蒸汽爆破預處理對山楂果渣組分及其酶解效果的影響

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(1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025;2.農業農村部規劃設計研究院農產品加工工程研究所,北京 100125;3.貴州理工學院,貴州貴陽 550003)

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge),薔薇科植物,具有藥食同源特性。據報道,山楂富含黃酮、多糖、多酚、有機酸、三萜、甾醇、胡蘿卜素和氨基酸等活性成分,具有降壓、增加冠脈流量、降血脂和抗動脈粥樣硬化等作用[1-2]。山楂果渣是山楂加工主要副產物之一,主要成分是纖維素,且富含黃酮、膳食纖維等活性成分。目前,山楂果渣開發利用方面的報道很少且單一,主要用作牲畜飼料,如陳玉河[3]將山楂果渣、蘋果渣、玉米稈青混合制成飼料,使得平均每頭牛比單喂玉米秸青貯飼料的增加產奶量1.3 kg/d,比喂干玉米秸飼料的增加產奶量2.2 kg/d,且牛奶的品質無明顯差異。全國每年有數以萬噸的山楂果渣被丟棄,不僅造成資源的浪費,而且引起環境的嚴重污染,給山楂加工企業帶來巨大的經濟壓力[4]。

目前,蒸汽爆破是預處理技術中應用比較廣泛的方法之一,在高溫、高壓條件下處理物料,使高溫飽和蒸汽迅速滲入到植物細胞中,并通過瞬間降壓,將熱能轉化為機械能,使植物組織的細胞破裂、結構破壞等,以便于后期的加工、處理,并且這種方法對環境污染小,是一種高效、綠色和低成本的預處理技術[5-6]。Sheng等[7]研究表明蒸汽爆破可明顯提高瘤胃微生物對玉米秸稈的降解率,且提高其作為牛飼料的營養價值。秸稈經蒸汽爆破后,纖維素和半纖維素降解率明顯升高,表面粘附更多的微生物,易快速形成致密的微生物生物膜[8]。Tu等[9]對沙棘果渣進行蒸汽爆破預處理,結果表明,蒸汽爆破后的沙棘果渣表面呈皺狀,卷曲狀和多孔狀;當蒸汽壓力為2.0 MPa,持續時間為88 s時,沙棘總黃酮含量達到最大為24.7 mg/g,較原物料增加了246%。王永淼等[10]對檸條蒸汽爆破發現2.3 kPa處理過的檸條糖化率達到了91.1%,纖維素糖化率提高5.2倍,很大程度上提高了檸條的利用率。但是,蒸汽爆破預處理技術在山楂果渣方面的應用鮮有報道。

本文采用不同蒸汽爆破條件對山楂果渣進行預處理,探究蒸汽爆破預處理對山楂果渣的組分、酶解效果及其微觀結構的影響。研究結果將為山楂果渣深加工提供理論依據,并有助于山楂果渣的開發利用,同時可為山楂副產品綜合利用及加工過程產生的環境污染等問題提供一條有效的解決途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂果渣 承德市灤平種植基地提供;蘆丁標準品 北京百靈威科技有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁 西隴化工股份有限公司;氫氧化鈉、濃硫酸 北京化工廠;無水乙醇、苯酚 國藥集團化學試劑有限公司;纖維素酶 滄州盛夏酶生物技術有限公司;所有試劑均為國產分析純。

QBS-80型蒸汽爆破機 鶴壁正道生物能源有限公司;GM-0.5隔膜真空泵 天津市津騰實驗設備有限公司;HWS-26型電熱恒溫水浴鍋 蘇州江東精密儀器有限公司;UV-1700紫外分光光度計 北京晨曦勇創科技有限公司;RE-52B旋轉蒸發儀 上海上自儀轉速表儀表機電有限公司;AR223CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司;JSM-7100F型場發射掃描電鏡 常州喬納機電科技有限公司;MD10 X射線衍射儀 上海紀革森實業有限公司;HZQ-C空氣浴振蕩器 東聯電子技術開發技術有限公司;LDZX-50KBS型立體式高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂果渣蒸汽爆破預處理 對裝入2/3蒸汽爆破機腔體的山楂果渣,分別選取壓力2.0、2.4 MPa,保壓時間30 s、1 min、2 min、4 min,進行蒸汽爆破預處理。收集爆破物料,60 ℃干燥,粉碎過80目篩,備用。

1.2.2 蒸汽爆破預處理條件下的山楂果渣纖維素、可溶性糖含量的測定

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的制作 分別精確吸取0.1 mg/mL葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于10 mL具塞試管中,以蒸餾水補至2.0 mL,依次加1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸,混勻,沸水浴反應10 min,冷卻至室溫,以零為對照,于波長490 mn處測定吸光度[11]。以吸光度為縱坐標,葡萄糖濃度為橫坐標,得到標準曲線方程為y=0.0082x+0.0283,,R2=0.9991。

1.2.2.2 山楂果渣纖維素、可溶性糖的含量測定與計算 山楂果渣可溶性糖提取液制備:稱取1.0 g不同蒸汽爆破預處條件下的山楂果渣粉末,分別置于50 mL試管中,加入10 mL蒸餾水,漩渦振蕩10 min,真空抽濾得到可溶性糖溶液,用蒸餾水定容至100 mL,備用。

山楂果渣全水解溶液制備:稱取1.0 g不同蒸汽爆破預處條件下的山楂果渣粉末,分別加入3.0 mL 72%濃硫酸,30 ℃水浴1 h,每間隔15 min振蕩一次,然后加入84 mL蒸餾水,121 ℃處理1 h,定容至100 mL,備用。此方法[12]可以將纖維素全水解為可溶性糖。

參照1.2.2.1實驗步驟測定山楂果渣可溶性糖和山楂果渣全水解液可溶性糖含量,計算公式如下:

式中:c-根據標準曲線計算待測液中可溶性糖的濃度,μg/mL;v-待測液總體積,mL;d-稀釋倍數;M-山楂果渣粉末干重,g。

纖維素含量計算公式如下:

A3(%)=A1-A2

式中:A3-山楂果渣纖維素含量,%;A1-山楂果渣全水解液中可溶性糖含量,%;A2-山楂果渣可溶性糖含量,%。

1.2.3 蒸汽爆破預處理條件下的山楂果渣總黃酮提取量的測定

1.2.3.1 蘆丁標準曲線的制作 分別精確吸取0.15 mg/mL蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL,移入15 mL具塞試管中,依次加入5.0 mL 30%乙醇溶液和0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置5 min,加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻,放置6 min,然后加入2.0 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液,用30%乙醇溶液定容至刻度。搖勻,放置15 min,以零為對照,于510 nm波長測定吸光度[13]。以吸光度為縱坐標,以蘆丁濃度為橫坐標,得到標準曲線為y=0.0014x+0.0441,R2=0.9910。

1.2.3.2 總黃酮提取量測定與計算 稱取1.0 g不同蒸汽爆破預處條件下的山楂果渣粉末,置于索氏提取器中,加入100 mL 70%乙醇溶液80 ℃回流3 h,至提取液無色為止。冷卻后,用25%乙醇溶液洗滌濾渣,合并濾液,用蒸餾水定容至250 mL,備用。分別吸取1.0 mL不同蒸汽爆破預處條件下的山楂果渣黃酮提取液,參照1.2.3.1 實驗步驟測定總黃酮提取量,計算公式如下:

式中:X-山楂果渣總黃酮提取量,mg/g;B-根據標準曲線計算待測液中黃酮的濃度,μg/mL;M-山楂果渣粉末干重,g;V1-山楂果渣黃酮提取液測定體積,mL;V2-山楂果渣黃酮提取液總體積,mL。

1.2.4 酶解糖化參數的確定

1.2.4.1 最佳蒸汽爆破預處理條件的確定 稱取1.0 g不同蒸汽爆破預處條件下的山楂果渣粉末分別置于250 mL錐形瓶中,加入 0.05 mol/L(pH4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液至底物濃度為10%,纖維素酶量100 U/g,于 50 ℃、150 r/min 酶解糖化72 h;分別在酶解時間4、8、12、24、36、48、60、72 h取上清液,測定酶解糖化率,以酶解糖化率為衡量指標,確定其最佳蒸汽爆破預處理條件。

1.2.4.2 纖維素酶量的確定 在最佳蒸汽爆破預處理條件確定的基礎上,將纖維素酶量調整為50、100、150、200、250 U/g,以1.2.4.1同樣的方法對最佳蒸汽爆破預處理條件下的爆破物料進行酶解實驗,測定酶解糖化率,確定其最佳纖維素酶量。

1.2.4.3 酶解糖化率的計算 參照1.2.2.1實驗步驟及葡萄糖標準曲線方程:y=0.0082x+0.0283,,R2=0.9991,計算出酶解糖化液中可溶性糖濃度和全水解液中可溶性糖濃度,酶解糖化率計算公式如下:

式中:w-酶解糖化率,%;w1-酶解糖化液中可溶性糖濃度,μg/mL;w2-山楂果渣全水解液中可溶性糖濃度,μg/mL。

1.2.5 山楂果渣粉末微觀結構表征 電鏡(SEM)掃描:稱取0.1 g不同蒸汽爆破預處條件下的山楂果渣粉末,固定在樣品臺上,然后噴金,再置于掃描電子顯微鏡中觀察。

X射線衍射儀(XRD)掃描:取0.2 g不同蒸汽爆破預處條件下的山楂果渣粉末,置于X射線衍射儀所用的小平盤內,壓平,掃描,根據Segal[14]公式計算相對結晶度。

式中:Cr-相對結晶度,%;I002-002面衍射峰的極大強度,cps;Iam-衍射角度2θ為18.5°時非結晶背景的散射強度。

1.3 數據分析

采用Origin 9.0對實驗數據處理,用SPSS 20.0軟件的最小顯著差數法(LSD)多重比較方法進行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 蒸汽爆破預處理對山楂果渣組分的影響

由圖1可知,隨著蒸汽爆破預處理條件強度的增加，山楂果渣可溶性糖含量增多,可能是滲入其結構內部的蒸汽在瞬時降壓時造成細胞壁結構被破壞使可溶性糖更易溶出,或者是蒸汽爆破預處理使得纖維素發生降解轉變為可溶性糖[15-16];但在預處理條件2.4 MPa、4 min時,可溶性糖含量反而最少,主要是因為高強度的預處理條件使得可溶性糖大量損失無法收集。對于蒸汽爆破預處理對山楂果渣纖維素含量的影響無規律可尋,但總體來看預處理可以使纖維素結構被破壞發生降解使其含量降低,這樣可以提高山楂果渣的利用率。

圖1 蒸汽爆破預處理對山楂果渣纖維素、可溶性糖含量的影響Fig.1 Effect of steam explosion pretreatment on cellulose and soluble sugar content of hawthorn pomace

圖2 蒸汽爆破預處理對山楂果渣總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of steam explosion pretreatment on the extraction of total flavonoids from hawthorn pomace

由圖2可知,與山楂果渣原物料相比,蒸汽爆破預處理后(除2.0 MPa、30 s外),總黃酮提取量顯著增加(P<0.05),當預處理條件為2.4 MPa、4 min時,總黃酮提取量達到最大為26.5 mg/g,是原物料的1.5倍。黃酮主要存在于細胞內部,預處理后,山楂果渣的微觀結構被破壞,導致細胞壁破裂,破壞了黃酮的天然保護屏障,這樣更有利于黃酮的溶出與提取[17-18]。隨著蒸汽爆破預處理時間的延長,總黃酮提取量呈不斷增加的趨勢,山楂果渣在蒸汽爆破壓力2.0 MPa條件下,預處理時間30 s延長至4 min時,總黃酮提取量提高了12.4%;在壓力2.4 MPa條件下,預處理時間30 s延長至4 min時,總黃酮提取量提高了25%,這主要是因為保壓時間的延長使滲入山楂果渣結構內部的蒸汽增多,當瞬時降壓時,對其完整的結構破壞更嚴重,細胞壁包裹的黃酮更容易溶出,這一趨勢與張棋等[19]、張兵兵等[20]的研究結果基本類似。此外,蒸汽爆破的壓力對山楂果渣的預處理效果也影響顯著(P<0.05),高壓使原物料微觀結構破壞更嚴重,總黃酮提取量也相應地增加,在壓力2.0、2.4 MPa條件下,同時預處理30 s時,壓力2.4 MPa較2.0 MPa預處理條件下的山楂果渣總黃酮提取量提高了10.2%,這與電鏡掃描微觀結構的破壞程度基本相吻合。

2.2 蒸汽爆破預處理對山楂果渣酶解效果的影響

蒸汽爆破預處理使山楂果渣微觀結構比表面積增加、顆粒尺寸減小,這樣增加了纖維素酶與山楂果渣的接觸面積,增大了酶與底物的結合能力,提高了酶的催化效率[21-22]。如圖3所示，在蒸汽爆破壓力為2.0 MPa條件下,預處理時間30 s延長至4 min時,山楂果渣微觀結構的破壞程度增加,纖維素的相對結晶度降低,使得酶解糖化率提高了12.2%;在蒸汽爆破壓力為2.4 MPa條件下,預處理時間30 s延長至2 min時,酶解糖化率提高了15.7%,但當預處理時間延長至4 min時,由于長時間高強度的蒸汽爆破預處理使山楂果渣纖維素的相對結晶度增加,此時酶解糖化率降到了21.6%,甚至較原物料的降低了0.244倍。當預處理條件為2.4 MPa、2 min時,酶解糖化率達到最大為39.0%,較原物料提高了0.302倍。綜合考量,為了有利于后續山楂果渣糖化發酵高值化利用,所以選取蒸汽爆破預處理的最優條件為2.4 MPa、2 min。

圖3 蒸汽爆破預處理對山楂果渣酶解糖化率的影響Fig.3 Effect of steam explosion pretreatment on enzymatic saccharification rate of hawthorn pomace

圖4是蒸汽爆破2.4 MPa、2 min預處理條件下,添加不同纖維素酶量對山楂果渣酶解糖化率的影響。由圖4可知,酶解糖化率隨著纖維酶量的增加呈上升的趨勢,此外,在酶解初期,纖維素酶最先酶解非結晶纖維,酶量對酶解糖化率差異影響不顯著(P>0.05);但隨著酶解時間的延長,結晶纖維開始酶解,酶量對酶解糖化率差異影響顯著(P<0.05)。當酶量為50、100、150、200、250 U/g,酶解72 h時,酶解糖化率分別為33.4%、39.8%、42.0%、42.0%、42.0%。當酶量為200、250 U/g,酶解48 h時,酶解糖化率已經達到最大為42.0%,但當酶量為150 U/g,酶解糖化率達到42.0%時,酶解時間需要延長至72 h,本著高效、節約的原則,選擇200 U/g為最適酶量,此條件下酶解糖化率較原物料提高了0.392倍。

圖4 酶量對2.4 MPa、2 min預處理條件下山楂果渣酶解糖化率的影響Fig.4 Effect of enzyme quantity on enzymatic saccharification rate of hawthorn pomace under pretreatment conditions of 2.4 MPa and 2 min

2.3 蒸汽爆破預處理對山楂果渣微觀結構的影響

圖5中a～g為山楂果渣原料和不同蒸汽爆破預處理條件下的爆破物料的電鏡掃描圖(由于30 s爆破處理強度太小,微觀結構不能充分體現與原物料的差別,所以選擇1、2、4 min進行蒸汽爆破實驗,X射線衍射同)。與山楂果渣原料相比較,蒸汽爆破預處理后,纖維素的微觀結構遭到破壞。當壓力為2.0 MPa蒸汽爆破預處理時間為1、2和4 min時,物料片層間結合松散,纖維之間結合明顯變得松弛,部分纖維素斷裂成碎片。當壓力為2.4 MPa蒸汽爆破預處理時間為1、2和4 min時,從e、f、g圖中可以看出,由于大量的蒸汽快速逸出使瞬時降壓過程中物料結構發生破碎,破壞程度相對嚴重,表面裂紋增多,并出現大量小面積深溝甚至蜂窩狀孔洞結構,物料無定形區的面積增加,表面也變得更加不均勻[18,23]。

2.4 X射線衍射(XRD)分析

圖5 蒸汽爆破預處理條件下山楂果渣的電鏡掃描圖(800×)Fig.5 Scanning electron micrograph of hawthorn pomace under steam explosion pretreatment(800×)

由圖6可知,山楂果渣經過蒸汽爆破預處理后,通過XRD圖譜可以看出22.5 °的吸收峰較原物料明顯變尖銳,利用Segal經驗公式求得原物料和蒸汽爆破預處理后山楂果渣纖維素的相對結晶度如表1所示。除預處理條件為2.4 MPa、4 min時,纖維素相對結晶度增加外,其它預處理條件下的纖維素相對結晶度較原物料均減小,蒸汽爆破使纖維素的結構破壞,從而散射的X射線強度減弱。其中山楂果渣經過2.4 MPa、2 min預處理后的纖維素相對結晶度降低最多,減少了0.257倍,相應地增加了其微觀結構的比表面積,這樣可以使酶解糖化率相對提高。但在預處理條件為2.4 MPa、4 min時,纖維素相對結晶度提高了0.279倍,可能是因為高強度的預處理條件引起了纖維素氫鍵重排和重結晶,結晶區面積增加,或者是非結晶纖維發生了降解,非結晶區減少,這與酶解糖化實驗結果一致[24-25]。

表1 不同預處理條件下山楂果渣在X射線衍射(XRD)圖譜的相對結晶度Table1 Relative crystallinity of hawthorn pomace under X-ray diffraction(XRD)spectra under different pretreatment conditions

圖6 蒸汽爆破預處理條件下山楂果渣X射線衍射(XRD)圖譜Fig.6 X-ray diffraction(XRD)pattern of hawthorn pomace under steam explosion pretreatmen

3 結論

山楂果渣經蒸汽爆破預處理后,使其微觀結構遭到破壞,其組分也發生了相應的變化,總體來看蒸汽爆破預處理使山楂果渣的可溶性糖含量增加,纖維素含量減少;同時隨著預處理條件強度的增加總黃酮提取量也相對增加,在預處理條件為2.4 MPa、4 min時,總黃酮提取量達到最大為26.5 mg/g,是原物料的1.5倍。

為了實現后續山楂果渣糖化發酵高值化利用,以酶解糖化率為蒸汽爆破預處理最佳條件的衡量標準,根據酶解糖化實驗結果,得出在預處理條件2.4 MPa、2 min,纖維素酶量為200 U/g時,酶解效果最佳,酶解糖化率為42.0%,較原物料提高了0.392倍;電鏡掃描顯示,山楂果渣蒸汽爆破之前,纖維結構較為致密,表面碎片較少,經爆破處理后,出現大批量的裂紋、碎片和蜂窩狀孔洞結構,物料無定形區的面積增多;X射線衍射分析表明,蒸汽爆破預處理使山楂果渣的大部分纖維素相對結晶度降低。

通過蒸汽爆破預處理,山楂果渣可開發利用的組分增加、酶解糖率提高,且效果明顯,可為后續開發利用提供理論指導和技術支持。