復(fù)配及多層包埋植物乳桿菌微膠囊的制備及表征

劉仁杰,李 哲,毛思凝,梁 珊,趙 悅,王玉華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118)

益生菌為有益的活性微生物,能夠在人體胃腸道產(chǎn)生多種天然抑菌物質(zhì),維持人體胃腸道菌群平衡并改善身體狀態(tài)[1]。植物乳桿菌是一種常見的益生乳酸菌,廣泛應(yīng)用于食品、藥品和飼料中。研究表明,植物乳桿菌不僅能夠改善腸道功能、調(diào)節(jié)免疫功能,還能調(diào)節(jié)焦慮、抑郁等情緒功能障礙和阿爾茲海默癥等認知功能障礙,并具有緩解神經(jīng)退變的潛在功效[2]。據(jù)報道,乳酸菌在腸道的活菌數(shù)大于1.00×106CFU/mL時益生作用明顯,然而絕大多數(shù)乳酸菌易受溫度、氧氣、溶劑和機械壓迫等影響,且不耐胃酸和膽鹽[3]。微膠囊包埋可以增強菌體對外界不良環(huán)境的抵抗力,明顯提高菌體的存活率,促進乳酸菌在腸道中定殖,使其充分發(fā)揮益生功能[4]。

目前常用的微膠囊制備方法有相分離法、噴霧干燥法、乳化法等,但都存在使益生菌活性降低的缺陷[5]。銳孔法操作簡單,作用條件溫和,包埋效率高,成本低,在乳酸菌包埋中被廣泛運用[6]。銳孔法可與其他干燥方式結(jié)合使用提高微膠囊性能,其結(jié)合冷凍干燥可縮小微膠囊粒徑,排除多余的氧氣和水分,延長微膠囊儲藏性能[7]。而壁材的選用也是至關(guān)重要的,海藻酸鈉可快速與Ca2+、Zn2+、Al3+鰲合形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠而被廣泛使用,但其孔隙大,低pH下易降解,螯合物與陰離子能使其解聚,容易突釋與早釋[8]。而其他蛋白類壁材也存在制備時間長、易被胃蛋白酶酶解和疏水性基團易使微膠囊相互聚集等缺點。針對壁材的不足,國內(nèi)外研究者認為可以從復(fù)配包埋和多層包埋乳酸菌等方面強化微膠囊性能。Huq等使用復(fù)配包埋提高了微膠囊的顆粒密度和強度,多層包埋可增大微膠囊表面積,提高乳酸菌包埋率和保護效果[9]。但消化道中的菌體存活率不理想,粒徑較大。如何實現(xiàn)各種壁材間的優(yōu)勢互補還需進一步研究。因此,復(fù)配包埋與多層包埋乳酸菌具有較高的研究價值。

本文以包埋率、微膠囊粒徑、抗冷凍干燥存活率、消化道存活率為考察因素,研究不同壁材對植物乳桿菌包埋的影響。此外,表征對比了復(fù)配與多層包埋保護效果的差異,以期為微膠囊包埋技術(shù)與乳酸菌產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 上海瑞豐生物科技有限公司;乳清分離蛋白 上海瑞豐生物科技有限公司;海藻酸鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;明膠 西隴化工股份有限公司;丙三醇 北京化工廠;以上材料均為食品級;植物乳桿菌 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品安全實驗室提供;牛膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;胃蛋白酶(酶活力3000 U/g) 合肥博美生物科技有限責任公司;胰蛋白酶(酶活力250 U/g) 合肥博美生物科技有限責任公司。

Delta320pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;JJ-1精密增力電動攪拌器 金壇市江南儀器廠;奧林巴斯顯微鏡 奧林巴斯北京銷售服務(wù)有限公司;KYC-100B空氣恒溫搖床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;電子螺旋測微計(規(guī)格0～25 mm,分辨率0.001 mm) 鄭州衡量科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銳孔法制備植物乳桿菌微膠囊

1.2.1.1 植物乳桿菌菌懸液的制備 將植物乳桿菌活化,4 ℃、13000 r/min離心5 min后收集菌體細胞,用 pH7.00的PBS緩沖液沖洗兩次,制備1.00×1010CFU/mL菌懸液,備用。

1.2.1.2 大豆分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊的制備 改進Chen等[10]的制備方法。取4.00 g大豆分離蛋白溶于100 mL無菌水,60 ℃水浴改性30 min后冷卻至室溫。加入1.00 g海藻酸鈉與6.00 g丙三醇,150 r/min攪拌10 min進行復(fù)配,再加入菌懸液10 mL繼續(xù)攪拌5 min形成混合液,緩慢滴入1.00%氯化鈣溶液中固定化30 min,無菌生理鹽水洗滌3次,將上述制備的微膠囊在-20 ℃預(yù)凍8～12 h,置于-50 ℃冷凍干燥10 h完成微膠囊的制備。

1.2.1.3 乳清分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊的制備 改進Wongsasulak等[11]的制備方法。取5.00 g乳清分離蛋白溶于100 mL無菌水,60 ℃水浴改性30 min后冷卻至室溫。加入1.00 g海藻酸鈉與7.00 g丙三醇,150 r/min攪拌10 min進行復(fù)配,再加入菌懸液10 mL繼續(xù)攪拌5 min形成混合液,緩慢滴入1.00%氯化鈣溶液中固定化30 min,無菌生理鹽水洗滌3次,參照1.2.1.2進行凍干。

1.2.1.4 明膠-大豆分離蛋白多層微膠囊的制備 制備的大豆分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊加入1.00%明膠溶液,150 r/min攪拌10 min,使明膠均勻覆蓋,3000 r/min離心5 min,無菌生理鹽水洗滌3次,參照1.2.1.2進行凍干。

1.2.1.5 明膠-乳清分離蛋白多層微膠囊的制備 制備的乳清分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊加入1.00%明膠溶液,150 r/min攪拌10 min,使明膠均勻覆蓋,3000 r/min離心5 min,無菌生理鹽水洗滌3次,參照1.2.1.2進行凍干。

1.2.1.6 海藻酸鈉微膠囊的制備 在100 mL無菌水中加入1.00 g海藻酸鈉與6.00 g丙三醇混合均勻,加入菌懸液10 mL繼續(xù)攪拌5 min形成混合液,緩慢滴入1.00%氯化鈣溶液中固定化30 min,無菌生理鹽水洗滌3次,作空白對照組,參照1.2.1.2進行凍干。

1.2.1.7 活菌計數(shù) 根據(jù)GB 4789.35-2016使用稀釋涂布平板法進行活菌計數(shù)。

1.2.2 微膠囊包埋率測定 植物乳桿菌微膠囊用3.00%的檸檬酸三鈉溶液進行破碎處理,根據(jù)1.2.1.7進行活菌計數(shù)。包埋率的計算公式如下[12]:

式中:N表示包埋后的植物乳桿菌活菌數(shù),log CFU·g-1;N0表示包埋前的植物乳桿菌活菌數(shù),log CFU·g-1。

1.2.3 微膠囊的粒徑檢測 用電子螺旋測微計分別測量凍干后的微膠囊,每份樣品測量100個微膠囊并取平均值。

1.2.4 人工唾液、胃液與腸液的配制 配制人工唾液,添加0.75 g氯化鉀、0.15 g磷酸氫二鉀、0.99 g碳酸氫鈉、0.03 g六水合氯化鎂和0.01 g碳酸銨于500 mL無菌水中混合均勻,并用1.00 mmol/L鹽酸或1.00 mmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.00,備用。

配制人工胃液,添加0.26 g氯化鉀、0.02 g磷酸二氫鉀、1.05 g碳酸氫鈉、1.40 g氯化鈉、0.01 g二水合氯化鎂、0.04 g碳酸銨和0.01 g二水合氯化鈣于500 mL無菌水中混合均勻,并用1.00 mmol/L鹽酸或1.00 mmol/L氫氧化鈉調(diào)pH至2.00,胃蛋白酶保持在3.20 g/L,備用。

配制人工腸液,添加0.25 g氯化鉀、0.01 g磷酸二氫鉀、3.27 g碳酸氫鈉、1.12 g氯化鈉、6.13 g六水合氯化鎂和0.03 g二水合氯化鈣于500 mL無菌水中混合均勻,并用1.00 mmol/L鹽酸或1.00 mmol/L氫氧化鈉調(diào)整pH至7.40,胰酶保持在10.00 g/L,膽鹽保持在3.00 g/L,備用[13]。

1.2.5 體外消化道中植物乳桿菌存活率測定方法

1.2.5.1 人工唾液中植物乳桿菌存活率測定 實驗組:將制得的微膠囊加入20 mL人工唾液中,37 ℃、150 r/min勻速搖動10 min,每隔1 min按GB 4789.35-2016使用涂布平板法進行活菌計數(shù)。對照組:將1 mL植物乳桿菌菌懸液加入20 mL人工唾液中,37 ℃、150 r/min勻速搖動10 min,每隔1 min按同樣方法進行活菌計數(shù)。

1.2.5.2 人工胃液與腸液中植物乳桿菌存活率測定 實驗組:將上述已通過人工唾液的微膠囊加入20 mL人工胃液中,37 ℃、150 r/min勻速搖動120 min,通過人工胃液的微膠囊加入20 mL人工腸液中勻速搖動120 min,每隔30 min按1.2.5.1進行活菌計數(shù)。對照組:通過人工唾液的植物乳桿菌離心后加入20 mL人工胃液中,37 ℃、150 r/min勻速搖動120 min,通過人工胃液的植物乳桿菌離心后加入到20 mL人工腸液中勻速搖動120 min,每隔30 min按1.2.5.1進行活菌計數(shù)。

1.2.5.3 植物乳桿菌存活率的測定 植物乳桿菌微膠囊用3.00%的檸檬酸三鈉溶液進行破碎處理,根據(jù)1.2.5.1進行活菌計數(shù)。存活率的計算公式如下:

式中:S表示處理后的植物乳桿菌活菌數(shù),log CFU·g-1;S0表示處理前的植物乳桿菌活菌數(shù),log CFU·g-1。

1.2.6 微膠囊的形態(tài)特征觀察 用光學(xué)顯微鏡觀察微膠囊的形態(tài)特征,并用數(shù)碼相機進行記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均進行3次平行測定,結(jié)果以Mean±SD的形式表示。采用GraphPad Prism軟件對試驗數(shù)據(jù)進行標準差及顯著性分析,并以P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊包埋率的檢測結(jié)果

如圖1所示,與空白對照組相比,不同壁材的微膠囊包埋率均顯著提高(P<0.05),由此得出大豆分離蛋白、乳清分離蛋白和明膠均可增強微膠囊的包埋效果,能夠容納更多植物乳桿菌。Khan等[14]發(fā)現(xiàn)蛋白類壁材與海藻酸鈉復(fù)配可以提高微膠囊的包埋率,這與本文的研究結(jié)果一致。與不含明膠的單層微膠囊相比,雙層微膠囊包埋率略有下降,這可能是由于雙層包埋需進一步攪拌附著明膠,增加攪拌時間,使微膠囊外層的乳酸菌細胞被攪拌器所傷,但包埋率仍處于較高水平,這與Zaeim等的研究結(jié)果一致[15]。

圖1 不同壁材包埋的植物乳桿菌包埋率Fig.1 Encapsulation efficiency of Lactobacillus plantarum with different wall materials注:柱上字母不同表示有顯著性差異(P<0.05),圖2、圖3同。

2.2 微膠囊粒徑的測定結(jié)果

如圖2所示,多層微膠囊與空白組相比差異顯著(P<0.05),粒徑增大,可能與多層微膠囊添加壁材更多有關(guān)。但微膠囊粒徑都小于2.00 mm,不會對微膠囊感官性狀造成影響,符合微膠囊的制備要求。且粒徑較大的微膠囊具有更強的耐酸能力[16]。

圖2 不同壁材微膠囊的粒徑Fig.2 Particle size of microcapsules with different wall materials

2.3 冷凍干燥后植物乳桿菌的存活率

冷凍干燥過程會造成部分微生物細胞的損傷或死亡,不同壁材在冷凍干燥過程的保護效果[17],如圖3所示。結(jié)果表明不同壁材微膠囊與空白對照組差異均顯著(P<0.05),添加明膠、大豆分離蛋白或乳清分離蛋白后,菌體存活率顯著提高(P<0.05),明膠-大豆分離蛋白多層微膠囊保護效果顯著高于其他組(P<0.05),存活率為96.24%,僅用海藻酸鈉包埋對菌體活性的保護效果不佳。郝瑩等[18]研究發(fā)現(xiàn)蛋白類壁材可在細胞表面形成保護層,海藻酸鈉能形成高粘度玻璃態(tài),降低分子擴散系數(shù),從而起到保護效果。Janja等[19]研究表明復(fù)配及多層包埋能有效提高植物乳桿菌的凍干過程中的存活率,與本文結(jié)果一致。

圖3 冷凍干燥后不同壁材包埋的植物乳桿菌存活率Fig.3 Survival rate of Lactobacillus plantarum encapsulated in different wall materials after freeze-drying

2.4 經(jīng)體外消化道試驗后植物乳桿菌的存活率

體外消化道中復(fù)配及多層包埋對植物乳桿菌存活率的影響如圖4和圖5所示。如圖4A所示,盡管體內(nèi)含有唾液淀粉酶和大量的無機鹽,但食物通過人體口腔和食管的時間只需30～120 s,包埋前后植物乳桿菌存活率無顯著變化(P>0.05)。說明通過人體口腔和食管時包埋與否對植物乳桿菌菌體活性影響不大。

圖5 微膠囊光學(xué)顯微鏡圖(40×)Fig.5 Microstructure of microcapsules(40×)

從圖4B得出,未包埋的植物乳桿菌在模擬胃環(huán)境120 min時菌體存活率為20.44%,進入模擬小腸環(huán)境30 min后活菌數(shù)降為0。表明未包埋的植物乳桿菌難以通過胃腸道到達人體回腸部位。已有報道乳酸菌活菌數(shù)低于1.00×106CFU/mL時難以發(fā)揮益生作用[20]。本研究中,海藻酸鈉微膠囊包埋的植物乳桿菌在模擬消化道迅速死亡,進入小腸后菌體存活率降為30.07%,可能是因為海藻酸鈉微膠囊存在較大孔隙,使得胃酸快速進入微膠囊內(nèi)部,降低植物乳桿菌存活率,因此應(yīng)選擇兩種或多種壁材制備微膠囊。多層包埋微膠囊通過消化道后植物乳桿菌的存活率達到84.41%以上。明膠-大豆分離蛋白多層微膠囊菌體存活率達到85.73%,高于其他組別,證明明膠-大豆分離蛋白多層包埋具有良好的耐酸耐膽鹽效果。這可能是外層明膠阻礙了胃蛋白酶對里層壁材的酶解,并阻礙了部分胃酸的進入[21]。里層蛋白分子具有較大數(shù)量的堿性氨基酸殘基能夠中和入侵的H+,維持微膠囊內(nèi)部pH的中性環(huán)境,從而對植物乳桿菌起到保護作用[22]。Laelorspoen等[23]研究發(fā)現(xiàn)在pH1.2(含胃蛋白酶)的模擬胃環(huán)境中,蛋白類與海藻酸鈉復(fù)配使乳酸菌存活率提高了5倍,證明了這一觀點。

圖4 體外消化道中的植物乳桿菌存活率變化情況Fig.4 Changes survival rate of Lactobacillus plantarum in digestive tract in vitro

由圖5可知,空白對照組與乳清分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊表面孔隙較大、凹凸不平、結(jié)構(gòu)疏松,多層微膠囊表面更加圓滑完整且均勻,無光影,這可能由于明膠填補了蛋白與海藻酸鈉壁材間的孔隙,一定程度上阻斷了胃酸和膽鹽進入微膠囊,使包埋更完整。Maria等[24]研究發(fā)現(xiàn)明膠表面正電荷與結(jié)冷膠的負電荷能夠相互作用,使得微膠囊結(jié)構(gòu)更緊實,這與本文研究結(jié)果一致。在胃液中,各組微膠囊在遇強酸后均出現(xiàn)不同程度的收縮,阻止胃酸的進入,其中多層包埋組別的微膠囊效果更明顯。在腸液中,明膠-大豆分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊結(jié)構(gòu)最為完整,證明其緩釋效果最佳,其他組別在溶脹過程中微膠囊結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度的破損,進一步證明復(fù)配結(jié)合多層包埋制備的微膠囊包埋效果更佳。

3 結(jié)論

本實驗使用復(fù)配結(jié)合多層包埋的方法制備的明膠-大豆分離蛋白多層微膠囊包埋率達到95.31%,經(jīng)冷凍干燥后菌體存活率達到96.24%,在體外消化道試驗中菌體存活率達到85.73%,且微膠囊的結(jié)構(gòu)質(zhì)密,冷凍干燥后粒徑較小。復(fù)配結(jié)合多層包埋的方法改善了傳統(tǒng)單一海藻酸鈉微膠囊孔隙過大、蛋白類壁材易被酶解的缺陷,實現(xiàn)各類壁材的優(yōu)勢最大化,明顯提高了植物乳桿菌通過消化道的存活率,能夠更好地發(fā)揮其益生效用,為微膠囊的制備提供了新的手段和思路。同時,此法制備過程簡單,工藝容易控制,且制成的微膠囊滿足一定的市場需求,為乳酸菌微膠囊產(chǎn)品的進一步開發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。