高產γ-氨基丁酸的雙歧桿菌的篩選及對抑郁細胞模型的改善作用

,3,4,*

(1.深圳市華大生命科學研究院,廣東深圳 518083;2.深圳華大農業應用研究院,廣東深圳 518120;3.農業部農業基因組學重點實驗室,廣東深圳 518083 4.深圳市環境微生物基因組學與應用重點實驗室,廣東深圳 518083)

抑郁癥是一種表現為自卑、快感缺乏,且伴隨著較高致殘率和致死率的疾病[1-3]。由于其發病機制復雜,較難治愈,因此引起了人們的廣泛關注。目前,該疾病主要采用三環類抗抑郁劑(TCAs)、單胺氧化酶抑制劑(MAOI)等藥物治療。但藥物通常有一定的副作用,如:抑制腸道微生物的生長[4],口干、便秘、視物模糊等。因此,新型、高效且無毒的治療方式是目前研究的重點。

最新研究發現,部分益生菌具有改善抑郁癥的作用。如Desbonnet等[5]發現抑郁癥模型大鼠喂飼嬰兒雙歧桿菌后,大鼠表現出抗抑郁能力。抑郁患者服用瑞士乳桿菌R0052和長雙歧桿菌R0175混合益生菌制劑后,其抑郁癥狀得到顯著改善[6]。γ-氨基丁酸是由谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧反應生成的一種非蛋白質氨基酸,其作為一種重要的神經傳導物質抑制劑,不僅能抑制神經傳遞、降血壓、降血糖,而且有鎮定劑效果[7-11]。近年來,高產GABA乳酸菌的篩選和研究頗多[11-14]。梁金鐘等[15]體外篩選出一株產GABA的植物乳桿菌Lp-Lw-131,其GABA的產量為0.917 g/L;同樣,產GABA的布氏乳桿菌MS可以保護由化學物質誘導的神經細胞死亡[16]。本文主要以膽鹽水解酶活性、耐酸耐膽鹽能力、抗生素耐受性、粘附能力以及GABA的產力及干預抑郁細胞模型作用對雙歧桿菌的功能特性進行研究,以期篩選出具有潛在抗抑郁作用的菌株。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

94株雙歧桿菌 均由深圳華大基因益生菌與發酵實驗室提供,試驗中重點研究的13株雙歧桿菌詳細信息見表1;BS培養基 海博生物;細胞培養板 AXYGEN;細胞培養皿 FALCON;PRMI 1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、CCK 8、PBS Gibco;皮質酮(Corticosterone,CORT) GmbH;HT-29(人結腸癌細胞)、SH-SY5Y(人類神經母細胞瘤株) 北納生物;慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、新霉素、氨芐青霉素、四環素、紅霉素、克林霉素、氯霉素、甲氧芐啶、環丙沙星、利福平、萬古霉素 美國BBI;甘氨酸 上海生工生物工程技術服務有限公司。

表1 13株雙歧桿菌菌株信息Table 1 Information of 13 Bifidobacteriums strains in experiment

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司;生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;FP-1100-C型全自動生長曲線儀 Bioscreen;5424R型臺式冷凍離心機 Eppendorf;UV-6100型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;CO2培養箱Galaxy170R Eppendorf;酶標儀Synergy 2 BioTek;LC-2030型液相色譜儀 日本島津儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產BSH雙歧桿菌的篩選

1.2.1.1 標準曲線繪制 采用茚三酮比色法[17]測定氨基酸含量;以在570 nm測定濃度為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L甘氨酸溶液的吸光度,以繪制標準曲線。

1.2.1.2 BSH活力測定 雙歧桿菌培養液在4 ℃經10000×g離心10 min倒上清后生理鹽水洗脫2次,隨后調制成1×109CFU/mL的菌液。在15 mL錐形反應管中加4 mL 5 mmol/L甘氨去氧膽酸鈉(GDCA)緩沖液、1 mL的菌液混勻后,37 ℃水浴30 min,在570 nm讀取吸光值。BSH酶活(U)定義為1×109CFU/mL菌液經過1 min反應產生甘氨酸的物質量(μmol)[17]。

1.2.2 菌株抗生素敏感性 采用最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)法,測試試驗菌株的耐藥情況,其中以標準菌株干酪乳桿菌(Lactobacilluscaseisubsp ATCC334)作為陽性質控。參照WHO提供的NCCLS標準[18],確定雙歧桿菌對各抗生素的敏感性。

將13種抗生素分別作一系列2倍比稀釋,得到濃度分別為0.03125～1024 μg/mL的抗生素溶液。將不同濃度的抗生素溶液加入96孔板中,隨后加入50 μL濃度為109CFU/mL雙歧桿菌菌液,37 ℃培養48 h,觀察實驗結果。

1.2.3 耐酸、耐膽鹽能力檢測 將初篩得到BSH活性較高的13株雙歧桿菌以3%接種量接種于BS液體培養基中,菌株培養至穩定期后4 ℃下6000 r/min離心10 min收集菌體,PBS(pH7.2)洗滌2次,重懸于pH2和pH3的無菌PBS緩沖液中,并將細菌濃度調至109CFU/mL。37 ℃培養2 h后,取樣涂板計數,并計算存活率[19]。

13株雙歧桿菌分別以3%接種量接種于BS(含有0.3%膽鹽)液體培養基中,37 ℃條件下連續培養,分別在3 h和6 h取樣涂板計數,并計算存活率。

1.2.4 粘附性試驗 參考Gagnon等的方法[20],將HT-29細胞以每孔1×105的接種量接種于12孔板中,每孔含2 mL PMI 1640完全培養基(10% FBS)。收集培養至穩定期的雙歧桿菌菌體(4 ℃,6000 r/min,10 min),并用PBS洗滌3次,然后用細胞培養液將其重懸至5×108CFU/mL。待細胞長至單層,去除細胞培養液,并用無菌PBS沖洗細胞2～3次,然后加入1 mL雙歧桿菌懸浮液(每株菌3個重復)。37 ℃ 5% CO2-95%空氣培養箱中培養2 h后,棄除細菌懸浮液,PBS沖洗3～5次,胰蛋白酶消化3 min,加入適量含有10% FBS的1640培養液終止反應。然后,加入1 mL 0.05% TritonX-100,反復吹打使細胞完全裂解,收集菌體并進行系列稀釋,涂板計數。另選取長至單層的培養孔,進行細胞計數并計算其粘附能力。

1.2.5 HPLC法篩選GABA高產菌株 參照Wu等[21]的方法,雙歧桿菌發酵液12000 r/min離心10 min后,取上清液100 μL,加入20 μL衍生試劑、100 μL硼酸緩沖液混合均勻,室溫反應5 min后高效液相色譜檢測GABA。流動相A為20 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH7.3),流動相B為乙腈,其比例為4∶1。衍生試劑:OPA 20 mg、β-巰基乙醇20 μL及5 mL乙腈,混勻。硼酸緩沖液:硼酸24.7 g,加超純水定容至1 L,pH為10.4。進樣量:20 μL,流速:0.8 mL/min,柱溫:30 ℃,360 nm處檢測吸收峰,外標法定量。

1.2.6 雙歧桿菌對抑郁癥細胞模型干預實驗 以每孔5×104的接種量,將狀態良好的SH-SY5Y細胞接種于每孔含200 μL RPMI 1640完全培養基(10% FBS)的96孔板中,培養至細胞鋪滿底部60%～80%。分別設置空白對照組(CON)、模型組(Model)及4個雙歧桿菌組,每組3個重復。除空白對照組外,其余各組參考Li等[22]的方法均采用300 μmol/L的CORT刺激SH-SY5Y細胞,37 ℃作用24 h。抑郁細胞模型誘導成功后,分別用107、106、105CFU三個劑量的雙歧桿菌干預抑郁模型細胞,37 ℃干預4 h。最后,采用CCK 8法檢測細胞活性,A450 nm波長處測定其光吸收值。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次,選用SPSS(Version 22.0)軟件對試驗結果進行單因素Duncan法差異統計分析,P<0.05為顯著差異。數據以平均值±標準差表示,使用GraphPad prism 7軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株產BSH菌株的能力

BSH活性定量結果顯示,13株雙歧桿菌表現出較高的BSH活性,BSH活性范圍為:0.027～4.99 U/mL(圖1)。其中,雙歧桿菌98的BSH活性最高,為4.99 U/mL,顯著高于其他菌株(P<0.05)。而雙歧桿菌ZT3活性最低,為0.027 U/mL。隨后選取此13株雙歧桿菌進行下一步研究。

圖1 雙歧桿菌BSH活性Fig.1 Bile salt hydrolase activity of Bifidobacterium strains注:不同字母代表差異顯著,P<0.05,圖3同。

2.2 菌株的抗生素耐性

由表1可知,13株雙歧桿菌對氨基糖苷類抗生素均具有耐受性。除此之外,雙歧桿菌95、115和126對其他抗生素均敏感,雙歧桿菌ZT3、84和105耐1種抗生素,雙歧桿菌98、106、108和154分別耐2種抗生素,而雙歧桿菌90、91和92可耐3種抗生素。邱宏瑞[23]等研究也發現:雙歧桿菌對紅霉素、四環素較為敏感,而對氨基糖苷類(慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素)不敏感,這與本研究結果一致。

2.3 菌株的耐酸、耐膽鹽能力

通過計算酸化2 h前后的活菌數得知,13株雙歧桿菌均能在pH3的環境中存活,其中,雙歧桿菌ZT3、95、105、126、154和84的存活率相對較高,分別是86.3%、85.2%、71.4%、68.9%、67.1%和65.5%。但當pH降至2.0時,其生長受到明顯抑制,僅有ZT3(2.2%)、84(8.8%)和105(3.5%)三株菌有較低的存活率(圖2),三組之間差異顯著(P<0.05)。推測雙歧桿菌對pH2的酸性環境所產生的應激反應不足以消除酸脅迫帶來的不利作用。

高濃度的膽鹽對外源益生菌具有一定的殺滅能力,從圖2可以看出,在含0.3%膽鹽的培養基中培養3 h后,95、84和ZT3三株雙歧桿菌的存活率相對較高,分別為86.6%、72.7%和63.5%,三組之間差異顯著(P<0.05)。但培養時間延長至6 h時,大部分雙歧桿菌的生長受到明顯抑制,僅有雙歧桿菌84和ZT3具有較高的存活率,分別為65.8%和52.0%。這可能是因為隨著膽鹽處理時間的延長,其他雙歧桿菌細胞質溶解、膜內蛋白流出,進而導致菌體細胞的死亡[24],而動物雙歧桿菌的環境脅迫耐受能力高于其他雙歧桿菌。

表1 各株雙歧桿菌的藥敏試驗結果Table 1 Antibiotic resistance results of Bifidobacterium strains

圖2 雙歧桿菌對pH2.0和pH3.0的酸耐受性Fig.2 Effect of pH2.0 and pH3.0 on viability of different probiotics

注:加粗的數值表示該菌的MIC超過NCCLS規定的最低濃度。

2.4 菌株的粘附能力

由圖3可知,雙歧桿菌92的粘附能力最強,平均每個細胞粘附33.77 CFU/cell,顯著高于剩余菌株(P<0.05);其次是雙歧桿菌95,平均每個細胞粘附活菌數為23.23 CFU/cell;雙歧桿菌98和91的粘附能力也較強,分別為20.46和19.34 CFU/Cell。說明雙歧桿菌92、95、98和91在腸道具有較強的定植能力。不同菌株定植于腸道上皮細胞的能力不同,這可能與菌株表面存在的與粘附相關的物質(粘附素、脂磷壁酸等)有關。

圖3 不同雙歧桿菌粘附能力結果Fig.3 Ability of adhering by different probiotics

2.5 菌株產GABA的能力

為探究13株雙歧桿菌產GABA的能力,本試驗選用高效液相色譜法定量分析。由圖4可知,與對照組相比,雙歧桿菌98和95 GABA的產量顯著提高(P<0.05)。其中,雙歧桿菌98產GABA的能力最強,平均產量可達285.0 mg/L,其次是雙歧桿菌95,平均產量為232.8 mg/L。其余菌株的GABA產量相對較低,相比于對照組無顯著差異(P>0.05)。李理等[25]研究發現:植物乳桿菌NDC75017也可產生GABA,這與本研究結果一致,并推測合成GABA除受GAD及gadB基因影響,其他的合成支路相關酶以及基因也參與其中。

圖4 不同雙歧桿菌產GABA能力結果Fig.4 Ability of producing GABA by different probiotics注:***代表與對照組(Control)差異顯著,P<0.05。

2.6 菌株對抑郁癥細胞模型干預能力

由圖5可知,相比于對照組,模型組的細胞活性顯著降低(P<0.05)。其中,高、中、低3個劑量的雙歧桿菌98均能顯著緩解CORT誘導的細胞損傷(P<0.05);而雙歧桿菌95對緩解細胞損傷具有劑量依賴性,僅在高劑量下才有顯著效果(P<0.05)。上述GABA實驗證實雙歧桿菌95的GABA產量低于98,而中、低劑量的雙歧桿菌95未能緩解CORT誘導的細胞損傷,這可能與菌體濃度太低導致GABA合成量不足有關。

綜上所述,緩解CORT誘導的抑郁細胞活性存在菌株和劑量特異性,高劑量的雙歧桿菌98、95及中、低劑量的雙歧桿菌98具有緩解CORT誘導的細胞損傷的作用。

圖5 不同雙歧桿菌緩解抑郁的效果Fig.5 Antidepressive-like effect of different Bifidobacterium注:CON表示空白對照組;Model表示CORT誘導的抑郁細胞模型組;M+107表示抑郁細胞模型添加107 CFU益生菌組;M+106表示抑郁模型細胞添加106 CFU益生菌組;M+105表示抑郁模型細胞添加105 CFU益生菌組。*代表與CON組差異顯著,P<0.05;#代表與Model組差異顯著,P<0.05;##代表與Model組差異極顯著,P<0.01。

3 討論

雙歧桿菌作為潛在的功能菌株必須要通過抗生素安全性評價。本實驗結果顯示,13株雙歧桿菌均對氨基糖苷類抗生素耐藥。邱宏瑞[23]等研究也發現:雙歧桿菌對氨基糖苷類(慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素)不敏感,這與本研究結果一致。這可能是因為氨基糖苷類抗生素發揮其作用需要氧氣的參與,而雙歧桿菌是厭氧菌,因此普遍表現出對氨基糖苷類抗生素不敏感。

人體胃酸pH在2.0～3.0之間,小腸中膽鹽濃度在0.03%～0.3%之間,而食品在小腸停留的時間一般為1～4 h。因此,益生菌能夠耐酸耐膽鹽成為其發揮有益作用的必要條件之一。有研究發現9株雙歧桿菌在pH3酸性條件下的存活率皆高于95%[26],這高于本研究菌株的最高耐酸能力(86.6%),除環境應激反應外,菌株耐酸能力還可能與H+-ATP酶活性有關[27]。本實驗中13株雙歧桿菌都表現出膽鹽耐受性,這與朱宗濤等[19]研究一致。而乳酸菌的耐膽鹽機制與其本身的膽鹽水解酶和表面蛋白有關[28]。HT-29細胞粘附性試驗顯示,各菌株間的粘附能力有明顯差異,其中雙歧桿菌91、92、95和98表現出較強的粘附能力。本數據與李平蘭[29]等的研究結果類似,其研究發現雙歧桿菌的平均粘附能力為10.5 CFU/Cell。研究發現菌株S層表面蛋白或者脂磷壁酸在菌株的粘附過程中發揮重要作用[30-31],因此,本實驗菌株的粘附能力可能其S層表面蛋白、黏附素或者脂磷壁酸有關。

GABA是中樞神經系統中的神經遞質,其可在人體內產生抗應激作用,并與抑郁癥的改善有關。本文將13株雙歧桿菌在mMRS(3%谷氨酸鈉+0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽)培養基中37 ℃培養36 h后,篩選出2株高產GABA的雙歧桿菌98和95,產量分別為285.0、232.8 mg/L,而劉韓等[32]研究發現:長雙歧桿菌QYW-B-11在MRS(1%谷氨酸)培養基中37 ℃培養72 h后,GABA產量為60 mg/L,這低于本研究中菌株GABA產量,這可能與其培養基MRS中含1%谷氨酸的有關。人類神經母細胞瘤株是一種分化程度較低的腫瘤細胞,其生理生化功能與正常神經細胞相似[33]。而皮質酮可以通過損傷人類神經母細胞瘤株來模擬抑郁癥神經細胞的損傷狀態。由抑郁細胞模型試驗結果可知,雙歧桿菌98和95均能顯著提高CORT誘導的抑郁模型細胞的活性,與Li等[22]的結果類似,其證明了巴戟天中的活性寡糖菊粉對CORT誘導的細胞有明顯的保護作用。Cho等[16]研究發現:產GABA的布氏乳桿菌MS可以保護由化學物質誘導的神經細胞死亡。Strandwitz等[34]等試驗表明,高產GABA的Bacteroides與抑郁癥狀呈負相關。因此,高產GABA的益生菌在抑郁癥的治療中發揮著不可或缺的作用。

4 結論

本研究篩選出的青春雙歧桿菌95和98具有高產γ-氨基丁酸的能力,γ-氨基丁酸產量分別為285.0 mg/L和232.8 mg/L。抑郁細胞模型干預試驗初步證明:雙歧桿菌95和98均具有緩解抑郁模型細胞活性的功效,高、中、低劑量高產GABA的雙歧桿菌98都具有緩解CORT誘導的細胞損傷的能力,而雙歧桿菌95對緩解細胞損傷具有劑量依賴性，且只有在高劑量組下才有顯著效果(P<0.05)。