分級醇沉發酵麩皮多糖的成分分析與抗氧化活性研究

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(1.內蒙古農業大學動物科學學院,內蒙古呼和浩特 010018;2.內蒙古自治區草食家畜飼料工程技術研究中心,內蒙古呼和浩特 010018)

小麥是我國主要的糧食作物之一,而小麥麩皮是小麥制粉的主要副產物,麥麩中富含纖維素和半纖維素及各種營養物質,且價格低廉,是已知的自然界中最好的膳食纖維來源[1]。同時小麥麩皮含有纖維素多糖以及由木聚糖、葡甘露聚糖、半乳聚糖、木聚糖等組成的非纖維素多糖[2],具有良好的生物活性,包括免疫調節活性[3-4]、抗氧化活性[5-6]和益生作用[7]等,它還具有降血脂、降血糖、潤腸通便等功效,此類多糖稱為麩皮活性多糖,簡稱麩皮多糖[8]。麩皮多糖作為一種植物多糖,結構復雜,是由超過20個單糖單位組成的多聚物[9],且易與小分子物質(多酚、維生素、礦物質等)、蛋白質等結合,不易分離純化,因此會與多酚和蛋白發生相互作用,形成共價復合物,比單獨化合物的活性更強[10]。

發酵麩皮多糖分離純化常采用纖維素柱層析[11]和透析[12]、水提醇沉等方法,前兩種方法限于成本和得率,難以用于大規模生產。水提醇沉是天然多糖類最為常用的提取純化方法[13],是通過將原料熱水浸提后逐步提高乙醇的體積濃度以達到初步純化多糖的目的,相比其它的純化方法,它的優勢在于成本低、耗時短,同時又能維持較高得率,且針對不同乙醇濃度沉淀下來的多糖有不同的生物活性及應用價值。因此,本研究采用乙醇分級沉淀法分離出不同的發酵麩皮多糖,測定了其得率、純度、多酚、蛋白含量等,分析了其單糖組成,比較了各醇沉組分間的組成差異,并初步探討了各組分之間體外抗氧化活性不同的原因,為發酵麩皮多糖的開發利用提供可靠的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥麩皮、豆粕粉、玉米粉 內蒙古大公面粉廠;枯草芽孢桿菌CGMCC 1.892(BacillussubtilisCGMCC 1.892)、釀酒酵母CGMCC 2.119(SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2.119) 均購買于中國微生物菌種保藏中心;無水乙醇、濃硫酸、苯酚、福林酚、三氯甲烷等 天津市匯杭化工科技有限公司;硫酸亞鐵、水楊酸乙醇、六氰合鐵酸鉀、無水碳酸鈉、三氯化鐵等 分析純，天津風船化學試劑科技有限公司；中性蛋白酶、BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;DPPH(二苯基-2-三硝基苯肼)、D-無水葡萄糖、丁基羥基茴香醚(BHA) 美國Sigma。

LGJ-18型真空冷凍干燥機 上海豫康儀器有限公司;RE-52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;TG16-WS型臺式高速離心機 湖南湘儀儀器開發有限公司;Epoch2型微孔板分光光度計 美國伯騰儀器有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海醫療器械有限公司;UV-2450紫外分光光度計 日本Shimadzu。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵麩皮多糖分級醇沉樣品制備 參照史俊祥[14]的方法制備發酵麩皮多糖。以小麥麩皮為原料,以豆粕粉、玉米粉為輔料,添加比例為80.46∶9.32∶10.22,料水比1∶1.16;使用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌混菌發酵,比例為6.7∶3.3;接種量為10.4%,添加0.1%尿素,35.4 ℃下發酵52.7 h,發酵結束后,將發酵底物在45 ℃烘48 h,粉碎。與蒸餾水1∶16混合后90 ℃水浴提取30 min,離心(5000 r/min,15 min),后收集上清液,烘干得發酵麩皮多糖。

酶法結合Sevage法脫蛋白[15]。配制一定濃度的發酵麩皮多糖溶液,加入0.2%中性蛋白酶,40 ℃下酶解1.5 h,沸水浴10 min滅酶,冷卻后離心(5000 r/min,15 min),取上清液與Sevage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)3∶1混合,使用磁力攪拌器充分振蕩30 min,離心(5000 r/min,15 min),再取上清液再按3∶1與Sevage試劑混合,離心,此去蛋白步驟重復兩次。取最終上清液旋轉蒸發濃縮,凍干機凍干,得脫蛋白后麩皮多糖。

分級醇沉樣品制備:將脫蛋白后麩皮多糖配制成質量分數為10%的多糖溶液,加入無水乙醇,使乙醇占總體積分數的50%,于4 ℃下靜置12 h,5000 r/min下離心15 min,收集沉淀,冷凍干燥得到多糖樣品WPBS-50。上清液按照體積繼續加入無水乙醇,使乙醇體積分數達到60%,于4 ℃下靜置12 h,5000 r/min下離心15 min,收集沉淀,冷凍干燥得到多糖樣品WPBS-60。同樣的方法得到70%、80%乙醇沉淀的多糖樣品WPBS-70、WPBS-80。

1.2.2 多糖含量測定及純度計算 測定采用苯酚-硫酸法[16]。精確稱取葡萄糖標準品20 mg,用蒸餾水定容至500 mL配制標準液。分別吸取標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL于試管中,補水至2 mL,加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃硫酸,室溫下反應20 min,并于490 nm處測吸光度,根據標準曲線計算多糖含量,標準曲線回歸方程為y=0.3099x-0.0091,y代表糖的濃度(mg/mL),x代表吸光度值,決定系數R2=0.9989。取1 g各樣品定容至16 mL配制成樣品溶液,稀釋80倍,取1.0 mL稀釋液補水至總體積為2 mL,按上述步驟操作加入苯酚和濃硫酸,490 nm處測吸光度,并進行純度計算。

多糖純度計算公式如下:

多糖純度(%)=(稀釋液濃度(mg/mL)×樣品體積(mL)×稀釋倍數)/多糖樣品質量(mg)×100

1.2.3 多酚含量測定 采用福林酚法[17]。各稱取1 g多糖樣品,加16 mL蒸餾水搖勻,90 ℃水浴1 h,取出后稀釋10倍,吸取1 mL稀釋液,加入5 mL 10%福林酚,反應3～8 min,后加入4 mL 7.5%碳酸鈉,搖勻后室溫放置1 h,765 nm下測其吸光值。

1.2.4 蛋白含量的測定 采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定醇沉樣品中殘留的蛋白含量。

1.2.5 單糖組成分析 取4種多糖樣品2 mg,加入1 mL的2 mol/L三氟乙酸水解90 min,旋轉蒸發儀蒸干,加入2 mL甲醇,蒸干,反復2次。殘基加入2 mL雙蒸水,60 mg硼氫化鈉還原8 h,加入冰醋酸中和,旋蒸,加入甲醇3 mL,反復3次,旋蒸至粉末,于110 ℃烘箱烘干,然后加入1 mL乙酸酐乙酰化100 ℃反應1 h,冷卻,然后加入3 mL甲苯,減壓濃縮蒸干,重復4～5次,以除去多余的醋酐。將乙酰化后的產物用3 mL氯仿溶解后轉移至分液漏斗,加入少量蒸餾水充分振蕩后,除去上層水溶液,如此重復4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥,定容至10 mL待GC-MS分析[13]。通過與標準品保留時間的比較確定色譜峰所屬的化合物種類,通過峰面積計算各種化合物含量,結果用mg/kg表示。

GC-MS條件:Rxi-5sil MS(RESTEK)色譜柱(30 m×0.25 mm×25 μm);程序升溫條件:起始溫度120 ℃,以3 ℃/min升溫至250 ℃/min;保持5 min;進樣口溫度為250 ℃,檢測器溫度為250 ℃/min;載氣為He,流速為1 mL/min。

表1 發酵麩皮多糖各醇沉組分組成含量及得率分析Table 1 Content and yield analysis of alcohol precipitation components of fermented bran polysaccharides

注:同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

1.2.6 紫外可見光譜分析(UV) 將4種多糖樣品各配成質量濃度0.1 mg·mL-1的多糖溶液,采用紫外可見分光光度計在200～400 nm處進行光譜掃描分析[20]。

1.2.7 體外抗氧化活性評價

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力 參照Zhang等[18-19]的方法并略做修改,將4種多糖樣品分別配制濃度為0、0.5、1、2、4 mg/mL的樣液,取2 mL不同濃度的樣液和2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L,95%乙醇溶液)混勻,室溫避光反應30 min,517 nm測定吸光度A0。取2 mL樣液,加2 mL95%的乙醇混勻室溫避光反應30 min,517 nm測定吸光度A1,取2 mL DPPH溶液,加2 mL蒸餾水,混勻室溫避光反應30 min,517 nm測定吸光度A2。以BHA標準品作為對照。計算公式為:

1.2.7.2 還原力能力測定 參照黃忠有等[20]的方法并略做修改。以BHA標準品作為對照,加入0.75 mL樣品液,0.75 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液,0.75 mL 1%六氰合鐵酸鉀50 ℃反應20 min。加入0.75 mL 10%三氯乙酸終止反應,3000 r/min離心10 min。取1.5 mL上清液加入1.5 mL水加400 μL 0.1% FeCl3室溫反應10 min,700 nm處測吸光度,吸光度越高,還原力越強。

1.3 數據統計

采用Origin 8.5、SPSS 21.0和SAS 9.2數據處理軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 化學組成分析

乙醇可以通過降低多糖水溶液的介電常數,減少多糖與水的作用,從而使多糖聚合沉淀,不同濃度的乙醇可沉淀出不同的多糖[21]。4種醇沉組分的化學組成及得率見表1。由表1可知,4種醇沉組分的得率由高到低的順序為WPBS-50>WPBS-70>WPBS-80>WPBS-60,且多糖純度均能達到70%以上。在乙醇濃度80%時,WPBS-80的純度最低,這是由于多糖在高濃度乙醇中幾乎都會沉淀出來,和其他小分子物質等分離開,而單糖在高濃度的乙醇中有一定的溶解性,所以隨著乙醇濃度增加,多糖純度降低[22]。4種醇沉組分中均含有蛋白和多酚成分,蛋白質殘留量和多酚含量的順序是WPBS-80>WPBS-70>WPBS-60>WPBS-50,且WPBS-80組分中蛋白含量高達18.43%,多酚含量達2.18%。文獻表明,多糖中軛合一定的蛋白質和多酚[23],為探究多糖中是何成分影響其生物活性,Wang等[24]對茶葉粗多糖提取物中的茶多酚進行了研究。Liu等[25]研究了蘑菇多糖提取物中的蛋白質。

2.2 單糖組成分析

由表2可知:各醇沉組分均含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖。WPBS-50葡萄糖和木糖含量較高,核糖含量最低;相比于其他醇沉組分，核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、巖藻糖在WPBS-60中含量最高,單糖的摩爾百分比為10.88%、12.39%、8.67%、10.77%、8.99%;葡萄糖在70%醇沉部位中大量分布,摩爾百分比達到51.34%,推斷葡萄糖是麥麩多糖中小分子量多糖和寡糖的重要組成成分;WPBS-80相對于其他組分,鼠李糖、阿拉伯糖、木糖含量最高。

表2 發酵麩皮多糖各醇沉組分的單糖組成(%)Table 2 The monosaccharide composition of alcohol precipitation components of fermented bran polysaccharides(%)

2.3 紫外可見光譜分析

圖1是4種麥麩多糖醇沉組分在200～400 nm的紫外掃描圖譜。由圖1可知,紫外掃描圖譜相似,均在280 nm處有蛋白質的特征吸收峰[13,26],且吸收峰的強弱順序為WPBS-80>WPBS-70>WPBS-60>WPBS-50,表明這4種多糖均含有一定量的蛋白質,蛋白質含量測定結果與2.1節中結果一致。在325 nm處較強的吸收峰為酚酸分子中苯環的特征吸收[27]。酚酸含量測定結果與2.1節中多酚結果一致。

圖1 4種發酵麩皮多糖醇沉組分的紫外掃描圖譜Fig.1 UV scanning spectra of alcohol precipitation components of 4 kinds of fermented bran polysaccharides

2.4 抗氧化能力分析

2.4.1 清除DPPH自由基的能力 各多糖醇沉組分清除DPPH自由基能力如圖2所示,4種多糖組分均具有一定的清除DPPH自由基的能力,且隨著乙醇體積分數的升高,清除DPPH自由基的能力逐漸增大后趨于穩定,各組分清除DPPH自由基能力強弱順序為:WPBS-80>WPBS-70>WPBS-60>WPBS-50。WPBS-50,WPBS-60,WPBS-70,WPBS-80的IC50值分別為(4.187±0.073)、(1.345±0.091)、(1.241±0.090)、(0.259±0.227) mg/mL。4種多糖組分中WPBS-80多糖純度最低,但多酚和蛋白含量最高,且其清除DPPH自由基的能力最強。許海棠等[28]在山豆根多糖組分的研究中發現,SGP90的多糖純度是幾個分級醇沉組分中最低的,但此組分的抗氧化能力最強,其原因是各級組分的抗氧化活性不僅僅與多糖純度有關,還可能與其他活性成分如多酚、蛋白等有關。與本試驗研究結果一致。

圖2 4種發酵麩皮多糖醇沉組分清除DPPH自由基能力Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of ethanol precipitation components of 4 kinds of fermented bran polysaccharides注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖3同。

2.4.2 還原力 生物體內存在游離金屬離子,如鐵離子,通過 Fe3+被抗氧化劑還原成 Fe2+來測定抗氧化劑的還原力,還原能力愈強,其抗氧化活性愈好[29]。本實驗對各個醇沉組分進行了總還原力的測定,如圖3,與清除 DPPH自由基相似,隨所測樣品濃度的增加,還原能力增強。WPBS-70的還原力略高于WPBS-80,與WPBS-60多糖組分相差不大,WPBS-50的還原力明顯低于其他組分。當多糖樣品濃度為4 mg/mL時WPBS-50、WPBS-60、WPBS-70、WPBS-80還原力的吸光值分別為0.24、0.58、0.67、0.61。有文獻顯示,單糖的糖苷鍵鏈接也影響著抗氧化活性,特別是側鏈的甘露糖與還原力呈顯著性相關[23]。本實驗中WPBS-70組分的還原力最高,可能是源于單糖組成中甘露糖相對于其他組分含量較高。

圖3 4種發酵麩皮多糖醇沉組分的還原力Fig.3 Reducing power of alcohol precipitation components of four fermented bran polysaccharides

2.5 發酵麩皮多糖醇沉組分多酚和蛋白含量與抗氧化性的線性關系

考察麩皮多糖有效成分對抗氧化性的影響,可通過SPSS軟件計算 Pearson相關系數進行說明,Pearson相關系數越接近1,說明該成分與對應的抗氧化活性相關性越高[30]。本研究中多酚和蛋白含量均隨乙醇體積增大而升高。從表3可以看出,多酚及蛋白含量與DPPH自由基清除活性表現出極顯著正相關(P<0.01),與還原力表現出顯著正相關(P<0.05)。Siu等[31]采用乙醇沉淀法從蘑菇中提取水溶性多糖,結果表明,各組分的抗氧化活性均與多酚和蛋白質含量顯著相關,多糖中主要是其多酚和蛋白在起抗氧化性作用。

表3 麩皮多糖醇沉組分多酚和蛋白含量與DPPH自由基清除率及還原力的Pearson相關系數Table 3 Pearson correlation coefficient of DPPH free radical scavenging rate and reducing power for the content of polyphenols and proteins in bran polysaccharide precipitated components

注:**在0.01水平(雙側)上顯著相關,*在0.05水平(雙側)上顯著。

3 結論

本試驗采用水提醇沉法對發酵麩皮多糖進行分級醇沉,設置50%、60%、70%和80%四個乙醇體積分數梯度,分級沉淀得到4種醇沉組分,分別為WPBS-50、WPBS-60、WPBS-70、WPBS-80。WPBS-50組分的多糖純度最高,達到79.95%;通過分析單糖組成發現,4種組分均含有葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖和阿拉伯糖等十種單糖。隨著乙醇體積分數增加,沉淀中的蛋白和多酚含量均隨之增加,WPBS-80最高,且表現出最強的DPPH自由基清除活性及較強的還原力。相關性結果表明,麩皮多酚及蛋白含量與其DPPH自由基清除活性及還原力活性之間呈正相關性,這從某種意義上說明了發酵小麥麩皮多糖分級醇沉中的多酚和蛋白的存在增強了抗氧化活性。不同醇沉產物的活性研究具有不同的意義,為今后麩皮多糖開發利用奠定了基礎。