線粒體miRNAs在糖尿病心肌病多個發病環節作用的研究進展

流行病學研究表明全球糖尿病發病率呈逐年上升趨勢。據國際糖尿病聯盟(International Diabetes Federation，IDF)的最新數據顯示，中國2017年糖尿病的患病人數為1.14億人，居全球首位[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是指糖尿病病人出現心室功能障礙，且這種改變可能不與病人潛在的冠狀動脈疾病和高血壓相關[2]。糖尿病心肌病發病隱匿，卻是造成病人出現心力衰竭甚至死亡的主要原因。已有研究發現糖尿病心肌病發病機制涉及多種因素，如高血糖、高血脂、底物代謝改變、氧化應激以及線粒體障礙等。到目前為止，糖尿病心肌病病人仍缺乏特異的診治方法。

MicroRNAs(miRNAs)是一組由19～25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA。miRNAs通過對蛋白質編碼基因的轉錄后修飾進行調節，從而抑制miRNA的翻譯或促進其降解，調節基因表達。每個miRNA可能影響多個靶基因，這使得它們參與了多種慢性病的發病過程，如心血管病、糖尿病、肥胖癥及癌癥等[3]。目前已知人類基因組中約有1 000多種miRNAs，而其保守調控對象占哺乳動物基因的60%以上。越來越多的證據表明，miRNAs在能量代謝、胰島素敏感性、細胞凋亡以及線粒體功能調控中發揮作用，探尋影響糖尿病心肌病發生發展的特定miRNAs有望成為未來的治療靶點。

線粒體通過滿足細胞的能量需求，參與細胞信息傳遞、增殖、分化、代謝等多種活動。功能失調的線粒體是糖尿病心肌病發病機制的核心之一。最近，隨著miRNAs檢測技術的進步，發現許多miRNAs定位在線粒體內并發揮特定作用，這些miRNA被稱為線粒體miRNAs(MitomiRs)[4]。線粒體是一種雙層膜包裹的半自主性細胞器，擁有自己的基因組，生物信息學研究已發現線粒體基因(mtDNA)中約有170個miRNAs的靶點。與其他肌細胞相比，心臟含有更為豐富的線粒體(約占心肌細胞總體積的35%)，有文獻報道MitomiRs調節心肌細胞的核基因或線粒體基因，影響線粒體生物合成或形態[5-6]。此外，MitomiRs亦可通過影響三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle，TCA)、電子傳遞鏈、脂肪酸和氨基酸代謝以及調控線粒體動力學等，造成糖尿病病人的心室功能異常。基于以上背景，本研究旨在對MitomiRs的研究進展做一綜述，并著重介紹其與糖尿病心肌病的關系。

1 miRNAs影響線粒體能量代謝

1.1 miRNAs對三羧酸循環的影響 三羧酸循環是葡萄糖氧化途徑中的關鍵環節。葡萄糖氧化從經糖酵解途徑生成丙酮酸開始，丙酮酸氧化脫羧形成乙酰輔酶A，后者進入三羧酸循環，隨后被氧化生成H2O和CO2，釋放出ATP。由于三羧酸循環是葡萄糖氧化途徑中不可缺少的過程，所以三羧酸循環的任何改變都可能導致心臟能量代謝的改變。近年來已發現miRNAs通過調節該途徑中的多種關鍵酶影響線粒體三羧酸循環。詳見表1。

表1 參與調節線粒體三羧酸循環的miRNAs

丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)是葡萄糖氧化途徑中的關鍵酶，研究表明miR-26a通過對PDH亞基X的靶向調節，降低PDH酶活性，導致丙酮酸積累，并降低線粒體中乙酰輔酶A的水平[7]。另有研究發現以下幾種miRNA，如miR-152、miR-148a、miR-148b、miR-299-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-122a、miR-421和miR-494，可通過調節檸檬酸合成酶(citrate synthase，CS)的表達靶向調節檸檬酸合成酶。這些miRNAs還被發現同時影響脂質、核苷酸、葡萄糖和氨基酸代謝中的約70多個途徑[8]。琥珀酸輔酶A連接酶(succinate CO-A ligase GDP forming beta subunit，SUCLG2)催化琥珀酸轉化為琥珀酰基輔酶A。有文獻報道miR-124下調SUCLG2的表達[9]。異檸檬酸脫氫酶-2(isocitrate dehydrogenase 2，IDH-2)是三羧酸循環中的重要生物酶之一，CO2濃度的升高可以誘導miR-183下調IDH-2，從而影響TCA途徑[10]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子-1β(PGC-1β)是氧化能量代謝的轉錄調節因子，miR-378可以嵌入PGC-1β的編碼基因中，miR-378的增高可抑制PGC-1β的兩個伴侶：雌激素相關受體γ(ERRγ)和GA結合蛋白轉錄因子(GABPA)的表達，從而引起代謝從有氧氧化轉變為糖酵解途徑，最終導致三羧酸循環基因表達和氧消耗的減少以及乳酸的產生[11]。谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)是一種將谷氨酰胺水解為谷氨酸的酶，谷氨酸轉化為α-酮戊二酸之后進入三羧酸循環，因此，它可作為細胞能量的重要來源。已發現miR-23可通過調節GLS的mRNA水平從而抑制GLS表達[12]。

1.2 miRNAs對線粒體電子傳遞鏈的影響 線粒體最重要的生物功能就是為細胞生存提供能量，位于線粒體膜的電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)是由呼吸鏈復合體所構成的氧化還原途徑，是線粒體產生能量的關鍵場所。

溶質載體家族25成員3(Slc25a3)是一種線粒體膜內部的載體，可將無機磷酸鹽轉運至線粒體基質中，其是ATP合酶生成ATP所必需的底物。在糖尿病心臟病人中，miR-141通過對Slc25a3的轉錄水平進行調節影響能量生成[13]。另有研究發現，miR-181c可易位到心肌細胞的線粒體中，靶向調節細胞色素c氧化酶亞基1(mtCOX1)，最終引起呼吸鏈復合體Ⅳ的改變[14]。氧化應激與糖尿病心肌病發病密切相關。電子傳遞鏈中經電子漏生成的大量活性氧(ROS)可導致線粒體損傷[14-15]。鐵硫蛋白(Fe-S)是氧化磷酸化(OXPHOS)過程中電子轉移的重要輔助因子，復合體Ⅰ和Ⅳ的功能均高度依賴于鐵硫蛋白，而鐵硫原子簇組裝酶(ISCU)在鐵硫蛋白的合成中起重要作用[16]。低氧誘導因子-1(HIF-1α)誘導的miR-210已被確認為OXPHOS的潛在調節因子，其通過調節ISCU還原鐵硫蛋白[17-18]。另外，琥珀酸脫氫酶亞基D(SDHD)以及復合體Ⅱ的亞基也被發現是miR-210的靶標。COX10是核基因編碼的復合體Ⅳ的亞基，miR-210-5p通過調節COX10來抑制線粒體功能[19]。以上研究為miR-210通過調節電子傳遞鏈重要組分基因來影響線粒體功能提供了有力證據[20]。

核基因編碼的細胞色素C氧化酶亞基Ⅳ(COXⅣ)是復合體Ⅳ的亞基之一，已有報道miR-338-5p通過調節COX Ⅳ mRNA的3′非翻譯區(3′-UTR)來改變復合體Ⅳ活性[21]；此外，還發現其靶向調節ATP5G1從而增強ATP合酶活性[22]。Zheng等[23]發現線粒體ATP合酶亞基β(ATP5B)的3′-UTR具有miR-101的結合點。在另一項研究中，miR-127-5p也對ATP5B轉錄物的3′-UTR進行調節，從而降低其翻譯效率而不影響mRNA含量[24]。ATP6是一種ATP合酶F0亞基6的線粒體基因，抑制其作用可以影響ATP產生。有研究顯示miR-378調控并結合ATP6基因所在的線粒體轉錄組，引起1型糖尿病的心臟線粒體中ATP6蛋白含量以及功能的下調[25]。詳見表2。

表2 參與調節電子傳遞鏈的miRNAs

2 miRNAs影響線粒體物質代謝

2.1 對脂肪酸代謝的影響 在心臟中，ATP形式的能量來源可通過多種途徑獲得，包括脂肪酸、葡萄糖、乳酸和酮體，但主要能量來源是通過脂肪酸氧化所獲得。在糖尿病心臟中，脂肪酸氧化增強，葡萄糖氧化降低，這種狀態的改變使得最初心室舒張功能障礙發展為收縮功能障礙，引起糖尿病心肌病的發生[26]。在一些研究中，miRNAs已被證明是脂肪酸氧化途徑的關鍵調控者(見表3)。例如，肉堿O辛基轉移酶(carnitine O-octanoylt ransferase，CROT)通過耦聯短鏈脂肪酸轉化為肉毒堿隨后進入線粒體基質。肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmitoyl ransferase 1A，CPT1A)可將酰基輔酶A轉化為酯酰肉堿，使得中或長鏈脂肪酸進入線粒體內進行氧化[27]。已經發現miR-33抑制CROT和CPT1A蛋白的翻譯，減少脂肪酸降解[28]。在另一項研究中，miR-370靶向調節CPT1A的3′-UTR，下調CTP1A基因表達以及脂肪酸的β-氧化[29]。肉毒堿O-乙酰基轉移酶(carnitine O-acetyltransferase，CRAT)是另一種參與脂肪酸代謝的線粒體酶，中介體復合物亞基(MED13)是一種控制核激素受體活性復合物的成分，這兩種物質都受到miR-378的抑制。研究發現miR-378基因缺失的小鼠可以抵抗高脂飲食誘導的肥胖，并且線粒體中脂肪酸代謝和胰島素靶組織中的氧化能力都增強[30]。

過氧化物酶體增殖物激活受體δ(PPARδ)在脂質代謝中起著重要的調節作用[31]。已發現miR-199a-5p通過調節心臟和肝臟線粒體中的PPARδ來減少脂肪酸氧化，同時體內沉默miR-199a～214可以增加其靶點PPARδ的蛋白質表達水平，恢復心臟線粒體脂肪酸氧化以及改善主動脈縮窄術誘導的心力衰竭小鼠的心臟功能[32]。

眾所周知，FOXA2在肝臟的能量代謝中起關鍵作用，miR-29可以抑制FOXA2介導的脂質代謝基因的激活[33]。抑制miR-122后中樞代謝傳感器AMPK的激活增加，引起血漿膽固醇水平降低，伴隨著一些脂肪基因的減少，肝臟脂肪變性明顯改善[34]。

泛酸激酶1(PANK1)參與輔酶A的合成，而后者是參與脂質代謝的關鍵輔助因子。miR-103和miR-107位于PANK1α基因的內含子序列中，在瘦素缺乏的ob/ob和飲食誘導肥胖小鼠的肝臟中miR-103及miR-107上調，其中胰島素受體的關鍵調節因子(caveolin-1)被認為是miR-103/107的靶點[35]。與以上相反，miR-103和miR-107的沉默改善了胰島素敏感性和葡萄糖穩態，而脂肪組織中的過表達足以引起這些小鼠模型體內葡萄糖穩態的紊亂。這在非人類靈長類動物和人類中也得到了證實，表明miR-103和miR-107可能成為改善胰島素抵抗引起肥胖的潛在靶點[36]。此外，miR-696被發現通過負向調節PGC-1α來減少線粒體生物合成和脂肪酸氧化[37]。詳見表3。

2.2 對氨基酸代謝的影響 研究顯示，糖尿病心肌病中氨基酸的代謝途徑發生了改變。心臟中的氨基酸水平不僅改變了心臟的能量儲備，還會影響許多收縮蛋白，這些蛋白對心臟的正常收縮功能至關重要[38]。已有多種miRNAs被發現參與氨基酸代謝調節。如miR-193b可以與絲氨酸羥基轉移酶(serine hydroxyl transferase，SHMT2)的3′-UTR結合，SHMT2可以將絲氨酸轉化為甘氨酸，從而影響氨基酸代謝[39]。GLS是通過脫氨作用將谷氨酰胺轉化為谷氨酸的酶。在人神經祖細胞(NPC)中，發現GLS對細胞增殖和死亡起著重要作用[40]。目前已發現miR-23家族中的miR-23a-3p和miR-23b-3p通過與GLS的3′UTR結合從而起到抑制GLS的作用[41]。另有研究發現，miR-29b通過調節二氫硫辛酰支鏈酰基轉移酶(dihydrolipoyl branched chain acyltransferase，DBT)來影響氨基酸代謝。其中DBT是支鏈α-酮酸脫氫酶的組成成分之一，在亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸的分解代謝中起著重要作用[42]。

3 對線粒體動力學的影響

線粒體是高度動態的細胞器，具有兩種相反的活動：不斷分裂和融合。線粒體分裂和融合之間的動態平衡對維持線粒體形狀、大小和數量及其生理功能至關重要，同時也是維持細胞穩態的必要過程[43]。各種蛋白參與線粒體動力學的調節，線粒體動力學的失調不僅與線粒體功能的失調有關，而且與細胞凋亡密切相關，同時也是糖尿病心肌病的主要發病機制。

在線粒體分裂過程中，一個線粒體被分成兩個較小的線粒體。胞質中的GTP酶動力相關蛋白1(DRP1)是整個過程中不可缺少的蛋白之一。DRP1被募集到線粒體外膜與其他蛋白FIS1、線粒體分裂因子(MFF)、MID49和MID51相互作用，這種相互作用使得在線粒體周圍形成收縮環結構，最終導致線粒體從中間分裂[44]。目前已經發現一些miRNAs可以影響線粒體動力學(見表4)，例如miR-761引起MFF的下調，從而抑制線粒體分裂和細胞凋亡[45]。miR-30家族成員通過抑制p53及其下游Drp-1的表達來抑制線粒體的分裂，調節細胞凋亡[46]。在心臟中敲除miR-140可以抑制線粒體分裂，進而減少動物模型中的心肌梗死面積[47]。在FoxO3a-/-KO的小鼠中，miR-484通過抑制線粒體分裂蛋白Fis1及其下游靶蛋白而抑制線粒體裂變介導的心肌細胞凋亡，降低心肌梗死的發生[48]。miR-484通過與Fis1的氨基酸編碼序列結合并抑制其翻譯來減弱Fis1上調[49]。鈣調神經磷酸酶催化亞基的α和β都是miR-499的直接靶標，miR-499抑制鈣調神經磷酸酶介導的Drp1去磷酸化、減少線粒體中Drp1的積累及其介導的線粒體分裂程序的激活，從而抑制心肌細胞凋亡[50]。miR-106b通過與其結合位點結合靶向調節線粒體融合蛋白-2(Mfn2)的3′端非翻譯區，從而下調Mfn2的蛋白水平，影響線粒體功能和胰島素的敏感性[51]。

表4 參與調節線粒體動力學的miRNAs

4 小結與展望

糖尿病及其相關心臟并發癥的發生日益增多，miRNAs作為糖尿病心肌病的新治療靶點的價值已引起研究人員的極大興趣。隨著技術的進步，RNA測序平臺也愈加完善，越來越多的MitoRNAs將被發現。研究證明miRNAs通過對線粒體內的轉錄物質進行靶向調節，從而影響細胞代謝途徑和線粒體動力學，導致線粒體功能的改變。這種改變最終會引起線粒體功能障礙，這在糖尿病心肌病的發生發展中起到了重要作用。隨著該研究領域的不斷擴展，還需進一步研究miRNAs導入線粒體的具體機制，以及miRNAs如何調節線粒體蛋白等諸多問題。了解MitoRNAs的特性及調節途徑，或可為今后開發治療糖尿病心肌病的新藥物奠定基礎。