金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分的測(cè)定分析

(北京一輕研究院,北京市食品工業(yè)研究所,北京 101111)

金銀花(LonicerajaponicaThunb.),正名忍冬,是忍冬科忍冬屬植物,其干燥花蕾或帶初開的花是一種藥食同源的天然產(chǎn)物,被列于國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄》中。金銀花有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效,可用浸提法來(lái)制備茶飲料[1]、泡騰飲料片[2],也可用蒸餾法來(lái)制備金銀花露[3],自古以來(lái)就是夏天消暑清熱的飲品,據(jù)《綱目拾遺》記載:“氣芬郁而味甘”。金銀花露除了作為非處方中藥制劑在藥店銷售外,也常被制成無(wú)糖型或含糖型的普通飲料在超市銷售,生產(chǎn)廠家主要集中在湖北省、山東省。

金銀花露的已有研究工作主要有:張幸生等[4]研究了防腐劑、pH、抗氧化劑等對(duì)金銀花露質(zhì)量穩(wěn)定性的影響;杜春華等[5]建立了金銀花露微生物限度與控制菌的檢查方法并進(jìn)行了驗(yàn)證;張瑾等[6]、陸興毅等[7]分別建立了液相色譜測(cè)定金銀花露中防腐劑的方法;張思遠(yuǎn)等[8]研究發(fā)現(xiàn)金銀花露殘液提取物對(duì)金黃色葡萄球菌等致病菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用;肖瑛瓊等[9]利用金銀花露的生產(chǎn)固體殘?jiān)?通過(guò)添加氧化鈣制備了生物有機(jī)肥。徐俊虎等[10]將厭氧污泥接種至金銀花露藥渣,發(fā)酵獲得了甲烷。上述工作一部分集中于金銀花露的質(zhì)量控制(性狀、微生物、防腐劑)研究;一部分集中于金銀花露生產(chǎn)廢渣的增值利用工藝開發(fā)。目前,與金銀花制品相關(guān)的揮發(fā)性成分研究主要集中于金銀花揮發(fā)油的分析[11-16],針對(duì)金銀花露揮發(fā)性成分的相關(guān)研究還很少[17-18],僅有少數(shù)研究者采用氣相色譜法測(cè)定了金銀花露中芳樟醇的含量,未涉及到金銀花露揮發(fā)性成分的種類、含量及其香氣特點(diǎn)分析。因此,本文采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Headspace-Solid phase microextraction-Gas chromatography-Mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)[19-22],對(duì)金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分的種類、含量進(jìn)行了測(cè)定分析,并結(jié)合香氣分析、聚類分析,旨在為金銀花露實(shí)際生產(chǎn)中的蒸餾時(shí)間控制、飲品風(fēng)味設(shè)計(jì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花干燥花蕾 亳州市大西北藥業(yè)有限責(zé)任公司;C7～C30飽和正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純,美國(guó)Supelco公司;環(huán)己酮 純度>99.0%,TCI公司。

7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;手動(dòng)進(jìn)樣器及萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS) 美國(guó)Supelco公司;DC-NSG-20多功能提取濃縮機(jī)組 上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 稱取干燥的金銀花625 g分裝于5個(gè)紗布袋,加20 L反滲透純化水,在多功能提取濃縮機(jī)組中減壓蒸餾(-0.09 MPa),觀察蒸餾液收集罐的液位,液位升至2 L刻度時(shí)排空第1段蒸餾液存于樣品瓶,繼續(xù)收集蒸餾液,待液位升至2 L刻度時(shí)又排空儲(chǔ)存,直至收集第7段蒸餾液后,結(jié)束蒸餾。每份樣品取三個(gè)平行,測(cè)定結(jié)果取均值。

1.2.2 HS-SPME處理?xiàng)l件 取5 g金銀花蒸餾液樣品,置于15 mL固相微萃取專用樣品瓶中,加入內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮,密封,并將樣品瓶放入50 ℃水浴中平衡15 min,之后將萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)插入樣品瓶中,繼續(xù)于50 ℃水浴中頂空萃取40 min,萃取結(jié)束后進(jìn)樣,240 ℃解吸5 min。

1.2.3 GC-MS檢測(cè)條件 氣相色譜條件:DB-WAX石英毛細(xì)柱(30 m×250 μm,0.25 μm)色譜柱;進(jìn)樣口溫度:240 ℃;升溫程序:40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升至120 ℃,保持4 min,10 ℃/min升溫至200 ℃,保持4 min,20 ℃/min升至240 ℃,保持8 min;載氣氦氣(He)，流速1.0 mL/min,不分流。質(zhì)譜條件:電子電離(Electron ionization,EI)源;電子能量70 eV;傳輸線溫度240 ℃;離子源溫度230 ℃;四級(jí)桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍20.00～500.00 m/z。

1.2.4 定性和定量分析 定性分析:利用安捷倫質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)結(jié)合NIST 11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)對(duì)各化合物進(jìn)行檢索,并通過(guò)C7～C30飽和正構(gòu)烷烴作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算保留指數(shù),對(duì)照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,綜合定性。定量分析:采用內(nèi)標(biāo)法半定量,各樣品中揮發(fā)性化合物含量的計(jì)算公式如下:

揮發(fā)性化合物含量(μg/g)=(組分峰面積×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量)/(內(nèi)標(biāo)物峰面積×樣品質(zhì)量)

1.2.5 蒸出比例計(jì)算 以全部七個(gè)蒸餾段的揮發(fā)性成分含量總和為基數(shù),計(jì)算不同蒸餾段揮發(fā)性成分的本段蒸出比例和累計(jì)蒸出比例,具體計(jì)算公式如下:

式中,i=1～7代表蒸餾段數(shù),C代表各段蒸餾液揮發(fā)性成分的濃度,V代表各段蒸餾液的體積。

1.2.6 主體香氣分析 將某種揮發(fā)性化合物的濃度除以其閾值,便可以得到一個(gè)評(píng)價(jià)該化合物對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)的量值,即氣味活性值(Odor activity value,OAV),具體計(jì)算公式如下:

式中,c代表?yè)]發(fā)性化合物的濃度,cT代表該化合物在水中的閾值。一般來(lái)講,只有當(dāng)某種化合物的濃度大于其閾值,即OAV>1,才被認(rèn)為是主體香氣成分,0.1

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和Origin 2017處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪圖,采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分的GC-MS測(cè)定結(jié)果

圖1是金銀花露七個(gè)蒸餾段的總離子流色譜圖,可以看出揮發(fā)性成分出峰時(shí)間主要集中在15～20、25～30 min兩個(gè)時(shí)間段。通過(guò)檢索NIST 11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù),并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)對(duì)比,在金銀花露七個(gè)蒸餾段中共鑒定出62種化合物,主要是醇、醛、萜、酮、酯類等物質(zhì),采用內(nèi)標(biāo)法半定量計(jì)算出不同蒸餾段中各化合物的含量,結(jié)果如表1所示。其中數(shù)量較多的是醇類和醛類:鑒定出醇類化合物18種,其中飽和醇13種、不飽和醇5種,它們中含量較高的有2-庚醇、正己醇、葉醇、1-辛烯-3-醇、正辛醇、(Z)-3-壬烯-1-醇;鑒定出醛類化合物17種,其中不飽和醛11種,飽和醛6種,它們中含量較高的有(E)-2-丁烯醛、(E)-2-己烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯甲醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛。其次,鑒定出酯類化合物12種,包括正己酸甲酯、正己酸乙酯、乙酸正已酯等,但含量都不高。再次,鑒定出萜類8種、酮類7種,香葉醇、香茅醇、芳樟醇是含量較高的萜類化合物,β-紫羅蘭酮、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、香葉基丙酮是含量較高的酮類化合物。

表1 不同蒸餾段金銀花露中的揮發(fā)性成分及含量Table 1 Volatile components and contents in different distillation fractions of honeysuckle flower

續(xù)表

注:“-”表示未檢出。

圖1 不同蒸餾段金銀花露中揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

2.2 金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分的比較

醇、醛、萜、酮、酯類在金銀花露不同蒸餾段中的含量如圖2所示,可以看出各蒸餾段中醇類、醛類的含量均較高。由圖2還可知,隨著蒸餾進(jìn)行(即蒸餾段從第1～7段),金銀花露中所有揮發(fā)性化合物的總含量在不斷降低,由214.49 μg/g逐漸下降到12.21 μg/g,其中第1～2段、第2～3段、第3～4段的降幅較大,分別為75.95%、46.29%、33.70%;第4～5段、第5～6段、第6～7段的降幅較小,分別為13.12%、5.94%、18.67%。這說(shuō)明在蒸餾前期大部分揮發(fā)性成分已被蒸出,到蒸餾后期揮發(fā)性成分趨于少量而穩(wěn)定地蒸出。

表2 不同蒸餾段對(duì)應(yīng)的本段蒸出比例和累計(jì)蒸出比例Table 2 Current and cumulative evaporation ratio corresponding to different distillation fractions

圖2 不同蒸餾段金銀花露中各類揮發(fā)性成分的含量Fig.2 Content of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

金銀花露揮發(fā)性成分在不同蒸餾段對(duì)應(yīng)的本段蒸出比例和累計(jì)蒸出比例見表2。由表2可知,第1段蒸出的揮發(fā)性成分含量已占所有七個(gè)蒸餾段揮發(fā)性成分含量總和的60.37%,至第3段時(shí)累計(jì)蒸出比例則已達(dá)82.68%,再往后每增加一個(gè)蒸餾段,提升比例只有3%～6%。這意味著以揮發(fā)性物質(zhì)含量為考核指標(biāo)的話,后幾個(gè)蒸餾段的能耗較高。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中,可根據(jù)金銀花用量、蒸出揮發(fā)性物質(zhì)含量、能源成本等因素來(lái)綜合考慮最優(yōu)蒸餾時(shí)間。

除了含量不同,不同蒸餾段中各類揮發(fā)性成分的比例也有所不同,具體如圖3所示。由圖3可知,在金銀花露所有蒸餾段中,醇類和醛類都是占比較高的兩類化合物,它們含量之和占所有揮發(fā)性化合物總含量之和的比例為70%左右。隨著蒸餾進(jìn)行,不同蒸餾段中各類化合物的所占比例也在不斷變化,其中變化明顯的是醇類和醛類化合物。醇類化合物由第1段占比38.78%逐漸下降并穩(wěn)定在25%左右,而醛類化合物由第1段占比32.60%逐漸上升并穩(wěn)定在45%左右,說(shuō)明醇類較醛類更易蒸出,因?yàn)榱u基較醛基親水性更強(qiáng)。萜類和酮類由第1段占比11.94%和11.05%緩慢降低至第7段占比8.52%和7.46%,酯類則由第1段占比5.63%緩慢升高至第7段占比13.37%。

圖4 不同蒸餾段金銀花露的氣味活性輪廓Fig.4 OAV profile of different distillation fractions of honeysuckle flower

圖3 不同蒸餾段金銀花露中各類揮發(fā)性成分所占百分比Fig.3 Percentage of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

2.3 金銀花露不同蒸餾段的香氣分析

不同蒸餾段金銀花露的香氣強(qiáng)度與風(fēng)格有所不同,這與它們所含揮發(fā)性化合物的OAV值有關(guān)。一般而言,OAV值越大,該化合物對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)的程度越大。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[25],共查得40種揮發(fā)性成分在水中的閾值,結(jié)合表1種這些成分在不同蒸餾段的含量,便可計(jì)算出它們的OAV值,并得到金銀花露不同蒸餾段的大致氣味活性輪廓圖,如圖4所示(根據(jù)第1段化合物OAV值從大到小,在Y軸從上到下排列化合物名稱)。

整體來(lái)看,β-紫羅蘭酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛在所有蒸餾段中的OAV值都大于100,說(shuō)明這4種成分對(duì)金銀花露整體香氣有明顯的影響。β-紫羅蘭酮呈甜的花香、木香氣味,香氣柔和淳厚[26],常用于配制如紫羅蘭、桂花、蘭花等花香型香精。(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛都有一定的油脂香氣,前者還帶有花果香[27]。(E)-2-壬烯醛有類似紙板的氣味,常在老化后的啤酒中測(cè)出[28]。

其次,1-辛烯-3-醇、香葉醇、香茅醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛、香葉基丙酮、正己醛、苯乙醛、正辛醇基本在所有蒸餾段中的OAV值都大于10,說(shuō)明這9種成分對(duì)金銀花露整體香氣也有很顯著的影響。1-辛烯-3-醇,也叫蘑菇醇,有一定的蘑菇和泥土氣味[26]。香葉醇主要呈甜的玫瑰花香氣[29-30]。香茅醇有類似新鮮玫瑰的特殊香氣[31]。芳樟醇是全世界用量靠前的香料之一,具有甜的花香、木香氣息,香氣柔和[26,31]。(E)-2-己烯醛,也叫葉醛,呈新鮮的青草香氣[31-32]。香葉基丙酮主要呈新鮮花香香氣,帶有一點(diǎn)甜的玫瑰花香氣[30-31]。正己醛呈青草香、油脂香[26,31]。苯乙醛具有濃厚的花香[26,31]。正辛醇帶有柑橘樣氣息,還有甜脂香味[33]。

再次,葉醇、(E)-檸檬醛、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、正壬醇、正癸醛、正壬醛、(E)-2-丁烯醛、正庚醛、甲基庚烯酮基本在所有蒸餾段中的OAV值都大于1,說(shuō)明這10種成分對(duì)金銀花露整體香氣也會(huì)有一定的影響。葉醇呈新鮮草香、青香[26,31]。(E)-檸檬醛、正壬醇、正癸醛、正壬醛、正庚醛、甲基庚烯酮都具有一定的類似檸檬香、柑橘香的氣味,前四者還帶有油脂氣味[26,31,33]。乙酸苯乙酯呈甜的玫瑰花香氣息,還帶有類似桃子的果香[26]。正己酸乙酯具有新鮮的甜香和水果香氣味[26,33]。(E)-2-丁烯醛有特殊刺激性氣味[34]。

綜上,花香、青草香、油脂香、果香是金銀花露的主體香氣,(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、(E)-2-丁烯醛等化合物對(duì)其氣味進(jìn)一步構(gòu)成特殊影響,最后共同構(gòu)成了金銀花露的獨(dú)特氣味。

由圖4還可以看出,第1段的氣味輪廓與其他蒸餾段明顯不同,具體而言,第1段中OAV>1的化合物有34種,而其他段中OAV>1的化合物在21～25種之間。其他蒸餾段之間對(duì)比則既有類似又有不同,如第4～7段的輪廓較為相似,第2、3段與它們有所不同。

圖5 不同蒸餾段金銀花露氣味活性值的聚類分析Fig.5 Clustering analysis of different distillation fractions of honeysuckle flower based on OAVs

為了更清晰、更客觀地區(qū)分不同蒸餾段氣味輪廓的區(qū)別,以平方歐氏距離為度量準(zhǔn)則,采用組內(nèi)連接距離方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,金銀花露第4、5、6、7蒸餾段在距離1.0可以聚為一類,結(jié)合圖4來(lái)看,它們的OAV輪廓也極度相似,僅有細(xì)微差別,這也進(jìn)一步說(shuō)明了在蒸餾后期香氣化合物趨于穩(wěn)定蒸出。第3蒸餾段單獨(dú)為一類,與第4～7蒸餾段稍有區(qū)別(相距1.0),結(jié)合圖4來(lái)看區(qū)別主要源自1-辛烯-3-醇、香葉醇、(E)-2-己烯醛的OAV差別。第2蒸餾段單獨(dú)為一類,與第3蒸餾段又稍有區(qū)別(相距1.0),結(jié)合圖4來(lái)看區(qū)別主要源自苯乙醛、葉醛、(E)-檸檬醛、正癸醛、正壬醛的OAV差別。此外,第2、3蒸餾段中的1-辛烯-3-醇、(E)-2-己烯醛氣味活性較高,使得這兩個(gè)蒸餾段有一定的青草、泥土氣息。第1蒸餾段則與其他所有蒸餾段區(qū)別明顯,單獨(dú)為一類,結(jié)合圖4來(lái)看,該區(qū)別源自于第1蒸餾段中香茅醇、芳樟醇、香葉基丙酮、正己醛、正辛醇、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、正壬醇等化合物的OAV值較其他段蒸餾液均高出了一個(gè)量級(jí),使得第1段蒸餾液的花香、果香風(fēng)格尤為突出。綜上,在實(shí)際生產(chǎn)中,可分段或合并相似段來(lái)獲取不同呈香風(fēng)格的蒸餾液。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),內(nèi)標(biāo)法半定量分析了金銀花露七個(gè)不同蒸餾段揮發(fā)性成分的差異。不同于金銀花揮發(fā)油主要成分為烴類、酯類、酸類[11-16],金銀花露所含揮發(fā)性成分種類主要是醇類、醛類、萜類、酮類、酯類這五種物質(zhì)。金銀花露第1蒸餾段揮發(fā)性成分的含量(214.49 μg/g)遠(yuǎn)高于其他蒸餾段(51.58～12.21 μg/g),說(shuō)明金銀花中的大部分揮發(fā)性成分能較快地被蒸發(fā)出來(lái)。氣味活性值分析表明花香、青草香、油脂香、果香是金銀花露的主體香氣,主要由β-紫羅蘭酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、香葉醇、香茅醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛、香葉基丙酮、正己醛、苯乙醛、正辛醇貢獻(xiàn)(OAV>10)。不同蒸餾段的氣味活性輪廓有所不同,第1段與其它段區(qū)別最為明顯,其花香、果香風(fēng)格尤為突出。綜上,本課題的研究在促進(jìn)金銀花露節(jié)能生產(chǎn)、建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、設(shè)計(jì)飲品風(fēng)味等方面有一定的參考價(jià)值,生產(chǎn)廠家可根據(jù)金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分含量、比例、氣味活性輪廓的差異,并結(jié)合原料成本、能源成本等因素來(lái)確定最優(yōu)蒸餾工藝。