響應面法優化大黃魚魚卵油的酶法提取工藝

,2,2,2,*

(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002;2.福建農林大學海洋研究院,福建福州 350002)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea),又名大王魚、黃花魚、石頭魚,是中國重要的海水養殖魚類之一,其產量居海洋網箱養殖第一位,《2018中國漁業統計年鑒》中關于海水養殖魚類的統計數據顯示,大黃魚的養殖產量可達17.76萬噸,在我國漁業經濟中占據了重要地位[1]。它主要分布于中國東部和南部沿海水域,因其良好的口感和高營養價值而受到許多消費者的青睞[2-3]。

魚卵作為魚類的主要加工副產物,可加工的產品形式單一,高品質的魚卵可被加工成魚子醬[4],而其它一些魚卵通常未能有效利用,如大黃魚魚卵因其顆粒細,腥味重,在加工過程中經常被當做廢棄物處理,造成很大程度上的資源浪費[5]。研究表明魚卵油是長鏈n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)的主要來源之一,主要包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[6],它在促進人體健康、降低發炎反應、調節血脂和降低血管疾病發病率方面發揮了重要作用[7],但其富含的n-3PUFA在人體內不能合成,需要從外界攝入[8]。為進一步拓寬海洋魚油的來源,可以考慮將大黃魚魚卵作為原料提取魚油,但目前國內外對大黃魚魚卵油提取工藝方面的研究鮮見報道。

目前,魚油的提取方法主要有蒸煮法、淡堿水解法、酶解法、超臨界流體萃取法和試劑法等[9]。其中,酶解法條件溫和、易于控制,且所得油脂提取率高、品質好,近年來受到廣泛應用[10]。郝淑賢[11]等比較不同提取方法對魚油提取質量的影響,發現酶解法提取所得魚油量最多,提取率為79.44%,明顯高于鉀法、氨法和蒸煮法。許艷萍[12]等前期采用胰蛋白酶提取大黃魚內臟魚油,效果顯著,但對于酶解法提取大黃魚魚卵油的工藝尚未研究,故本研究在比較幾種酶對大黃魚魚卵油提取效果的基礎上,篩選出最佳的蛋白酶,并進一步通過響應面法優化最優酶對大黃魚魚卵油的提取工藝,以期為大黃魚魚卵資源綜合利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚魚卵 購買于福建宇輝食品實業有限公司;木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶 北京Solarbio公司;氫氧化鈉、鹽酸、石油醚 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

HJ-4A恒溫磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市宏華儀器廠;ST2100實驗室pH計 奧豪斯儀器(常州)有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;DL-5-B型離心機 上海安亭科學儀器廠;DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃魚魚卵油提取工藝流程 原料→調節液固比→攪拌→調pH→加酶→酶解→高溫滅酶→冷卻→離心(室溫)→分離→魚卵油[11]。

操作步驟:將新鮮大黃魚魚卵解凍后,稱取一定量放入燒杯中,按比例加水調節液固比(mL/g),待溶液攪拌均勻后,再用4 mol/L的NaOH溶液調至最佳pH,加入適宜量的蛋白酶在一定的溫度條件下酶解,酶解一段時間后90 ℃滅酶5 min,冷卻后分裝,在5000 r/min下離心20 min,分離出上層魚卵油。

1.2.2 蛋白酶的選擇 選取六種蛋白酶,分別在各自的建議酶解條件下對大黃魚魚卵進行酶解,具體見表1。其它條件保持一致,液固比2∶1 (mL/g),酶解時間3 h,酶添加量2%(以原料質量為基準),離心條件為5000 r/min,20 min。以魚卵油提取率為評價指標,選取提取效果最優的蛋白酶進行后續試驗。

表1 不同蛋白酶酶解條件對照表Table 1 Comparison table of enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

1.2.3 單因素實驗 以堿性蛋白酶為大黃魚魚卵提取魚油最優酶,其它條件保持一致,分別研究溫度、時間、pH、酶添加量、液固比對魚卵油提取率的影響。

1.2.3.1 酶解溫度對魚卵油提取率的影響 在液固比2.5∶1 (mL/g)、pH10、酶添加量2%,酶解時間3 h的條件下,分別取酶解溫度40、45、50、55、60 ℃,探究不同酶解溫度對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的酶解溫度。

1.2.3.2 酶解時間對魚卵油提取率的影響 在液固比2.5∶1 (mL/g)、pH10、酶添加量2%,酶解溫度55 ℃的條件下,分別取酶解時間1、1.5、2、2.5、3 h,探究不同酶解時間對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的酶解時間。

1.2.3.3 初始pH對魚卵油提取率的影響 在液固比2.5∶1 (mL/g)、酶添加量2%、酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h的條件下,調節pH為9、10、11、12、13,考察pH對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的pH。

1.2.3.4 酶添加量對魚卵油提取率的影響 在液固比2.5∶1 (mL/g)、酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h,pH12的條件下,考察酶添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%時對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的酶添加量。

1.2.3.5 液固比對魚卵油提取率的影響 在酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h,pH12,酶添加量2%的條件下,考察液固比分別為2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1 (mL/g)時對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的液固比。

1.2.4 響應面試驗 根據響應面試驗設計原理,在單因素實驗結果的基礎上,選擇酶解溫度、酶解時間和初始pH作為研究因素,并以提取率為響應值,進行三因素三水平的響應面設計與分析,試驗因素及水平設計如表2所示。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 大黃魚魚卵中脂肪的測定 按照《GB 5009.6-2016食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中索氏抽提法進行測定。

1.2.6 魚卵油提取率的計算

1.3 數據統計與分析

所有試驗均平行測定3次,采用SPSS 20.0軟件對數據進行Duncan檢驗,多重比較得差異顯著性分析結果(P<0.05);采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析;采用Origin 9.0軟件作圖,數據以“平均值±標準差”顯示。

2 結果與分析

2.1 脂肪含量

通過試驗測定,結果顯示新鮮大黃魚魚卵中的脂肪含量為12.2%。

2.2 蛋白酶的選擇

由圖1可知,不同蛋白酶的提取率之間差異性顯著。復合蛋白酶的提取率最低,僅有32.62%,其次是胰蛋白酶43.39%,木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶三者較接近,分別為50.95%、54.88%與59.08%,而堿性蛋白酶的提取效果最好,提取率可達61.76%,約為復合蛋白酶提取效果的2倍。Gbogouri[13]等以新鮮鮭魚頭為原料,利用堿性蛋白酶對其進行酶解,魚油提取率為19.8%;Al-Sayed-Mahmoud[14]等用多種蛋白酶水解虹鱒魚魚籽,結果發現在堿性蛋白酶的作用下,魚油提取率為38.5%,相對最高;白冬[15]選用堿性蛋白酶作為實驗用酶,對鰹魚內臟進行酶解,魚油提取率高達57.76%。

圖1 不同蛋白酶對魚卵油提取率的影響Fig.1 Effect of different proteases on extraction rate of fish roe oil注:不同小寫字母代表有顯著性差異(P<0.05)；圖2～圖6同。

堿性蛋白酶是由培育的地衣芽孢桿菌發酵而得,主要成分為枯草桿菌蛋白酶,是一種內肽酶,它最適pH范圍內的取值大于其余五種蛋白酶,表明大黃魚魚卵在堿性較強的環境中容易分離出油脂,因此本研究均采用堿性蛋白酶作為提取魚卵油工藝的最優酶。

2.3 單因素實驗

2.3.1 酶解溫度對魚卵油提取率的影響 由圖2可知,隨著溫度的升高,魚卵油提取率先呈現上升趨勢,在55 ℃的時候達到最高,緊接著又出現下降趨勢。由于升溫可以增加分子間動能和促進分子擴散,有利于油脂的溶出,而溫度過高又會破壞酶的活性,使蛋白酶變性失活,酶解能力下降,魚油提取率也相應地降低[16]。所以,選用55 ℃作為最適溫度。

圖2 酶解溫度對魚卵油提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of fish roe oil

2.3.2 酶解時間對魚卵油提取率的影響 由圖3可知,在2 h之前,隨著時間的延長,魚卵油提取率不斷增加,2 h時提取效果最好,2 h以后提取率反而下降。這是由于時間過短,酶與底物的結合不夠充分,不能徹底釋放出油脂,而魚卵油屬于海洋魚油,富含不飽和脂肪酸(UFA),酶解時間過久又會致使魚油氧化分解,不飽和脂肪酸總量呈降低趨勢,同時,時間的延長也會導致酶活力的下降,所以魚油提取率降低,魚油品質也隨之變差[12]。故選2 h為最佳酶解時間。

圖3 酶解時間對魚卵油提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction rate of fish roe oil

2.3.3 初始pH對魚卵油提取率的影響 從圖4可以看出,在pH9.0～13.0的范圍內,提取率隨著pH的增加出現先上升后下降的趨勢,當pH為12.0時,酶解效果最好。堿性蛋白酶在一定條件下有其最適合的pH取值范圍,pH的不同導致酶活力不同,進而出現魚卵油提取率高低不一的結果。酶的最適pH也不是固定不變的,它受很多外在因素的影響,會因底物的不同和溶液濃度的差異而發生改變[17]。pH較小時,魚卵油提取率較低,分析原因可能是底物沒有完全酶解,增強堿性至該環境下堿性蛋白酶的最適pH,可使酶活增加,促進其水解,釋放更多油脂分子,但是pH過高時,反應體系中會發生油脂的皂化反應,從而導致提取率的下降[18]。故選定pH12進行后續實驗。

圖4 初始pH對魚卵油提取率的影響Fig.4 Effect of initial pH on extraction rate of fish roe oil

2.3.4 酶添加量對魚卵油提取率的影響 從圖5可以看出,提取率隨酶量的增加基本呈不斷上升的趨勢,酶添加量1%～3%時上升緩慢,3%以后上升加快。雖然酶加量2%與3%之間的差異性不顯著,但這兩組與其他三組1%、4%、5%相比較,差異顯著(P<0.05)。可能是酶加量較少時,單位體積內與底物接觸的蛋白酶較少,酶解不充分,隨著酶量的增加,原料與接觸的機會越來越多,反應加快,促使油脂從底物中分離出來,提高提取率。但是考慮到在實驗過程中,酶加量4%以后油脂的分離較難及蛋白酶購買成本較高,最終選取4%為蛋白酶最佳添加量。

圖5 酶添加量對魚卵油提取率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction rate of fish roe oil

2.3.5 液固比對魚卵油提取率的影響 從圖6可知,液固比對魚卵油提取率的影響不顯著。液固比2.0∶1～2.5∶1之間魚卵油提取率略微有所上升,2.5∶1以后呈緩慢的下降趨勢。液固比較小時,溶液濃度較大,過于黏稠,酶與底物接觸不均勻,酶解反應不能充分進行,故魚卵油提取率較低。液固比過大,體系內含水量的增加會致使底物和酶濃度偏低,影響酶解反應速率,導致提取結果變差,另外,提高液固比也不利于后期魚卵油的分離。綜上所述,選2.5:1(mL/g)為最佳液固比。

圖6 液固比對魚卵油提取率的影響Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of fish roe oil

2.4 響應面法優化大黃魚魚卵油的提取工藝

2.4.1 試驗設計方案及結果 根據表2選定的響應面考察因素和水平,通過Box-Behnken方法設計得到17組試驗,具體方案及結果見表3。

表3 響應面試驗設計方案及結果Table 3 Experiment design and results of response surface methodology

2.4.2 模型建立與方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數據進行分析,得到魚卵油提取率與各因素之間的二次多元回歸擬合方程為:

Y=80.45+2.60A-0.34B+7.78C+3.31AB+4.56AC+1.28BC-5.01A2-8.26B2-5.48C2

由表4可知,P<0.0001,表明該二次多項模型顯著性極好,試驗方法可靠;決定系數R2=0.9904,說明回歸方差模型擬合度較好,因為R2越接近于1,該模型就越能更好地體現出試驗結果;Adeq Precision(精密度)=27.424>4,表明模型可用,足以擬合試驗結果;CV(變異系數)=1.83%<10%,則說明試驗具有較好的穩定性,結果精確可靠。在該方差分析中,F值體現各單因素對魚卵油提取率影響的大小,F值越大,提取效果越好,從表中可以看出C>A>B,即對魚卵油提取率的影響,初始pH>酶解溫度>酶解時間。

2.4.3 響應面分析 響應面法有著正交試驗所不具備的特點,它可以給出直觀的圖形,考察兩個因素之間的交互作用對魚卵油提取率的影響[19]。等高線圖的形狀為圓形時,表示兩因素之間的交互作用不顯著;當它為橢圓或鞍馬形時,表示兩者交互作用顯著。另外,響應面圖中曲面的陡峭程度能直觀反映單因素對響應值提取率影響的大小[20]。

表4 二次響應面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic respoase surface regression model

注:**差異極顯著(P<0.01);*差異顯著(P<0.05)。在圖7中,交互作用項酶解時間和酶解溫度的等高線呈橢圓形,說明兩者交互作用顯著。從響應曲面圖可以看出,在B(時間)為2 h的水平和A(溫度)為55 ℃的水平上,提取效果最好。表明提取率隨酶解時間和酶解溫度的增加而增加,時間過長或者溫度過高反而會造成提取率的下降。

圖7 酶解溫度和酶解時間對提取率影響的響應面圖及等高線圖Fig.7 Response surface plots and contour plots showing the effects of enzymolysis temperature,enzymolysis time on extraction rate

圖8 初始pH和酶解溫度對提取率影響的響應面圖及等高線圖Fig.8 Response surface plots and contour plots showing the effects of initial pH,enzymolysis temperature on extraction rate

在圖8中,交互作用的等高線為橢圓形,表明交互作用項酶解pH和酶解溫度間的交互作用顯著。由等高線圖可以看出,最高的提取率對應的溫度范圍為56～58 ℃、pH范圍為11.5～12,則表示這兩個范圍對提取率的影響顯著。在響應曲面圖中,A(酶解溫度)為56 ℃的水平和C(酶解pH)為12的水平提取效果最佳,說明在選定的溫度范圍內,隨溫度的上升,提取率先增加后降低;而在選定的pH范圍內,隨pH的加大,提取率不斷上升。

在圖9中,等高線呈圓形,表明酶解時間和酶解pH之間的交互作用不顯著。由響應曲面圖可以看出,在因素C(酶解pH)為12的水平和因素B(酶解時間)為2 h的水平下魚卵油提取率最高,隨著設定范圍內pH的增加,提取率一直呈上升趨勢,而隨著酶解時間的延長,提取率先升高,2 h時效果最佳,以后則出現下降趨勢。

圖9 初始pH和酶解時間對提取率影響的響應面圖及等高線圖Fig.9 Response surface plots and contour plots showing the effects of initial pH,enzymolysis time on extraction rate

2.4.4 驗證試驗 經響應面試驗,最終優化出的工藝參數為:溫度58.92 ℃、時間2.11 h、pH12.00,此條件下魚卵油提取率的預測值為85.65%。考慮到實際情況,將上述最佳條件調整為溫度58.9 ℃、時間2.1 h、pH12.0,并按照此條件進行3次重復性實驗,得到的提取率為86.29%±0.04%,與回歸方程理論魚卵油提取率85.65%±0.02%非常接近。因此,該響應面試驗可行性良好,優化出的工藝條件可靠、有效。

3 結論

通過采用響應面法優化大黃魚魚卵油的酶法提取工藝,以大黃魚中魚卵油的提取率為響應值進行響應面分析,結果表明,對魚卵油提取率的影響,初始pH>酶解溫度>酶解時間;優化出的最佳工藝參數為:溫度58.9 ℃、時間2.1 h、pH12.0,此條件下得到的魚卵油提取率為86.29%±0.04%,與預測值十分接近,方法可靠。由此可見,該工藝條件的建立可為利用大黃魚魚卵開發魚卵油奠定基礎,也為本課題的后續深入研究提供了理論依據和參考數據。