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及生物體內(nèi)成瘤過程，以上研究結(jié)果證實(shí)NEDD9是潛在的腫瘤治療的生物學(xué)靶點(diǎn)。

Tab.4 The tumor volumes of nude mice in three groups表4 3組不同時點(diǎn)裸鼠腫瘤體積變化 （n=6，mm3）

Tab.5 Comparison of the tumor volume of nude mice by using GEE model between three groups表5 GEE模型比較3組不同時點(diǎn)裸鼠腫瘤體積變化

綜上所述，通過體內(nèi)外實(shí)驗發(fā)現(xiàn)敲低NEDD9表達(dá)后能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞BxPC-3的增殖能力，并且可以對胰腺癌的遷移及侵襲能力起到抑制作用，有效抑制腫瘤生長。這說明，NEDD9有望成為胰腺癌治療的潛在基因靶點(diǎn)以及評估患者臨床預(yù)后的生物標(biāo)志物。但是，本研究未深入分析NEDD9影響胰腺癌生長及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，相關(guān)研究尚需進(jìn)一步開展。