同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物殘留量的不確定度評定

劉 柱1,徐瀟穎1,趙超群1,陳萬勤1,梁晶晶1,毛思浩1,華 穎

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院,浙江杭州 310052;2.浙江中醫藥大學藥學院,浙江杭州 310053)

孔雀石綠(malachite green,MG)和結晶紫(crystal violet,CV)都屬于人工合成的三苯基甲烷類堿性染料,工業上常用于紙張、皮革、紡織工藝品的染色,因具有較強的殺菌、消毒作用且價格低廉,因此被違規用于水產品的養殖和運輸過程中,防治魚、蝦等水產品的水霉病、爛鰓病以及寄生蟲病等,以延長水產品的存活時間[1-4]。在魚、蝦等水產品中,孔雀石綠和結晶紫常被發現,甚至在魚苗中亦能檢測到[5-6]。孔雀石綠、結晶紫對人類都具有嚴重的毒副作用,能抑制骨髓造血功能,引起人類的再生障礙性貧血、粒細胞缺乏癥、新生兒、早產兒灰色綜合征等疾病,低濃度的藥物殘留也能導致病原菌的耐藥性[7-8]。其代謝物-隱性孔雀石綠(leuco malachite green,LMG)和隱性結晶紫(leuco crystal violet,LCV)的毒性則更強[9],因此,世界各國均已禁止在水產品養殖和儲運過程中使用孔雀石綠[10],我國2002年農業部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》將MG列為禁用藥物[11],但近年來依然存在非法使用的問題,給水產品行業和消費者安全帶來嚴重影響[12]。

水產品中MG、CV、LMG、LCV殘留量低,基質復雜,前處理和檢出技術要求高,目前國內外對水產品中孔雀石綠、結晶紫和其代謝產物的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[13-15]和液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[16-18]。其中HPLC-MS/MS法靈敏度高、選擇性好,成為最為常用的方法,但HPLC-MS/MS容易受到基質效應的影響,因此目前常采用同位素稀釋法降低質譜的基質效應,提高檢測結果的可靠性[19]。有關HPLC法和LC-MS/MS法檢測孔雀石綠的不確定評價方法常有報道[20-23],而采用同位素稀釋-UPLC-MS/MS法檢測水產品中孔雀石綠、結晶紫和其代謝產物的不確定度評定方法的研究報道基本空缺。本研究采用的方法主要依據國家標準GB/T 19857-2005[24]規定的同位素內標LC-MS/MS法,同時為了提高結果的準確性和可靠性,在國家標準方法的基礎上增加了D6-結晶紫(D6-CV)和D6-隱色結晶紫(D6-LCV)兩個同位素內標,并簡化了前處理步驟。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性,與測量結果相聯系的參數[25],其數值的大小反映了測量結果質量的高低,并直接與檢驗結果的合格判定相關[26-27]。本實驗參考JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[25]及CNAS-GL006-2019《化學分析中不確定度的評估指南》[28],通過對同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物方法的不確定度進行評定,期望為實驗室質量控制提供科學、準確、可信的依據,同時為采用同位素內標法測量其他獸藥殘留量的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孔雀石綠(MG)(純度≥95%)、結晶紫(CV)(純度≥92.5%)、隱色孔雀石綠(LMG)(純度≥98.5%)、隱色結晶紫(LCV)(純度≥99%) 德國Dr. Ehrenstorfer公司;同位素內標D5-孔雀石綠(D5-MG)(純度≥99.7%)、D6-結晶紫(D6-CV)(純度≥99.1%)、D6-隱色孔雀石綠(D6-LMG)(純度≥100%)、D6-隱色結晶紫(D6-LCV)(純度≥99.9%) 德國WITEGA公司;實驗用水產品(鱸魚、鯽魚、明蝦) 杭州市當地超市;乙腈、甲醇 色譜醇，德國Merck公司;試驗用水 為Milli-pore超純水;其他試劑 均為國產分析純。

AB-5500 QTRAP超高效液相色譜-串聯質譜儀 配有ESI電噴霧離子源，美國AB SCIEX公司;Shimadzu LC-30AD超高效液相色譜儀 日本島津公司;Milli-Q Gradient超純水儀 法國Millipore公司;高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;Multi-Prep多樣品均質器 美國Pro Scientific公司;全自動氮吹濃縮儀 美國Biotage公司;MS3渦旋混合器 德國IKA公司;XPE-205電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;固相萃取裝置 美國Waters公司;中性氧化鋁固相萃取柱 規格6 mL,500 mg,美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品儲備液和稀釋液的配制 分別準確稱取MG、LMG、CV、LCV各10.0 mg(精確至0.01 mg)至100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,即得100 mg/L的標準儲備液;用移液槍分別精密移取0.5 mL標準儲備液至50 mL容量瓶中,用乙腈定容,即得混合標準工作液a(1000 μg/L);用移液槍精密移取1.0 mL 混合標準工作液a至10 mL容量瓶中,用乙腈定容,即得混合標準工作液b(100 μg/L)。

分別精密稱取D5-MG、D6-LMG、D6-CV、D6-LCV各3.0 mg(精確至0.01 mg)至20 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,即得同位素內標儲備液;用可調移液槍分別準確移取各同位素內標儲備液溶液0.5～50 mL容量瓶中用乙腈定容,即得1.5 μg/mL的同位素內標工作液。

1.2.2 樣品前處理 精密稱取5.0 g(精確至0.0001 g)已混勻的樣品于50 mL離心管中,加入100 μL同位素內標工作液,再加入8 mL乙腈,超聲振蕩提取2 min,8000 r/min勻漿提取30 s,然后再4000 r/min離心5 min,轉移上清液移至25 mL容量瓶中;用玻棒搗碎離心管中的沉淀,再用8.0 mL乙腈按照上述操作重復提取一次,上清液合并至25 mL容量瓶中,用乙腈定容,搖勻備用。

精確移取2.0 mL樣品提取溶液加至已活化(使用前用5 mL乙腈活化)的中性氧化鋁柱上,用3 mL乙腈洗脫兩次,收集全部流出液和洗脫液于10 mL試管中,35 ℃下氮氣吹至近干,加入2.0 mL初始流動相,漩渦溶解復溶,0.22 μm微孔濾膜過濾后轉移至樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Waters Atlantis T3(150 mm×2.1 mm,5.0 μm)或相同效能色譜柱;流動相采用10 mmol/L 乙酸銨溶液和乙腈;流速:0.4 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜分離梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution program

1.2.4 質譜條件 離子源:電噴霧離子源,正離子掃描;掃描方式:多重反應監測;電離電壓:5500 V;離子源溫度:500 ℃;氣簾氣流速:30 L/min;碰撞氣流量:5 L/min;電源;化合物定性離子對、定量離子對、錐孔電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表2。

表2 質譜參數Table 2 MS parameters

注:“*”表示定量離子。

在1.2.3和1.2.4的色譜分析條件和質譜分析條件下,MG、LMG、CV、LCV可以獲得較好的分離度,如圖1和圖2所示,表明分析條件合理,可以進行不確定度評定。

圖1 MG、LMG、CV、LCV的提取離子譜圖Fig.1 Extracted ion chromalograms of MG,LMG,CV,LCV

圖2 D5-MG、D6-LMG、D6-CV、D6-LCV的提取離子譜圖Fig.2 Extracted ion chromalograms of D5-MG,D6-LMG,D6-CV and D6-LCV

1.2.5 數學模型的建立 根據水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物殘留量的測定原理和方法,待測物中被測物質殘留量的計算公式:

式中:X為試樣中被測物質的殘留量,μg/kg;C為從標準工作曲線得到的試樣測定液中被測物質的質量濃度,μg/L;V為試樣溶液的定容體積,mL;m為試樣溶液代表試樣的質量;f為進樣重復性、樣品預處理過程等因素。

標準工作曲線由最小二乘法進行線性擬合而成,同位素內標法定量,并根據標準工作曲線以峰面積計算得到待測組分的質量濃度。標準溶液配制、體積量取等影響不確定度的相關因素之間采取多元回歸分析,確定多個變量的因果關系,建立預測的數學模型。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

從測量過程和數學模型,對同位素內標稀釋-LC-MS/MS法檢測水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物殘留量的測定結果影響的各種不確定度分離進行分析,具體引入的不確定度來源的因果圖如圖3所示。

圖3 同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產品中孔雀石綠、結晶紫、隱性孔雀石綠、隱性結晶紫的殘留量的不確定度來源Fig.3 Uncertainty source for determination of malachite green, crystal violet,leuco malachite green and leuco crystal violet in aquatic products by isotope dilution-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

從圖3中可以看出,影響測定結果不確定度的主要來源有:a.對照品濃度,配制過程引入的不確定度urel(c);b.樣品稱量引入的不確定度urel(m);c.樣品前處理過程中移取和量取體積引入的不確定urel(V);d.測試過程中曲線擬合以及隨機效應引入的不確定度urel(f),包括重復性、回收率、樣品均勻性和代表性等因素引入的不確定度。

2.2 待測物引入的不確定度

待測物(C)的不確定度來源由兩個因素組成,即標準系列溶液配制和由標準曲線擬合時所產生的不確定度。其中標準系列溶液配制包括儲備液配制、稀釋及標準曲線溶液配制3個部分[29-31]。

2.2.1 配制標準儲備液和稀釋液引入的測量不確定度urel(c)(屬于B類不確定度評定) 配制標準儲備液和稀釋液引入的不確定度由以下幾個分項構成:a.MG、LMG、CV、LCV四種標準品本身引入的不確定度urel(c1);b.稱取標準品引入的不確定度urel(c2);c.10 mL容量瓶定容引入的不確定度urel(c3);d.50 mL容量瓶兩次稀釋、定容引入的不確定度urel(c4)和urel(c5);e.l mL可調移液器兩次移液引入的不確定度urel(c6)和urel(c7);以及配制標準工作曲線引入的不確定度urel(c8)。

由于本方法采用的是同位素內標稀釋法,同位素內標濃度不參與測量結果的計算,因此在此過程中可不考慮同位素內標配制的不確定度,只評估在繪制標準工作曲線時加入同位素內標時引入的不確定度。

表3 標準品系列溶液配制過程中引入的不確定度Table 3 Uncertainty resulting from standard solution preparation

2.2.1.3 10 mL容量瓶定容引入的不確定度urel(c3) 本實驗所用10 mL容量瓶(A級)在20 ℃條件下的允差Δ為±0.02 mL,取矩形分布,則由定容引入的不確定度為:

2.2.1.4 50 mL容量瓶兩次稀釋定容引入的不確定度urel(c4)、urel(c5) 本實驗所用50 mL容量瓶(A級)在20 ℃條件下的允差Δ為±0.05 mL,取矩形分布,則由定容引入的不確定度為:

2.2.1.6 配制標準系列引入的不確定度urel(c8)(屬于B類不確定度評定) 分別使用200和1000 μL的移液器,分別精密移取混合標準工作液b(100 μg/L)50、100、200、400、600、800、1000 μL,置于10 mL容量瓶中,再使用50 μL的移液器向每個容量瓶中加入40 μL內標工作液,最終用初始流動相定容即得標準系列。按照JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[33]和JJG 646-2006《移液器檢定規程》的要求,配制標準系列過程中所使用的玻璃量器和移液器引入的相對標準不確定度見表3。

則由標準系列溶液配制過程中引入的相對不確定度為:

表4 標準曲線數據及處理Table 4 Standard curve data and processing

通過研究配制標準系列溶液過程中的不確定度評定發現,相對于非同位素內標法而言,不確定度的來源中增加了因添加同位素內標時引入的不確定度,因此應用同位素內標法進行檢測時,應將同位素內標稀釋至合適的濃度,以便在標準系列工作液配制時添加適當的同位素內標溶液體積,降低因配制標準系列溶液引入的不確定度。

2.2.2 采用最小二乘法擬合標準工作曲線求得試樣濃度過程引入的不確定度urel(Cpred)(屬于B類評定) 對“2.2.1.6”配制的7個水平的標準系列工作液,其對應的濃度為0.5、1、2、4、6、8、10 μg/L,按照“1.2.3”和“1.2.4”的方法重復測定2次,測得4種化合物的峰面積和相應同位素內標峰面積,結果如表4所示,以標準溶液濃度(μg/L)為橫坐標,以化合物和相應同位素內標峰面積比值為縱坐標,得到MG、LMG、CV和LCV的回歸方程、截距和線性決定系數R2結果如表5所示。

各化合物擬合而成的線性回歸方程為Y=aX+b(b為截距,a為斜率),對購買的陽性樣品中各待測化合物進行6次重復測定,其結果見表5,根據樣品中各待測化合物與對應同位素內標的比值,利用標準工作曲線的線性回歸方程求得相應的濃度,根據貝塞爾公式,標準曲線的擬合標準偏差為:

式中:S(A)為標準曲線的擬合標準偏差;Ai為標準溶液與內標溶液響應值的比值;Ci為標準系列溶液的濃度,μg/L;n為標準溶液測定的總次數(不包含0點);a為標準曲線的斜率;b為標準曲線的截距。

將表4和表5中的數據帶入S(A)計算公式,得出MG的S(A)=0.0181091;LMG的S(A)=0.00724365;CV的S(A)=0.0118181;LCV的S(A)=0.00332523。

則由最小二乘法擬合標準工作曲線所引入的標準不確定度的計算式為:

將相應的數據帶入公式進行計算,得出MG的u(Cpred)=0.055184;LMG的u(Cpred)=0.043917;CV的u(Cpred)=0.0308395;LCV的u(Cpred)=0.0472514。

2.3 樣品前處理過程引入的不確定度

2.3.2 添加內標溶液引入的不確定度urel(I)(屬于B類不確定度評定) 采用200 μL移液器移取100 μL混合同位素內標工作液(1.5 μg/mL)至稱取的樣品中導致的不確定度urel(I)=urel(V200)=0.866%。

由于加入內標后,樣品中MG、LMG、CV和LCV與其對應的同位素內標D5-MG、D6-LMG、D6-CV、D6-LCV含量的比值不會因為體積的變化而變化,因此在樣品的前處理過程中提取液的定容體積、移取待凈化液的體積和凈化濃縮后的定容體積都對以化合物和相應同位素內標含量的比值沒有影響,因此這些過程對檢測結果的不確定度沒有影響。

2.4 回收率產生的不確定度urel(R)

表6 重復測定檢測結果Table 6 Repeatability of determination of MG,LMG,CV and LCV

注:“/”表示未進行計算。

表7 重復測定檢測結果Table 7 Repeatability of determination of MG,LMG,CV and LCV

在6份空白魚肉樣品中添加MG、LMG、CV、LCV混合標準工作液,使樣品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物的濃度為20 μg/kg,按照“1.2.2”進行樣品前處理,再按照“1.2.3”和“1.2.4”的方法利用同位素稀釋法進行檢測,測得加標回收的結果詳見表6。

2.5 測試重復性引入的不確定度urel(f)

測試過程隨機效應引入的不確定度,包括樣品預處理過程、樣品經中性氧化鋁柱凈化過程、進樣重復性、樣品均勻性和代表性等影響因素,屬于A類不確定度評定。根據“2.2.2”表5中陽性樣品各待測化合物6次重復測定的結果計算該陽性樣品中MG、LMG、CV和LCV的含量見表7。

2.6 測量不確定度的評定與報告

計算得到MG、LMG、CV和LCV的相對合成標準不確定度詳見表8。

表8 MG,LMG,CV 和 LCV的相對標準不確定度Table 8 List of relative uncertainty components for MG,LMG,CV and LCV

表9 不確定度評估結果Table 9 Uncertainty evaluation for the determination

3 結論

采用多種同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)同時測定水產品中孔雀石綠、結晶紫、隱性孔雀石綠、隱性結晶紫殘留量的實驗過程中,稱量、提取、凈化和質譜測定等過程均會引入不確定度,本研究系統深入地對樣品的稱量、玻璃儀器、標準溶液的配制和稀釋、樣品重復性測定、加標回收、標準曲線擬合等因素進行綜合考量,結果表明,在樣品的前處理過程中提取液的定容體積、移取待凈化液的體積和凈化濃縮后的定容體積都對以化合物和相應同位素內標含量的比值沒有影響,因此這些過程對檢測結果的不確定度沒有影響。標準溶液配制和標準曲線擬合過程引入的不確定度最大,其次是重復性,而標準溶液配制中又以標準曲線配制引入的不確定度最大,而樣品稱量引入的不確定度可忽略不計。因此,在實際操作過程中,可通過調整同位素內標的加標體積,增加混合標準系列溶液的測定次數,增加平行樣品測定,保持超高效液相色譜-串聯質譜儀器較高的靈敏度,并定期對所涉儀器進行檢定和提高操作人員的熟練水平,來減小測量不確定度,從而保證檢測結果的準確性。