魚源藤黃微球菌三重PCR檢測法的建立及耐藥性分析

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

藤黃微球菌(Micrococcusluteus)為微球菌科微球菌屬的革蘭氏陽性球菌,一般為單生、對生和多方向分裂形成四聯體或不規則的立體菌落[1]。微球菌是一種被認為具有一定污染性的微生物,而藤黃微球菌是微球菌屬中的主要致病微生物之一[2]。該菌廣泛分布于土壤、空氣、水體等生活環境以及動物體表,可定植于人類皮膚和口腔粘膜上,但該菌臨床病例較為少見[2-4]。Fleming[5]發現藤黃微球菌在正常機體中會被吞噬細胞的溶菌酶殺滅。Ganz等[6]發現藤黃微球菌在小鼠缺乏M型溶菌酶的情況下更具有致病性。該菌可引起人類組織炎癥、敗血癥、休克等和魚類內臟、體表出血等疾病[2-4,7-10],對人類和動物健康均造成威脅[4]。因此,藤黃微球菌是一種在機體免疫力低下時才可能引起體表傷口組織或體內組織感染的條件致病菌。

目前,對藤黃微球菌的研究主要有致病性和在食品加工應用等方面,未見關于該菌的分子生物學檢測法的報道。快速檢測細菌的分子生物學檢測技術主要有常規PCR技術、多重PCR技術。常規PCR技術主要是擴增細菌的一條特異性基因,而不同細菌間16S rDNA基因、23S rDNA基因序列具有一定同源性,這將對該檢測方法的特異性產生一定的影響[3,11]。多重PCR技術具有高效性、系統性、經濟簡便性等特點,與常規PCR技術相比具有更高的特異性,在細菌快速檢測方法有著重要的臨床意義和廣泛的應用前景[12-13]。在目前的研究中,國內未見檢測該菌耐藥基因的研究,國外僅Liebl等[14]研究了該菌大環內脂類抗生素耐藥基因。而檢測藤黃微球菌的耐藥表型和耐藥基因型,在防控該菌方面有著重要的意義。本實驗鑒定發病黃顙魚的病原,建立一種快速檢測病原菌的方法并進行藥物篩選,以期為防控由該菌引起的人和動物的食源性感染提供理論依據。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物 成都某市場上購買的尾部皮膚潰爛、腹鰭出血的黃顙魚;LB培養基、MBS培養基、MRS培養基、Mueller-Hinton Agar培養基 青島高科園海博生物技術有限公司;PCR聚合酶(1.1×T3 Super PCR Mix)、細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司;細菌生化鑒定管、抗菌藥物藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司;標準革蘭氏染色試劑盒 北京雷根生物技術有限公司。

ESJ200-4電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;HZQ-X100恒溫振蕩培養箱 四川新科儀器有限公司;SteriLGARD ⅢADVANCE生物安全柜 Baker公司;DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司;DHG-9203A高溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;WGZ-2XJ細菌濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司;DYY-6B穩壓穩流電泳儀 北京市六一儀器廠;13395H2X生物顯微鏡 Leica公司;KW-1000DC恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司;S1000 Thermal Cycler基因擴增儀、GEL DOC2000凝膠成像系統 伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離、培養和生理生化鑒定 接種環無菌處理后,在病魚腹腔積液取樣并接種于LB固態培養基中,28 ℃恒溫培養18 h觀察。挑取外觀一致的單菌落,并對其進行細菌純化培養。采用革蘭氏染色法對細菌菌體進行染色[15],顯微鏡下觀察其顏色和形狀。采用細菌生化鑒定管進行生化鑒定,鑒定標準參照《伯杰細菌鑒定手冊》[1]和《魚類及其他水生動物細菌實用鑒定指南》[16]。

1.2.2 細菌基因組DNA提取及16S rDNA序列分析 根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書,提取細菌總DNA。采用李晨陽等[17]所使用的16S rDNA通用引物(正向引物:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,反向引物:CTACGGCTACCTTGTTACGA),以提取的細菌DNA作為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL):1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL,細菌DNA模板和上、下游引物各1 μL。16S rDNA PCR反應條件:98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環;72 ℃再延伸2 min。取5 μL PCR擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA片段長度,并在凝膠成像系統下觀察并拍照。確認質量合格、無明顯雜帶后將PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序并拼接。取得拼接后的16SrDNA序列后,提交至GenBank獲取登錄號,并在GenBank上進行BLAST序列比對,選取相似度為100%的細菌16S rDNA基因序列,利用Mega 5.0軟件構建系統進化樹。

1.2.3 人工回歸感染 將分離菌株接種到LB培養基中,28 ℃、180 r/min培養24 h,離心后用滅菌的0.9%生理鹽水制備濃度為3×109cfu/mL的菌懸液。選取10尾健康黃顙魚腹腔注射0.1 mL菌懸液,另選取10尾健康黃顙魚腹腔注射0.1 mL生理鹽水作對照,飼養7 d觀察發病和死亡情況。

1.2.4 特異性引物設計及三重PCR擴增 根據GenBank公布的藤黃微球菌基因序列(GenBank登錄號:CP001628.1),采用Primer Premier 5.0軟件設計三對特異性引物,詳見表1。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,工作濃度為10 pmol/L。通過對各反應條件和體系的單因素試驗,確定三重PCR最優反應條件為:98 ℃預變性5 min;98 ℃變性30 s,61.3 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共35個循環;72 ℃再延伸4 min。三重PCR最優反應體系為:1.1×T3 Super PCR Mix 21 μL,藤黃微球菌DNA模板1.2 μL,Tsig-2上、下游引物各0.6 μL,TCBS-1和TPol-1上、下游引物各0.4 μL,總體系為25 μL。表1中各引物對單獨擴增作為對照,PCR反應體系25 μL:1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL,細菌DNA模板和上、下游引物各1 μL,反應條件同三重PCR。分別取5 μL PCR擴增產物,采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳,在恒壓120 V條件下電泳45 min,置于凝膠成像系統下觀察PCR擴增結果。

表2 耐藥基因引物序列Table 2 Primers of drug resistance genes

1.2.5 引物特異性和靈敏度試驗 按照無菌操作要求及常規菌種活化方法,固態培養基分別活化枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、鏈球菌(Streptococcus)、殺魚愛德華氏菌(Edwardsiellapiscicida)、血短桿菌(Brevibacteriumsanguinis)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、廈門希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)保種菌株,挑取單菌落接于液態培養基37 ℃恒溫搖床培養三代,分別取1～5 mL菌液按照1.2.2的方法制備DNA模板進行三重PCR擴增,反應條件、體系、引物及結果檢測方法同1.2.4。上述所用試驗菌株均保種于西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用重點實驗室。測定1.2.2中提取的藤黃微球菌基因組DNA濃度后,對DNA樣品依次按照10倍、20倍、50倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍進行稀釋,制備試驗DNA模板并進行三重PCR擴增,反應條件、體系、引物及結果檢測方法同1.2.4。

1.2.6 多重PCR檢測法的臨床應用 采用1.2.3的方法人工回歸感染黃顙魚,將發病和死亡黃顙魚的潰爛傷口組織取下,勻漿后進行細菌基因組DNA提取,采用1.2.5中的三重PCR檢測法檢測樣品。

1.2.7 耐藥基因檢測 以提取的細菌DNA為模板,參考文獻[18-20]設計氨基糖苷類、磺胺類和β-內酰胺類抗生素的耐藥基因引物,引物詳見表2。PCR反應體系同1.2.2,PCR反應條件:98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s,退火10 s(退火溫度見表2),72 ℃延伸30 s,共35個循環;72 ℃再延伸2 min,取5 μL PCR擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA片段長度,并在凝膠成像系統下觀察并拍照。

1.2.8 耐藥表型試驗 參照周海波等[21],采用瓊脂紙片擴散法,取適量菌液均勻涂布于Mueller-Hinton Agar培養基上。再分別將藥物藥敏紙片(見表4)放置于培養基中,35 ℃培養16～18 h觀察結果。藥物藥敏紙片規格及敏感程度判斷標準數據參照CLSI標準。

1.3 數據處理

PCR擴增圖譜均有Biorad ChemiDoc MP凝膠成像系統產生,后由Adobe Photoshop 13.0和Paint 3D處理。系統發育樹圖片由Mega 5.0軟件構建,Adobe Photoshop 13.0處理。菌株生化鑒定和耐藥表型試驗均為三個重復組。

2 結果與分析

2.1 形態學和理化特性鑒定

菌株fsznc-CL菌落均呈圓形,邊緣整齊,顏色為檸檬黃色或金黃色,大多數菌落疊聚一起呈鏈狀或成片排列,少數為單菌落(圖1)。該菌革蘭氏染色后1000倍鏡檢,可見多數成對或成片排列的紫色或黑紫色球形菌體,表明該菌為革蘭氏陽性球菌。該菌理化特性試驗結果詳見表3。該菌形態學和理化特性與《伯杰細菌鑒定手冊》[1]、《魚類及其他水生動物細菌使用鑒定指南》[16]中關于藤黃微球菌的描述基本一致。

表3 生理生化試驗結果Table 3 Results of biochemical characteristics

注:+,陽性;-,陰性。

圖1 菌株fsznc-CL的形態Fig.1 Colony morphology of fsznc-CL注:A:菌株fsznc-CL在培養基上的菌落形態;B:菌株fsznc-CL革蘭氏染色結果(1000×)。

2.2 16S rDNA序列分析

該菌PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示其片段長度大約為1500 bp(圖2)。測序結果顯示,分離菌株16S rDNA片段長度為1286 bp。將分離菌株16S rDNA基因序列提交到GenBank中獲得登錄號MK521703。系統發育樹(圖3)結果表明,菌株fsznc-CL的16S rDNA基因序列與MicrococcusluteusHMC01的16S rDNA基因序列置信度為100,結合分離菌株形態學和理化特性,綜合判定菌株fsznc-CL為藤黃微球菌(Micrococcusluteus)。

圖3 菌株fsznc-CL 16S rDNA基因序列與相關菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of fsznc-CL 16S rDNA gene sequence and its relatives strains

圖2 分離菌16S rDNA基因PCR擴增結果電泳圖Fig.2 PCR amplification results of 16S rDNA gene of isolation bacteria注:M.DL2000DNA Marker;1.fsznc-CL。

2.3 人工回歸感染結果

經腹部注射分離菌株的黃顙魚,7 d內死亡7尾,2尾病魚體表出現潰爛傷口,1尾未見明顯病變,對照組未見異常或死亡魚。圖4為人工回歸感染后的發病黃顙魚,癥狀表現為尾部、鰭部、腹部等部位有潰爛傷口、腹鰭基部有出血點、部分病魚腹部膨大、部分內臟略有出血點,但未見明顯病變,外觀變化與自然感染的病魚相似。

圖4 人工感染后黃顙魚的外觀與剖檢變化Fig.4 Appearance and anatomical changes of artificially infected Pelteobagrus fulvidraco注:A:鰭部潰爛和出血;B:腹部和鰭部潰爛。

2.4 三重PCR擴增結果

圖5為各引物對和三重PCR擴增結果,1～3號泳道依次為引物對1～3獨立擴增結果,測序結果與數據庫中對應基因序列的相似性分別為97%、98%和97%,片段大小分別為173、292和389 bp。4號泳道為使用三對引物進行擴增的結果,出現三條清晰條帶,且無其他雜帶,三對引物之間無干擾,擴增準確。

圖5 特異性引物擴增Fig.5 Specificprimers for PCR amplifications注:M.DL2000DNA Marker;1.TCBS-1;2.Tsig-2;3.TPol-1;4.The triple PCR。

2.5 引物特異性、靈敏度試驗和臨床應用結果

圖6為引物特異性試驗結果,僅1號泳道的藤黃微球菌三重PCR擴增結果出現三條清晰條帶,片段大小分別為173、292和389 bp,其他菌株均未出現目的條帶,說明所建立的檢測方法就有較好的特異性。圖7為引物靈敏度試驗結果,1～7號泳道均能出現清晰的目的條帶,藤黃微球菌DNA模板稀釋前的濃度測定結果為58.220 ng/μL,7號泳道所對應的DNA模板濃度為5.822×10-3ng/μL,所建立的多重PCR檢測法檢測該菌的最低模板濃度為5.822×10-3ng/μL,說明該檢測法具有較高的靈敏度,可在被檢菌株DNA模板濃度較低的情況下擴增出目的片段。

臨床應用試驗中采集8條發病黃顙魚的不同潰爛傷口組織,共12個樣品,多重PCR檢測結果見圖8,其中10個病變組織結果呈陽性,陽性率約為83.33%。

圖6 三重PCR的特異性檢測Fig.6 Specificity of the triple PCR注:M.DL2000DNA Marker;1.Micrococcus luteus;2.Streptococcus;3.Edwardsiella piscicida;4.Brevibacterium sanguinis;5.Aeromonas sobria;6.Vibrio cholerae;7.Bacillus cereus;8. Shewanella xiamenensis;9.Aeromonas veronii;10. Bacillus subtilis;11.Enterococcus faecalis。

圖7 三重PCR的靈敏度檢測Fig.7 Sensitivity of the triple PCR注:M.DL2000DNA Marker;1～10DNA模板濃度(ng/μL): 58.220、5.822,2.911、1.164、5.822×10-1、5.822×10-2、 5.822×10-3、5.822×10-4、5.822×10-5、5.822×10-6。

圖8 臨床樣品多重PCR檢測結果Fig.8 Detection results of clinical samples by multiplex PCR注:M.DL2000DNA Marker;1～10:病變組織。

2.6 耐藥基因檢測結果

β-內酰胺類抗生素耐藥基因中擴增出TEM基因,片段長度約為740 bp的條帶(圖9)。氨基糖苷類抗生素耐藥基因中擴增出aph(3′)-Ⅱa和aac(6′)-Ⅰb基因,片段長度分別約為740、500 bp的條帶(圖10)。磺胺類抗生素耐藥基因中擴增出Sul1和Sul2基因,片段長度分別約為240、800 bp的條帶(圖11)。以上擴增片段大小與預期基本一致,未檢測出aac(3)-Ⅱa和Sul3基因。

圖9 TEM耐藥基因檢測結果Fig.9 Detective results of TEM resistant genes注:M.DL2000DNA Marker;1.TEM。

圖10 氨基糖苷類藥物耐藥基因檢測結果Fig.10 Detective results of aminoglycosides resistant genes注:M.DL2000DNA Marker;1.aph(3′)-Ⅱa;2.aac(6′)-Ⅰb。

2.7 耐藥表型試驗結果

表4 藥敏試驗結果Table 4 Results of antibiotic sensitivity test

注:R:耐藥;I:中度敏感;S:敏感。

圖11 磺胺類藥物耐藥基因檢測結果Fig.11 Detective results of sulfonamides resistant genes注:M.DL2000DNA Marker;1.Sul1;2.Sul2。

從藥物藥敏試驗結果(表4)可以看出,藤黃微球菌對羧芐西林、哌拉西林、氨芐西林、頭孢呋辛、麥迪霉素等24種藥物敏感,對諾氟沙星、苯唑西林、紅霉素和呋喃唑酮耐藥。

3 討論

藤黃微球菌作為人畜生存環境中的條件致病菌,營養不良、機體免疫力較差成為該菌的主要易感因素[22]。彭彬等[9]認為該菌是導致黃鱔出血病的致病菌株。葉妍琳等[23]在火烈鳥的糞便中分離出該菌并認為其具有致病性。陳宇明[24]報道該菌可引起豬敗血癥并以2月內的幼齡豬為主要感染對象。本試驗在病黃顙魚腹腔積液中分離出菌株fsznc-CL,綜合判定該菌為藤黃微球菌,并通過人工回歸感染試驗確定菌株fsznc-CL對黃顙魚具有一定的致病性。這說明藤黃微球菌對多種屬動物菌存在一定的致病性。

影響多重PCR檢測的效果的因素有很多,模板濃度、引物特異性和穩定性等均可影響檢測效果。在目前的研究中,有多種形式的多重PCR檢測方法,如利用多條毒力基因的方法檢測一種或多種細菌[25]、利用數條特異性基因同時檢測數種細菌[13]等,此類方法通過一條特異性基因或多條非特異性基因(如毒力基因、16S rDNA和23S rDNA序列)來判斷樣品中是否含有目的細菌,但檢測方法的特異性和準確性欠佳。本試驗所選取的特異性基因均通過BLAST比對,確保比對結果中只包含藤黃微球菌相關序列,并采用三條特異性基因檢測一種細菌的方法,以提高所建立檢測法的特異性和準確性。臨床應用試驗結果可檢測出約83.33%含有藤黃微球菌的樣品,另外約16.67%的樣品結果呈陰性可能是由于樣品中模板濃度低于本方法檢測藤黃微球菌的最低模板濃度等原因。綜合引物特異性、靈敏度試驗和臨床應用結果,本試驗建立的快速檢測藤黃微球菌的三重PCR檢測法具有特異性高、靈敏度高、準確可靠的特點。并且該方法可在2 h內檢測出菌樣是否含有藤黃微球菌,同時降低了鑒定細菌的成本。

關于藤黃微球菌的耐藥表型已有一些報道。彭彬等[9]研究表明藤黃微球菌對阿米卡星、環丙沙星、羧芐西林、四環素等抗生素敏感,與本次耐藥表型試驗結果一致。但彭彬等[9]從病黃鱔分離出的藤黃微球菌對諾氟沙星敏感。李權生等[10]研究表明藤黃微球菌對諾氟沙星和紅霉素敏感。Br?goszewska等[26]在辦公室空氣質量研究中,對藤黃微球菌藥敏試驗結果顯示該菌對諾氟沙星耐藥,而本試驗結果為該菌對諾氟沙星和紅霉素耐藥。由于時間、地點、分離源的不同,藤黃微球菌對諾氟沙星和紅霉素的藥敏結果不同,這可能是在不同地區、不同時間等條件下的用藥習慣不同而產生的差異。本試驗檢測出藤黃微球菌1條β-內酰胺類抗生素耐藥基因,氨基糖苷類抗生素耐藥基因和磺胺類抗生素耐藥基因各2條。該菌株對苯唑西林(β-內酰胺類抗生素)表現為耐藥,而對所有涉及到的氨基糖苷類抗生素和磺胺類抗生素并未出現耐藥表型。這種現象可能是由于該菌氨基糖苷類抗生素耐藥基因和磺胺類抗生素耐藥基因并未表達。藥敏試驗抑菌圈30 mm以上的抗生素中除氯霉素、麥迪霉素和克林霉素外均屬于β-內酰胺類抗生素,由于氯霉素為水產禁用藥物,因此可將麥迪霉素和克林霉素作為防治藤黃微球菌時替代β-內酰胺類抗生素的藥物。

4 結論

本試驗從病黃顙魚中分離出藤黃微球菌,經人工回歸感染試驗驗證了該菌為病原菌,并建立了一種快速、準確地檢測藤黃微球菌的三重PCR方法。本試驗檢測出藤黃微球菌具有β-內酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素和磺胺類抗生素耐藥基因,并對諾氟沙星、苯唑西林、紅霉素和呋喃唑酮耐藥,可將麥迪霉素和克林霉素作為防治藤黃微球菌時替代β-內酰胺類抗生素的藥物。這為藤黃微球菌的快速檢測及防控提供了科學資料。