酶法制備阿拉斯加鱈魚降壓肽的工藝優化及其產物的結構鑒定

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(1.濱州醫學院藥學院,山東煙臺 264003;2.中國科學院煙臺海岸帶研究所,山東煙臺 264003)

目前,心臟與心腦血管疾病,特別是心血管系統疾病中的高血壓是威脅世界各國人們健康的重要原因。調查發現,全球高血壓患者已超過14億人口[1],因此降壓藥物的開發已成為科學家們關注的熱點。臨床上常用的抗高血壓藥物有血管緊張素轉化酶抑制劑(Angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)和血管緊張素II(AngII)受體拮抗劑。在腎素-血管緊張素系統中,血管緊張素轉化酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)可以將無活性的多肽血管緊張素I(AngI)催化酶解,得到八肽的血管緊張素II(AngII),AngII可以強烈收縮外周小動脈,促進腎上腺皮質激素的合成以及分泌醛固酮的作用,從而升高血壓[2-3]。

目前,臨床治療高血壓大多采用無機、人工合成的ACE抑制劑類藥物,但長期服用會產生各種副作用。近年來,食源性蛋白肽作為一種新的非合成的ACE抑制劑類藥物,由于其副作用小、安全性高等優點[4]受到很多研究者的青睞。人們已經從動物和植物蛋白的酶解物中獲得了具有降壓活性的肽片段。1986年,Feerreira等[5]首次從南美蝮蛇毒液中提取得到ACE抑制肽。很多研究者也從大豆、麥胚中制備得到ACE抑制肽[6]。相比于陸源生物活性多肽,海洋生物活性多肽更容易釋放出獨特的活性肽段,產生更好的降壓作用[7]。

阿拉斯加鱈魚為冷水性近底層魚類,魚皮中含有豐富的蛋白質,較魚體的其他部分蛋白含量更高,但常作為下腳料被丟棄,造成大量水產資源的浪費及環境污染。利用鱈魚加工副產物為原料,采用酶解法制備得到降壓肽,并通過體外實驗驗證阿拉斯加鱈魚降壓肽的ACE抑制活性。為魚皮的高值化綜合利用提供途徑,并為進一步開發新型海洋天然降血壓活性物質提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

阿拉斯加鱈魚皮 煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司;堿性蛋白酶(20萬U/g)、胰蛋白酶(250 N.F.U/mg)、酸性蛋白酶(5萬U/g)、菠蘿蛋白酶(50萬U/g)、木瓜蛋白酶(80萬U/g)、復合蛋白酶(10萬U/g) 北京索萊寶科技有限公司;馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate,HHL)、血管緊張素轉化酶 Sigm-aldrich西格瑪奧德里奇貿易有限公司;其他試劑 均為分析純或色譜純。

高速離心機(Avanti JXN-26) 貝克曼庫爾特有限公司;紫外分光光度計(Cary 60) 安捷倫科技有限公司;高效液相色譜儀(Agilent1260) 安捷倫科技有限公司;高效液相色譜儀(Waters 1525) 沃特世科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿拉斯加鱈魚皮水提原液的制備 將鱈魚皮清洗干凈,剪成方塊狀(1 cm×1 cm),組織勻漿機絞碎。加入15%的正丁醇溶液,4 ℃下攪拌8 h進行脫脂。濾出溶液,適量去離子水(鱈魚皮體積的3倍)充分攪拌清洗。0.1 mol/L的NaOH溶液4 ℃繼續攪拌10 h 除去雜蛋白。蒸餾水攪拌清洗至無味。經脫脂和除雜蛋白處理后的魚皮中加入適量去離子水(料液比為1∶10),60 ℃水浴中攪拌提取,得到鱈魚皮水提原液。冷凍干燥得到鱈魚皮凍干粉,4 ℃儲存。

1.2.2 阿拉斯加鱈魚皮酶解液的制備 稱取72 g阿拉斯加鱈魚皮凍干粉(經1.2.1法制備得到),溶于360 mL去離子水(料液比為1∶5),充分混勻,以此溶液作為底物。表1列出了6種蛋白酶的最佳酶解條件。調節底物溶液為相應蛋白酶的最佳酶解溫度和pH,分別加入3.6 g的酶(酶與底物的質量比為5%),酶解3 h后,將6種底物溶液經沸水水浴15 min,終止酶解反應[8-10]。冷卻至室溫,離心(4000 r/min,15 min,4 ℃),取上清液低溫冷凍干燥得到酶解液凍干粉,4 ℃備用。

表1 6種蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic conditions of 6 kinds of proteinases

1.2.3 ACE抑制率的檢測 ACE抑制率的檢測參照文獻中的方法進行[11-14]。將上述阿拉斯加鱈魚酶解液凍干粉分別溶于適量蒸餾水中,0.5 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調節各溶液至相同pH(pH=7)。將ACE和HHL分別溶解在pH8.3,0.1 mol/L的硼酸鈉緩沖溶液(含0.3 mol/L的NaCl),其中NaCl的濃度為0.3 mol/L,ACE溶液的酶活力為0.1 U/mL,HHL溶液的濃度為0.005 mol/L。取20 μL ACE溶液和80 μL上述酶解液凍干粉溶液(對照組加入等量的硼酸鈉緩沖溶液)于4 mL離心管中混合均勻。在37 ℃環境下保溫5 min后,向各個離心管中加入0.005 mol/L HHL溶液170 μL,混合均勻后,在37 ℃環境下保溫30 min。繼續向每個離心管中加入150 μL 1 mol/L的HCl溶液,搖動使其混合均勻,終止反應。最后向每個離心管中加入1 mL的乙酸乙酯,漩渦振蕩30 s,離心(4000 r/min,15 min)。靜置5 min,當有機層與水層完全分層后,移取0.8 mL有機層于5 mL離心管中,將離心管置于80 ℃水浴鍋中揮干乙酸乙酯,最后向殘渣中加入3.2 mL的去離子水使其充分溶解,測定該溶液在228 nm處的吸光度值(A228)。

I(%)=(A0-A1)/A0×100

其中:I為ACE抑制率;A0為對照組的吸光度值;A1為供試品的吸光度值。

1.2.4 胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的工藝條件優化

1.2.4.1 pH對ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標,在溫度為37 ℃,料液比為1∶5,酶解時間為180 min,酶與底物質量比為5%的條件下研究不同pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)對ACE抑制肽的影響[15-16]。

1.2.4.2 料液比對ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標,在溫度為37 ℃,pH=8.0,酶解時間為180 min,酶與底物質量比為5%的條件下研究不同料液比(1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8)對ACE抑制肽的影響[17]。

1.2.4.3 溫度對ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標,在pH=8.0,酶解應時間為180 min,料液比為1∶7,酶與底物質量比為5%的條件下研究不同溫度(30、37、40、50、60 ℃)對ACE抑制肽的影響[8,18]。

1.2.4.4 酶解時間對ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標,在料液比為1∶7,pH=8.0,溫度為50 ℃,酶與底物質量比為5%的條件下研究不同酶解時間(90、120、150、180、210 min)對ACE活性抑制肽的影響[16]。

1.2.4.5 酶與底物質量比對ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標,在料液比為1∶7,pH=8.0,溫度為50 ℃,酶解時間為180 min的條件下研究不同酶與底物質量(0.5%、2%、3.5%、5%、6%)比對ACE抑制肽的影響[9]。

1.2.5 正交試驗設計 在上述工藝優化實驗的基礎上,采用L18(37)正交表對胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的條件進行進一步優化,以ACE抑制率為指標,確定制備阿拉斯加鱈魚降壓肽最佳酶解工藝。如下表3所示為正交試驗的水平與因素設計[19-20]。

表2 正交試驗設計因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal experiment design

1.2.6 SDS-PAGE分析 采用5%濃縮膠和18%分離膠對最佳酶解條件下制備的阿拉斯加鱈魚皮酶解液的分子量進行測定[21-22],上樣量為10 μL[23]。

1.2.7 分子量分布考察 對最優酶解工藝下的酶解液采用HPLC法和三重串聯四級桿液質聯用儀進行分子量分布考察[24]。

HPLC法色譜條件:色譜柱:TSK gel 2000 SWXL300 mm×7.8 mm,流動相:乙腈-水-三氟乙酸45∶55∶0.1,等度洗脫,檢測波長:220 nm,流速0.5 mL/min,柱溫:30 ℃[25-27]。

質譜檢測條件:進樣量10 μL,離子源:ESI,質量掃描范圍為100～1400 u,正離子譜檢測。

1.2.8 氨基酸含量測定 采用OPA柱前衍生RP-HPLC-UV法對最佳酶解條件下的酶解液中的17種氨基酸的含量進行測[28-29]。檢測條件:色譜柱:ODS柱(5 μm,4.0 mm×250 mm),流動相:乙酸鈉-甲醇-乙腈-乙酸鈉-三乙胺-四氫呋喃;梯度洗脫:0～17 min:8% B～50% B;17～20 min:50% B～100% B;20～24 min:100% B～0% B;檢測波長:338 nm;流速:1 mL/min,柱溫40 ℃[30-31]。

1.3 數據處理

數據均以平均值±標準差的形式表示,采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶的選擇

本實驗采用酶解法制備得到阿拉斯加鱈魚ACE抑制肽,不同蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的能力不同,因此酶的選擇對ACE抑制肽的制備至關重要。下表3為6種不同蛋白酶的酶解效果比較。

由表3可知,6種蛋白酶的酶解物對ACE均有抑制作用,其中,胰蛋白酶的酶解能力最佳,ACE抑制率為68.48%±2.96%,即胰蛋白酶酶解產物對ACE的抑制活性最佳。因此,胰蛋白酶可作為酶解阿拉斯加鱈魚皮的最適酶種,復合蛋白酶的活性與菠蘿蛋白酶的活性次之,ACE抑制率分別為63.56%±7.87%和62.70%±4.78%;其他3種蛋白酶的ACE抑制率均小于60%。不同的蛋白酶的酶切位點不同,6種蛋白酶酶解出來的肽段的氨基酸組成不同,釋放出來的肽段序列各異,長短不一,活性會有較大差異,對ACE的抑制率影響也不同。

表3 6種不同蛋白酶的水解效果比較Table 3 Comparison of hydrolysis by 6 kinds of proteinases

注:*:與對照組(未加酶)比較,差異顯著(P<0.05),**:與對照組(未加酶)比較,差異極顯著(P<0.01)。

2.2 胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的工藝條件優化

2.2.1 pH對ACE抑制肽的影響 pH對ACE抑制肽的影響如圖1所示。結果表明:在pH7.0～9.0的范圍內,隨著pH的增大,ACE抑制率呈現先增大后減小的趨勢,其中pH=7.5時,ACE抑制率最高,為73.19%。分析主要原因是胰蛋白酶在過堿性條件下,酶的構象發生變化,酶出現了不可逆失活[32]。因此,胰蛋白酶在弱堿性條件下酶解活性較高。

圖1 pH對ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of different pH on ACE inhibitory rate注:不同字母表示具有顯著性差異,P<0.05;圖2～圖5同。

2.2.2 料液比對ACE抑制肽的影響 料液比對ACE抑制肽的影響如圖2所示。結果表明:在料液比1∶4～1∶7時,隨著料液比的不斷升高,ACE抑制率呈現上升的趨勢。當料液比為1∶7時,ACE抑制率達到最大值,為72.87%;當料液比由1∶7增加至1∶8時,ACE抑制率略有下降,為72.02%?？赡苁怯捎诜磻w系中底物濃度較大,酶活是一定的,隨著料液比進一步增大,抑制率變化不明顯[33]。因此,選擇料液比為1∶7最為合適。

圖2 料液比對ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on ACE inhibitory rate

2.2.3 酶解溫度對ACE抑制肽的影響 酶解溫度對ACE抑制肽的影響如下圖3所示。結果表明:在30～60 ℃范圍內,隨著酶解溫度的升高,ACE抑制率也隨之升高。說明隨著溫度升高,酶的結構未變化,活性也隨之升高[18]。當溫度為50 ℃時,ACE抑制率達到最大值,為79.26%。且隨著溫度升高,抑制率趨于平穩,所以50 ℃為優選溫度。

圖3 酶解溫度對ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on ACE inhibitory rate

2.2.4 酶解時間對ACE抑制肽的影響 酶解時間對ACE抑制肽的影響如圖4所示。結果表明:隨著酶解時間的增加,在酶解時間為90～210 min范圍內,抑制率呈現先增大后減小的趨勢。當酶解時間為150 min時,抑制率達最大值,為75.66%。這可能是因為酶解時間越長,活性肽段的釋放率越高,但隨著酶解時間進一步延長,一些釋放出的活性肽段會在蛋白酶的作用下被進一步酶解為無活性的分子,ACE抑制率也會隨之降低[34]。

圖4 酶解時間對ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on ACE inhibitory rate

2.2.5 酶與底物質量比對ACE抑制肽的影響 酶與底物質量比對ACE抑制肽的影響如圖5所示。結果表明,在酶與底物質量比為0.5%～2%的范圍內,隨著酶與底物質量比的增加,阿拉斯加鱈魚皮蛋白肽被不斷降解成小分子肽段,該反應體系的ACE抑制活性隨之增加。當酶與底物質量比為2%時,抑制率達最大值,為70.06%。當ACE抑制肽被酶飽和后,酶的濃度不再是影響酶解反應的主要因素。進一步增加酶與底物質量比反而降低了活性肽段占蛋白肽的比重,導致酶解速率減慢,ACE抑制率呈下降趨勢[35]。

圖5 酶與底物質量比對ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of mass ratio of enzyme to substrate on ACE inhibitory rate

2.3 正交試驗結果

采用正交試驗優化制備阿拉斯加鱈魚皮的酶解條件,正交試驗結果如表4所示。

表4 正交試驗設計與結果分析Table 4 Orthogonal test design and result analysis

由表4可知,各因素影響胰蛋白酶活性大小的順序為A>D>C>E>B,即溫度對胰蛋白酶活性的影響最大,其次為酶與底物質量比、料液比、pH,時間對其影響最小。

根據結果可知,最佳的酶解組合為A1B1C2D3E1,即酶解溫度40 ℃,酶解時間2 h,料液比1∶7,酶與底物質量比3%,pH=7.0時胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的效果更好,抑制率可達79.62%。

2.4 SDS-PAGE分析

阿拉斯加鱈魚低聚肽的SDS-PAGE電泳分析如圖6所示。結果表明,未酶解的阿拉斯加鱈魚皮水體原液的條帶分布不一,經酶解的低聚肽溶液未見明顯條帶,需要進一步借助高效液相色譜法來測定低聚肽酶解液的分子質量分布。

圖6 SDS-PAGE電泳分析Fig.6 SDS-PAGE analysis

2.5 分子量分布考察

相比大分子蛋白質和單一的氨基酸,二肽和三肽分子量較小(3～500 kDa),所以更易被人體直接吸收[36],因此分子量分布的考察極為重要。該部分通過HPLC法對最優酶解條件下的酶解液進行了分子量分布考察。從表5(由圖7經計算分析可得)可以看出,分子量低于1000 Da的阿拉斯加鱈魚降壓肽占總體的93.08%,分子量在500 Da以下的占總體的70.74%,平均分子量為457.5 Da。研究發現:最大三肽(Trp-Trp-Trp)和最小二肽(Gly-Gly)的分子量分別為576 u和132 u[37],因此處于這個區域之內的肽段主要為二肽和三肽。對最優酶解條件下的酶解液進行質譜分析(圖8)可以得出與HPLC法相同的結論:在圖譜中可見質子峰多集中的m/z范圍為200～500。這說明在最佳酶解條件下,阿拉斯加鱈魚皮酶解得到了以二肽和三肽為主的降壓肽。譜圖中含有多種不同信號強度的質子峰,這說明最佳酶解條件的酶解液是含有多種不同分子量的多肽混合物。

圖7 阿拉斯加鱈魚低聚肽酶解液的液相色譜圖Fig.7 Chromatogram of enzymatic hydrolysate注:圖中數值代表Mp值(最高位峰的分子量)。

分子量范圍(Da)保留時間(min)峰面積百分比(%,λ220nm)>200015.0401.282000～100016.5035.641000～50017.67122.34500～18019.14748.19<18019.78322.55

圖8 阿拉斯加鱈魚低聚肽酶解液的質譜圖Fig.8 MS spectrum of enzymatic hydrolysate

2.6 酶解液氨基酸含量測定結果

對最優酶解工藝條件下的酶解液進行氨基酸含量測定,測定結果如表6所示。阿拉斯加鱈魚皮酶解液中氨基酸總含量約為83%,其中Gly含量最高,為29.41%,Pro含量次之,可達16.11%;人體必需氨基酸約占氨基酸總含量的18.9%。相比牡蠣ACE抑制肽,鱈魚皮降壓肽中氨基酸總含量更高[35]。與從羅非魚魚鱗膠降壓肽的氨基酸組成幾乎相同,但鱈魚皮降壓肽中Gly和Pro含量更高[38]。其中,在人體中樞神經系統中,Gly是最重要的神經遞質之一。甘氨酸通過PTEN/AKT信號通路發揮對大鼠的神經保護作用,減輕大鼠的腦出血損傷[39]。脯氨酸是體內合成蛋白質的氨基酸之一,為細胞新陳代謝提供了物質基礎[40]。降壓肽中脯氨酸的含量較高會對多肽的ACE抑制作用起到很好的促進作用[38]。

表6 酶解液的氨基酸組成Table 6 Amino acid composition of enzymatic hydrolysate

注:表中標注*為必需氨基酸。

3 結論

本研究以ACE抑制率為指標,比較了6 種蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的能力。通過工藝優化實驗確定最佳工藝為:胰蛋白酶酶解溫度40 ℃,酶解時間2 h,料液比1∶7,酶與底物質量比3%,pH=7。最優工藝的酶解液ACE抑制率為79.62%。分子量在500 Da以下的占總體的70.74%;酶解液氨基酸總含量為83%,其中Gly含量最高,為29.41%,Pro含量次之,可達16.11%;酶解液中含有7種必需氨基酸,分別是Ile、Leu、Met、Val、Phe、Lys、Thr。阿拉斯加鱈魚皮酶解液在體外研究中具有很好的ACE抑制活性,未來在功能性食品的開發應用中將具有很高的研究價值。