有氧運動對自發性高血壓大鼠心肌纖維化的影響及機制

袁國強，秦永生，彭朋△

高血壓時由于心臟細胞外基質（extracellular matrix，ECM）代謝紊亂、膠原過度沉積而發生心肌纖維化，患者易合并急性心臟損傷（如心律失常、心肌梗死）［1］。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）信號通路以及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）/組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）動態平衡分別是調控膠原合成與降解的主要因素，也是維持ECM 穩態的關鍵調節因子［2］。規律體力活動是高血壓防治的重要非藥物手段，主要方式為有氧運動（跑步、游泳、蹬車等）［3］。研究證實，有氧運動對高血壓患者具有心血管保護效應，不僅能夠有效降低血壓水平，還可抑制心肌細胞凋亡、改善心肌纖維化、增強心功能并提高生活質量［3］。本課題組前期研究顯示，自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）經過8 周跑臺運動后心肌膠原沉積減少，心臟重構得到抑制［4］，然而24 周大負荷運動則加重心肌梗死大鼠心肌纖維化并促進心臟重構［5］，提示體力活動的健康效應具有運動負荷依賴性。因此，本研究以SHR 為模型，以中等強度有氧運動為干預措施，觀察長期（24周）體力活動對心肌纖維化的影響，并探討膠原代謝調控因子TGF-β1、CTGF、MMP-2 和TIMP-2 在其間的作用機制，為高血壓患者臨床康復處方的制定與優化提供依據和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 30只12周齡SPF級雄性SHR，體質量（220±18）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2018-0027。采用隨機數字表法將其分為安靜對照（SHR-rest control，SHR-RC）組和有氧運動（SHR-aerobic training，SHR-AT）組，每組15只。同時以15只同齡、同性別SPF 級Wistar-Kyoto 大鼠作為正常血壓（normotensive control，NC）組，體質量（215±22）g。大鼠適應環境1周后開始正式實驗，即NC 和SHR-RC 組動物在鼠籠安靜飼養，SHRAT組進行24周跑臺訓練。實驗實施過程中，由于意外死亡、訓練時拒跑等原因，共剔除6 只大鼠，其中SHR-RC 組2 只、SHR-AT組4只。

1.1.2 主要試劑與儀器 小動物跑臺購自正華生物儀器設備公司；智能無創血壓測量儀（BP-2010E）購自日本Softron Biotechnology 公司；小動物超聲儀（Vevo 3100）購自加拿大VisualSonics 公司；病理切片機（RM2255）購自德國徠卡儀器有限公司；倒置相差顯微鏡（IX71）購自日本Olympus公司；實時熒光定量PCR 儀（7500 型）購自美國ABI 公司；兔抗鼠MMP-2、TIMP-2、TGF-β1、β-肌動蛋白（β-actin）一抗購自美國Santa cruz 公司；兔抗鼠CTGF、α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 訓練方案 首先測定所有大鼠的運動能力［4］：起始跑速5 m/min，坡度0°，每2 min 速度增加1.5 m/min，直到力竭，記錄峰值跑速和力竭時間。隨后SHR-AT組進行5次/周、共24周的跑臺訓練，運動強度為60%峰值跑速，運動時間逐漸遞增，第1 周為10 min/次，以后每周增加10 min，直至60 min/次。分別于第4、8、12、16、20周重新測定峰值跑速以及時調整運動強度。

1.3 動脈血壓測定 末次訓練后48 h，采用智能無創血壓測量儀測定尾動脈收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），計算平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP），即MAP＝（SBP+2×DBP）/3。

1.4 心臟結構與功能檢測 血壓測定后稱量體質量，用小動物超聲儀檢測心臟結構與功能，取左心室乳頭肌水平進行二維短軸掃描（M 超），指標包括：左心室收縮末期直徑（left ventricular end- systolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期直徑（left ventricular end-diastolic diameter LVEDD）、左心室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）和左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 心臟膠原容積分數（collagen volumetric fraction，CVF）測定 大鼠斷頭處理后取心臟并分離左心室，于左心室最大橫徑處橫切將其分為兩部分，一部分用甲醛固定、石蠟包埋、Masson 染色后于倒置相差顯微鏡下選取10 個視野，并用圖像分析軟件（Image Pro Plus 6.0，美國）測量膠原纖維面積與所選視野面積的比值作為心臟膠原容積分數（collagen volumetric fraction，CVF）；另一部分左心室組織置于-80 ℃低溫冰箱凍存待測相關基因表達。

1.6 胚胎基因mRNA 表達檢測 利用實時熒光定量PCR 法測定心臟胚胎基因mRNA 表達量，包括心鈉素（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉素（brain natriuretic peptide，BNP）和β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）。取30 mg 心肌提取總RNA 并轉錄為cDNA，使用實時熒光定量 PCR 儀測定 mRNA 表達量。反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個循環，記錄循環閾值（cycle threshold，Ct）。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法分析目的基因與內參基因β-actin的比值作為該基因的相對表達量。

Tab.1 The sequence of primer表1 引物序列

1.7 膠原代謝調控分子蛋白表達量檢測 利用Western blot法測定膠原代謝調控分子各蛋白表達量。取50 mg心肌組織勻漿并提取總蛋白，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取100μg 蛋白樣品經7.5%SDS-PAGE 分離后轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。滴加總MMP-2（72 ku，1∶2 000），活化型MMP-2（64 ku，1∶2 000）、TIMP-2（1∶5 000）、TGF-β（11∶2 000）、CTGF（1∶5 000）、α-SMA（1∶5 000）、β-actin（1∶5 000）、GAPDH（1∶10 000）一抗4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶2 000）二抗37 ℃孵育1.5 h。充分洗滌后，ECL 發光成像，利用凝膠成像系統（ChemiDoc XRS，美國）拍攝并掃描各條帶灰度值。將目的蛋白與內參蛋白（β-actin或GAPDH）灰度值的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件包對數據進行處理與分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動脈血壓比較 與NC 組比較，SHR-RC組、SHR-AT 組SBP、DBP 和MAP 增加（P＜0.05）；與SHR-RC 組比較，SHR-AT 組 SBP、DBP 和 MAP 降低（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of arterial pressure betweenthree groups of rats表2 3組大鼠動脈血壓的比較 （）

Tab.2 Comparison of arterial pressure betweenthree groups of rats表2 3組大鼠動脈血壓的比較 （）

＊P＜0.05；a與NC 組比較，b與SHR-RC 組比較，P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

組別NC組SHR-RC組SHR-AT組F n 15 13 11 SBP（mmHg）125.4±5.6 203.8±9.1a 170.0±6.3ab 423.940＊DBP（mmHg）95.2±4.4 156.2±6.2a 120.0±4.9ab 485.079＊MAP（mmHg）105.3±2.9 172.1±4.9a 136.7±4.3ab 946.078＊

2.2 各組心臟結構與功能比較 與NC 組比較，SHR-RC 組 LVEDD 和 LVESD 增加，LVWT 和 LVEF降低（P＜0.05）；與 SHR-RC 組比較，SHR-AT 組LVEDD、LVESD 降低，LVWT 和 LVEF 升高（P＜0.05）。見表3。

Tab.3 Comparison of cardiac structure and function between three groups of rats表3 3組心臟結構與功能的比較 （）

Tab.3 Comparison of cardiac structure and function between three groups of rats表3 3組心臟結構與功能的比較 （）

＊P＜0.05；a與NC組比較，b與SHR-RC組比較，P＜0.05

組別NC組SHR-RC組SHR-AT組F n 15 13 11 LVEDD（mm）7.45±1.26 9.09±1.43a 7.97±1.32b 5.362＊LVESD（mm）3.63±0.77 5.33±0.88a 4.30±0.71ab 15.937＊LVWT（mm）1.88±0.25 1.56±0.58a 2.05±0.37b 4.338＊LVEF 0.741±0.091 0.439±0.065a 0.671±0.089ab 49.268＊

2.3 各組心肌Masson 染色與心臟CVF 比較 心肌Masson染色觀察發現，心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。NC 組心肌肌束間有極少量膠原纖維，SHRRC 組心肌間質可見明顯膠原沉積及纖維化改變，SHR-AT組纖維化程度較SHR-RC組明顯減輕。見圖 1。與 NC 組比較，SHR-RC 和 SHR-AT 組 CVF 增加（P＜0.05）；與SHR-RC 組比較，SHR-AT 組CVF下降（P＜0.05）。見圖2。

Fig.1 Results of myocardial Masson dyeing in the three groups(×400)圖1 3組心肌Masson染色結果（×400）

Fig.2 Comparison of cardiac CVF between three groups of rats圖2 3組心臟CVF的比較

2.4 各組心臟胚胎基因mRNA 表達量比較 與NC組比較，SHR-RC 組 ANP、BNP 和 β-MHC mRNA 表達量上調；與 SHR-RC 組比較，SHR-AT 組 ANP、BNP 和 β-MHC mRNA 表達量下調（P＜0.05）。見圖3。

Fig.3 Comparison of myocardial fetal gene mRNA expressions between three groups of rats圖3 3組心肌胚胎基因mRNA表達量比較

2.5 各組心臟膠原代謝調控分子蛋白表達量比較 與 NC 組比較，SHR-RC 組 TGF-β1、CTGF、TIMP-2 和α-SMA 蛋白表達量上調，活化型MMP-2蛋白表達量及活化型MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05）；與SHR-RC 組比較，SHR-AT 組 α-SMA 蛋白表達量下調，活化型MMP-2 蛋白表達量及活化型MMP-2/TIMP-2 比值升高（P＜0.05），而 TGF-β1、CTGF和TIMP-2蛋白表達量無明顯變化（P＞0.05）。各組總MMP-2 蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

3 討論

高血壓代償期心臟常發生向心性肥厚（心肌增厚、心腔縮窄）以適應過高的外周阻力［7］，然而本研究超聲檢測則顯示SHR 出現左室擴張、心壁變薄、心功能顯著下降，提示心臟處于失代償期并逐漸走向心力衰竭，胚胎基因表達量上調也印證了這一點。組織病理學觀察發現，SHR 心臟CVF 明顯升高，提示心肌發生纖維化；經過24周干預后，SHR-AT組心臟CVF 較SHR-RC 組明顯降低，提示中等強度有氧運動能夠延緩高血壓心肌膠原沉積，這與本課題組前期研究結果［4］以及其他心血管疾病模型［8］的研究結果一致。心肌膠原沉積減少有利于降低心臟硬度、提高室壁順應性、恢復心動周期過程中異常的心肌收縮力分布以及改善心肌電不均一性［9］，從而降低高血壓心血管不良事件的發生率。更為重要的是，SHR 運動后心腔擴張減輕，心功能增強，胚胎基因表達下調，提示運動在減輕心肌纖維化的同時，還可抑制心臟重塑并延緩心力衰竭進程。然而以往研究表明，長期高強度運動可使運動員［10］、健康動物［11］以及心肌梗死大鼠［5］發生心肌纖維化，提示體力活動的心臟健康效應存在“運動負荷閾值”，超出這一閾值則發生適應不良。由此進一步證實，中等強度有氧運動是高血壓患者運動康復的最佳方式。

Tab.4 Comparison of relative protein expressions between three groups of rats表4 3組心臟膠原代謝調控分子蛋白相對表達量（NC組的倍數）的比較 （）

Tab.4 Comparison of relative protein expressions between three groups of rats表4 3組心臟膠原代謝調控分子蛋白相對表達量（NC組的倍數）的比較 （）

＊P＜0.05；a與NC組比較，b與SHR-RC組比較，P＜0.05

組別NC組SHR-RC組SHR-AT組F n 15 13 11總MMP-2 1.01±0.15 0.94±0.12 1.05±0.22 1.218 TIMP-2 1.00±0.18 1.56±0.47a 1.40±0.54a 6.845＊活化型MMP-2/TIMP-2比值1.04±0.33 0.39±0.15a 0.71±0.24ab 21.939＊

心肌纖維化是膠原代謝紊亂所致，其中TGF-β1/CTGF 和MMP-2/TIMP-2 分別是調控膠原合成與降解的主要因子［12］。本研究結果顯示，SHR-RC 組TGF-β1、CTGF 和 TIMP-2 蛋白表達量均較 NC 組顯著性上調，而活化型MMP-2 以及活化型MMP-2/TIMP-2 比值下降，提示膠原合成增加、降解減少是導致高血壓心肌纖維化的主要原因?？侻MP-2 無顯著性變化，這是由于MMP-2合成初始是以無活性的酶原形式存在（72 ku MMP-2），隨后通過翻譯后調控而活化（64 ku MMP-2）［13］，提示高血壓對MMP-2 酶原并無影響。經過24 周運動，與SHR-RC 組比較，SHR-AT組TIMP-2蛋白表達量雖然無顯著性變化，但活化型MMP-2 顯著上調，故活化型MMP-2/TIMP-2比值增加，說明TIMP-2對MMP-2的抑制作用解除，MMP-2/TIMP-2穩態失衡得以改善，膠原降解增加，這與Kwak等［14］以衰老大鼠為模型的研究結果一致，提示運動通過增加膠原降解而抑制心肌纖維化。然而SHR-AT組TGF-β1和CTGF蛋白表達量與SHR-RC 組無明顯差異，提示規律運動并未對膠原合成產生抑制作用。有研究表明，血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）類降壓藥可同時通過減少膠原合成以及促進其降解而減輕高血壓心肌膠原過度沉積［15］。因此筆者推測，高血壓患者在運動康復的同時堅持服用藥物對抑制心肌纖維化可能具有協同效應。

此外，本研究還發現，SHR-RC 組 α-SMA 蛋白表達量較NC 組顯著增加，α-SMA 是成肌纖維細胞標志物，提示高血壓心肌膠原沉積增加的同時還存在成纖維細胞向成肌纖維細胞分化，后者膠原蛋白合成、分泌功能以及促纖維化作用顯著提高［16］。24周運動后，與 SHR-RC 組比較，SHR-AT 組 α-SMA蛋白表達量下調，提示有氧運動在改善心肌纖維化的同時還能夠抑制成纖維細胞向成肌纖維細胞分化。研究證實，TGF-β1和CTGF 可激活成肌纖維細胞［17］，然而SHR-AT 組TGF-β1和 CTGF 蛋白表達量與SHR-RC 組并無明顯差異，提示尚存在其他機制參與有氧運動對成肌纖維細胞分化的抑制效應。

綜上所述，長期規律有氧運動能夠改善SHR 心肌纖維化，并延緩心臟重塑和心力衰竭進程，其機制可能與膠原降解增加（但對膠原合成無影響）以及抑制成纖維細胞向成肌纖維細胞分化有關。