大豆7S球蛋白的MTGase條件對其表面疏水性與功能特性、溶液性質的影響及相關性分析

范麗麗,竇博鑫,張曉琳,徐晨冉,蘆志鳳,劉 穎

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

大豆貯藏蛋白占大豆籽粒的40%～45%,含有人體不能合成的8種氨基酸,其營養價值較高,被稱為“植物肉”[1-4]。大豆7S球蛋白(β-伴球蛋白)是大豆蛋白的主要貯藏蛋白,分子量為180～200 kDa的糖蛋白[5],由α、α′和β亞基通過疏水鍵和氫鍵結合形成三聚體[6]。

近年來許多研究已經表明,通過酶的改性可以改善大豆蛋白的功能特性,如乳化性、起泡性等[7],Ikura等報道了豚鼠來源的TGase催化11S大豆球蛋白和7S球蛋白聚合,結果顯示TGase催化7S聚合的速率要明顯優于11S,同時指出TGase催化酸性亞基和堿性亞基的速度不同,只有酸性亞基能被TGase聚合[8];Tang等利用MTGase交聯改性富含7S球蛋白的大豆分離蛋白(SPI),結果顯示7S球蛋白含量高的SPI凝膠結構主要通過依靠疏水鍵和氫鍵維持,改性后凝膠透明度有所提高[9],但是通過酶改性對蛋白結構和功能特性相關性的研究很少有報道。探討MTGase交聯改性大豆7S球蛋白的乳化性、溶液性質和結構對大豆7S球蛋白表面疏水性的關系影響很大。

本研究以大豆7S球蛋白為研究對象,以微生物轉谷氨酰胺酶(MTG)酶添加量、pH、溫度為單因素交聯處理大豆7S球蛋白,分別測定其表面疏水性、乳化性、乳化穩定性、流體動力學粒徑、Z-電位,并對蛋白質表面疏水性與乳化性、乳化穩定性、流體動力學粒徑、Z-電位進行相關性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂大豆粕 山東禹王有限公司;MTGase(活性130 U/g) 江蘇瑞欣食品生物科技有限公司;1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS) Sigma公司進口;K2HPO4、KH2PO4、NaCl 優級純;其余試劑 均為分析純。

F-7000FL220-240V熒光光譜儀 Watter公司;Alpha1-2冷凍干燥機 錫山市林洲干燥機廠;TG16-WS高速離心機 上海市盧湘儀離心機儀器有限公司;722S型分光光度計 上海市精密科學儀器有限公司;恒溫加熱磁力攪拌器 北京市科偉永興儀器有限公司;Malvern激光粒度儀 上海市思百吉儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆7S球蛋白的制備 參照劉春等[10]的方法制備大豆7S球蛋白。

1.2.2 MTGase交聯處理大豆7S球蛋白

1.2.2.1 MTGase添加量對大豆7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響 將制得的7S球蛋白,溶于0.01 mol/L、pH7.0的PBS緩沖液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,調pH至7.0,然后分別加入10、20、30、40、50 U/g MTGase,聚合物在55 ℃下反應2 h后,80 ℃水浴5 min,滅酶,測定MTGase添加量對蛋白質表面疏水性、乳化性、乳化穩定性、平均粒徑和Zeta電位的影響[11-13]。

1.2.2.2 pH對大豆7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響 將制得的7S球蛋白溶于0.01 mol/L、pH7.0PBS緩沖液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,分別調pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,分別加入20 U/g MTGase,聚合物在55 ℃下反應2 h后,80 ℃水浴5 min,滅酶,測定不同pH對蛋白質表面疏水性、乳化性、乳化穩定性、平均粒徑和Zeta電位的影響。

1.2.2.3 溫度對大豆7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響 將制得的7S球蛋白,溶于0.01 mol/L、pH7.0 PBS緩沖液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,調pH至7.0,加入20 U/g MTGase,聚合物分別在40、45、50、55、60 ℃下反應2 h后,80 ℃水浴5 min,滅酶,測定不同溫度對蛋白質表面疏水性、乳化性、乳化穩定性、平均粒徑和Zeta電位的影響。

1.2.3 指標測定方法

1.2.3.1 表面疏水性的測定 采用ANS熒光探針法[14]測定蛋白質的疏水性。將MTGase交聯處理大豆7S球蛋白樣品溶于0.01 mol/L、pH7.0的PBS緩沖液中,制成0.005%、0.01%、0.02%、0.1%、0.2%(W/V)的溶液。取樣品液4 mL,加入50 μL 8 mmol/L ANS,充分振蕩后,室溫下靜置3 min。熒光發射光譜測試條件:采用290 nm為激發光波長,掃描范圍300～400 nm,激發狹縫寬5 nm,發射狹縫5 nm測定熒光強度。以蛋白質質量濃度為橫坐標,熒光強度為縱坐標制作曲線,曲線初始階段的斜率即為蛋白質的表面疏水性指數(S0)。

1.2.3.2 乳化性和乳化穩定性的測定 配制1%(W/V)的MTGase交聯處理大豆7S球蛋白溶液,取15 mL樣品溶液與5 mL大豆油置于燒杯中混合,在高速剪切均質機下10000 r/min乳化2 min,形成均一的乳化液。室溫下,分別于靜置后的第0和第30 min取20 μL的乳狀液與5 mL 0.1%SDS溶液均勻混合，取樣點固定在離燒杯底部0.5 cm處,在500 nm波長處測定其吸光值,分別記為A0和A30,用0.1%的SDS做空白對照[15-16]。

計算公式如下:

式中:T-2.303;N-稀釋倍數,250;C-乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質質量濃度,g/mL;φ-乳化液中油的體積分數,0.25。

式中:A0-所得樣品后直接測吸光值;A30-放置30 min后重新吸取所測的吸光值。

1.2.3.3 粒徑分布的測定 根據李楊等[17]的方法,采用馬爾文激光粒度分析儀測定MTGase交聯處理大豆7S球蛋白的流體動力學粒徑及其分布。將蛋白質樣品用pH7.0的磷酸鹽緩沖液配制成0.1%的蛋白溶液,過0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜,室溫下進行測定,取3次測定的平均值。

1.2.3.4 Zeta電位的測定 根據Crudden等[18]的測定方法,采用馬爾文電位儀測定MTGase交聯處理大豆7S球蛋白溶液的Zeta電位。將7S球蛋白樣品用緩沖液稀釋至質量分數為0.2%,上樣體積為1 mL,測定溫度為25 ℃,溫度平衡時間為2 min。

1.2.4 MTGase交聯處理7S球蛋白相關性分析 將經MTGase交聯處理的大豆7S球蛋白分別測定蛋白質表面疏水性、乳化性、乳化穩定性、平均粒徑和Zeta電位后,對MTGase交聯處理的大豆7S球蛋白蛋白質表面疏水性與乳化性、乳化穩定性、平均粒徑、Zeta電位進行相關性分析。

1.3 數據處理

實驗數據的統計分析包括單因素方差分析和相關性分析,均采用SPSS 17.0軟件,方差分析差異性顯著(P<0.05)時采用Duncan方法進行多重比較。圖譜的分析處理和圖表的制作采用Origin 8.5軟件進行。

圖1 不同MTGase酶添加量對7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響Fig.1 Effect of different MTGase enzyme additions on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.對表面疏水性的影響;b.對乳化性和乳化穩定性的影響;c.對平均粒徑的影響;d.對Zeat電位的影響。

2 結果與分析

2.1 MTGase交聯處理對7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響

2.1.1 MTGase酶添加量對7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響 蛋白質的表面疏水性是由于蛋白質中許多氨基酸殘基側鏈趨向于聚集,暴露于蛋白質表面引起的,是兩個不溶于水的分子間的相互作用,是衡量蛋白質功能性質的關鍵指標之一,即蛋白質的表面疏水性與蛋白質的功能、結構特性等密切相關[19-20];從圖1a可以看出,隨著加酶量不斷增大,蛋白質表面疏水性不斷增加,加酶量為20 U/g時疏水性增加到最大值,繼續增大加酶量蛋白質表面疏水性降低,分析原因是MTGase催化7S球蛋白的活性明顯增強,使埋藏于蛋白質分子內部的MTGase的有效作用位點暴露于MTGase,從而使蛋白質聚合速率增加,聚合物分子量不斷增長,在20 U/g時聚合物達到最大,當聚合物分子量到一定值時可能會產生一定的空間位阻,降低MTGase對蛋白的三級結構影響,酶量繼續增加,蛋白質不再聚合,蛋白質表面疏水性趨于穩定。這與姜巍巍[13]不同加酶量對不同大豆蛋白表面疏水性的影響分析結果一致。

大豆蛋白作為乳化劑被廣泛應用于食品工業中,乳化性是大豆蛋白最重要的特性之一[21]。如圖1b所示,隨著加酶量不斷增大,蛋白質乳化性不斷增大,加酶量為20 U/g時乳化性增加到最大值,繼續增大加酶量蛋白質乳化性降低,乳化穩定性降低。分析原因是7S球蛋白乳化性受蛋白質表面疏水性的影響,MTGase催化7S球蛋白的活性明顯增強[22-23],使蛋白質表面疏水性增強,提升蛋白質對油脂的吸附速率,從而改善蛋白質乳化性[24],在酶添加量為20 U/g時乳化性達到最大,當酶添加量繼續增大,MTGase酶聚合蛋白質能力達到飽和,產生一定的空間位阻,降低MTGase對蛋白的聚合速率,導致蛋白表面疏水性趨于穩定,乳化性不再改變。

在蛋白質聚集過程中,蛋白質的平均粒徑不僅可以表征蛋白質的聚集程度,同時也能夠反映出蛋白質空間構象的改變[25]。由圖1c可以看出,7S球蛋白的平均粒徑隨MTGase酶添加量的增加,呈先增大后減小的趨勢,由于酶的交聯作用破壞了維持蛋白質的主要作用力如疏水作用、靜電作用等,從而增加了蛋白質碰撞幾率,使蛋白質分子聚集現象增加,聚集物增大,表現為蛋白質分子平均粒徑的增大,在酶添加量為20 U/g時達到最大,酶作用趨于飽和,繼續添加MTGase酶,產生空間位阻,蛋白質不再繼續聚集,導致蛋白質平均粒徑趨于穩定[26-27]。

圖2 不同交聯pH對7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響Fig.2 Effect of different pH on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.對表面疏水性的影響;b.對乳化性和乳化穩定性的影響;c.對平均粒徑的影響;d.對Zeat電位的影響。

Zeta電位是蛋白質溶液中粒子表面和分散溶液之間的電勢,通過蛋白質顆粒之間相互排斥或吸引[28]。由圖1d可以看出,7S球蛋白Zeta電位絕對值均大于20 mV,說明其體系整體趨于穩定,而隨MTGase酶添加量增加,電位絕對值先下降后增加,由于酶添加量增大加快蛋白質聚集速率,溶液變得不穩定,加快蛋白質疏水基團內卷,分子間靜電斥力小于分子間引力,蛋白質Zeta電位值降低,隨后由于酶催化活性降低,蛋白聚集作用降低,蛋白質之間靜電斥力增大,體系趨于穩定,Zeta電位絕對值增大。

2.1.2 交聯pH對7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響 預實驗可知7S球蛋白的表面疏水性為1024,由圖2a可以看出,隨著pH不斷增大,蛋白質表面疏水性呈現先下降后增大的趨勢,當pH為5時表面疏水性降到最低,隨后pH增大表面疏水性開始明顯增加。可能是因為蛋白質是兩性電解質,7S球蛋白的等電點為4.8,此時蛋白質在電場中不遷移,其分子正負電荷相等,凈電荷為零,溶液中的蛋白質顆粒因不存在同種電荷的相互排斥[28],分子易凝聚而產生沉淀,從而影響MTGase酶對7S球蛋白的催化作用,酶損失嚴重,當pH大于小于5時MTGase酶對7S球蛋白催化作用增強,蛋白質表面疏水性增強。

預實驗可知7S球蛋白的乳化性為23.99 m2/g,大豆7S球蛋白在堿性環境中的乳化性和乳化穩定性明顯優于酸性環境,并且在pH為5時乳化性最低[29],這是因為7S球蛋白的等電點為4.8,而溶液的pH接近蛋白質的等電點時,溶解性降低,乳化性降到最低,此時乳化性值為20.33 m2/g,且唐傳核[11]曾報道過MTGase在pH5.0～7.0范圍內是相當穩定的,pH小于4.0或pH9.0時該酶不穩定,酶活損失嚴重,微酸狀態更有利于該酶的催化活性,因此7S球蛋白的乳化性在pH大于或小于這一區域,乳化性開始增加[30-31],在pH6.0～7.0時趨于穩定。

預實驗可知7S球蛋白的平均粒徑為78.55 nm,由圖2c可知隨著pH不斷增大,蛋白質平均粒徑呈現先增大后下降的趨勢,當pH為5時蛋白質平均粒徑增加到最大,由于7S球蛋白的等電點為4.8,此時蛋白質顆粒在溶液中因沒有靜電排斥作用,蛋白質溶解度最低,分子容易凝聚而產生沉淀,使蛋白質分子平均粒徑增大,大于或小于等電點時平均粒徑減小,這與嚴江殷[32]pH對7S球蛋白粒度影響的結果相一致。

7S球蛋白的Zeta電位在pH3.0～7.0時,隨pH增大先降低后增大,在pH為5.0時最低,分析是pH為5時比較接近7S球蛋白的等電點,蛋白質溶解度最低,此時蛋白易絮凝,蛋白質分子間作用力減弱,靜電斥力減弱,從而使蛋白質Zeta電位降低,大于或小于此區域時Zeta電位值增大[32]。

2.1.3 交聯溫度對7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響 由圖3可以看出,交聯溫度在45～55 ℃,蛋白質表面疏水性比較大,溫度為55 ℃時疏水性增加到最大值,45、50、55 ℃時表面疏水性分別為1256.4、1260.7、1268.7,溫度繼續升高蛋白質表面疏水性降低,分析原因是因為溫度的增加有利于大豆7S球蛋白結構伸展,同時溫度增加會使MTGase催化交聯作用增強,蛋白表面疏水性增強,但當溫度繼續升高時,MTGase發生熱變性,使大豆7S球蛋白表面疏水性降低,這與姜巍巍[13]不同溫度對大豆蛋白表面疏水性影響的結果相似。

圖3 不同溫度對7S球蛋白功能特性及溶液性質的影響Fig.3 Effect of different temperature on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.對表面疏水性的影響;b.對乳化性和乳化穩定性的影響;c.對平均粒徑的影響;d.對Zeat電位的影響。

表1 表面疏水性對乳化性、乳化穩定性、平均粒徑、Zeta電位的相關分析Table 1 Correlation analysis of surface hydrophobicity to emulsifying,emulsion stability,average particle size and zeta potential

注:*表示在0.01水平(雙側)上顯著相關。隨著交聯溫度不斷增大,蛋白質乳化性不斷增加,溫度為55 ℃時乳化性增加到最大值,為31.29 m2/g,溫度繼續升高蛋白質乳化性降低,分析原因是因為溫度的增加有利于大豆7S球蛋白結構伸展,同時MTGase在50～55 ℃時相對酶活呈直線增加[5,12],使MTGase催化交聯作用增強,蛋白表面疏水性增強,從而改善蛋白質乳化性,但當溫度繼續升高時,MTGase發生熱變性,使大豆7S球蛋白表面疏水性降低,也降低了其乳化性。

隨著交聯溫度不斷增大,蛋白質平均粒徑不斷增加,溫度為55 ℃時平均粒徑增加到最大值,為99.03 nm,溫度繼續升高蛋白質平均粒徑降低,分析原因是熱處理破壞了維持蛋白質結構的作用力,使大豆7S球蛋白結構伸展,同時溫度增加有利于MTGase酶催化活性,蛋白質平均粒徑增大,當溫度繼續升高時,MTGase發生熱變性,在此溫度下7S球蛋白分子聚集作用降低,使其平均粒徑減小[28]。

隨著交聯溫度不斷增大,破壞了維持蛋白質結構的作用力,有利于大豆7S球蛋白結構伸展,蛋白質表面疏水性不斷增加,蛋白質平均粒徑不斷增加,蛋白質分子間作用力減弱,靜電斥力減弱[28],同時溫度增加會使MTGase催化交聯作用增強,增大蛋白質表面疏水性,同樣會降低蛋白質之間的靜電作用,導致蛋白電位降低,但當溫度繼續升高時,MTGase發生熱變性,在此溫度下7S球蛋白分子聚集作用降低,使其平均粒徑減小,蛋白質之間靜電斥力增強,Zeta電位增大,這與本實驗中平均粒徑的分析結果一致。

2.2 7S球蛋白表面疏水性與功能特性及溶液性質的相關分析

通過表1可知,蛋白質表面疏水性與乳化性、平均粒徑、Zeta電位之間存在一定的相關性,這與劉春雷等[33]的實驗結果分析相一致。相關性表明:蛋白質表面疏水性與乳化性存在正相關性,相關系數為0.718(P=0.003);而表面疏水性與乳化穩定性之間相關性不明顯,相關系數為0.304(P=0.270)。分析蛋白質表面疏水性與乳化性的相關性,可能因為7S球蛋白具有豐富的疏水氨基酸含量,在其表面存在大量的疏水區,所以它能很快地吸附在油滴的表面,使7S球蛋白乳化性增加,而蛋白質表面疏水性和乳化穩定性沒有相關性[34-35]。

相關性表明:蛋白質表面疏水性與平均粒徑存在正相關性,相關系數為0.860(P=0.005)。分析蛋白質表面疏水性與平均粒徑的相關性,可能因為蛋白表面疏水性越大,蛋白質分子之間的吸引力作用越大,蛋白質相互聚集程度越大,平均粒徑越大,相反蛋白質表面疏水性減小,蛋白質平均粒徑減小。

相關性表明:蛋白質表面疏水性與Zeta電位存在顯著負相關,相關系數為-0.727(P=0.02)。當Zeta電位絕對值較低時,溶液中蛋白質分子表面電荷較少,蛋白質分子間靜電斥力減弱,溶液中蛋白質顆粒傾向聚集,使蛋白質表面疏水性增大,相反蛋白質溶液Zeta電位絕對值較大時,蛋白質表面電荷增加,蛋白質分子間靜電斥力增強,蛋白質表面疏水性增強[36]。

3 結論與展望

MTGase交聯處理(酶添加量、pH、溫度)大豆7S球蛋白,結果表明:酶添加量為20 U/g,pH7.0,溫度55 ℃時,對其表面疏水性、乳化性、乳化穩定性和平均粒徑影響較大,表面疏水性值為1268.7,乳化性值為31.29 m2/g,乳化穩定性值為225.05 min,平均粒徑99.03 nm;通過相關性分析,大豆7S球蛋白的表面疏水性與乳化性成正相關,相關系數為0.718(P=0.003);而表面疏水性與乳化穩定性之間相關性不明顯,相關系數為0.304(P=0.270);蛋白質表面疏水性與平均粒徑存在正相關性,相關系數為0.860(P=0.005);與Zeta電位成負相關,相關系數分別為-0.727(P=0.02)。

(MTGase酶)改性技術是決定食品的色、香、味以及質構的一種重要手段。表面疏水性顯著影響大豆蛋白質的功能特性及溶液性質,明確大豆蛋白質功能特性及溶液性質與表面疏水性的相關性,對今后開發特定功能性產品并進行分子設計和重組有重要意義。