響應面法優化靈芝孢子粉高壓脈沖電場破壁工藝

(山西農業大學工學院,山西太谷 030801)

靈芝[Ganodermalucidum(Ley.ex.Fr)Karst.]屬于無褶菌目,靈芝科,靈芝屬,別名靈芝草、仙草等,是一種食藥兼用的大型真菌,且在我國分布廣泛[1-2]。近年來,靈芝中的活性物質,如靈芝多糖、總三萜等均能夠被有效分離出來[3-5]。這些生物活性物質主要富集在靈芝孢子中[6],具有抗腫瘤[7-8]、增強免疫[9-10]、改善睡眠[11]、抗抑郁[12]、消炎止血[13]、抗癌[14]等功效。

靈芝孢子壁是由支柱連接的雙層結構[15],十分堅韌且耐酸耐堿,致使孢子內部的營養物質不能很好的溶出。當靈芝孢子粉進入人體后很難被胃液消化,從而阻礙了人體對營養物質的吸收。目前,靈芝孢子粉大多采用生物酶解法、化學法、物理法、機械法以及綜合法的破壁工藝,其中生物酶解法和化學法處理過程較為耗時、破壁率較低,且破壁后不容易將加入的酶以及化學物質去除;物理法和機械法投資成本高,破壁后碎片太多[16]。

高壓脈沖電場(High Vltage Pulsed Electrical Field)技術是一種非熱力殺菌技術[17],它利用細胞膜電穿孔原理,短時間內對細胞壁和細胞膜造成破壞,致使細胞破壁[18]。Mohsen[19]綜述了高壓電場在食品工業中的應用,包括食品干燥、冷藏、冷凍、解凍、延長食品貨架期和提取生物化合物等。我國高壓脈沖電場更多地應用于細胞內物質的輔助提取[20-22]以及藻類的破壁[23]。高壓脈沖電場破壁技術具有無污染,耗時短,產生的熱能少等優點,且也不會產生過多碎片。為優化靈芝孢子粉破壁工藝,本試驗以靈芝孢子粉為試驗對象,以電場強度、脈沖個數和脈沖寬度為試驗因子進行響應面優化試驗,為破壁靈芝孢子粉的生產和高壓脈沖電場技術的新領域應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

未破壁靈芝孢子粉 由山西農業大學食用菌中心提供；硫酸鋅、無水乙醇、乙酸乙酯、高氯酸 均為分析純，天津市凱通化學試劑有限公司;葡萄糖、熊果酸 均為標準品，合肥博美生物科技有限公司;香草醛 分析純，北京索萊寶科技有限公司。

ECM830型高壓脈沖電場發生器 美國BTX儀器公司;CMM-15E型透反射金相顯微鏡 上海長方光學儀器有限公司;DHG-9023A型熱風干燥箱 無錫三鑫精工電氣設備有限公司;超聲波清洗機 深圳市潔盟超聲清洗機有限公司;BTX 610電極杯(物料添加區寬度規格為1 mm) 香港友誠生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 靈芝孢子粉試樣處理及破壁率測定

1.2.1.1 靈芝孢子粉破壁工藝 工藝流程:靈芝孢子粉→配液→高壓脈沖電場破壁→60 ℃干燥→待測。

取500 μL 0.05 g/mL靈芝孢子粉標準懸浮液定容于50 mL,混勻后取適量移入電極杯,設定相應的電場強度、脈沖個數和脈沖寬度,置于高壓脈沖電場發生器中進行破壁試驗,得到破壁靈芝孢子粉樣液。破壁過程中,懸浮液溫度有升高現象,經測定最高溫度不超過40 ℃。

1.2.1.2 靈芝孢子粉破壁率標準曲線繪制 分別稱取靈芝孢子粉0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 g,使用0.07 g/mL硫酸鋅定容于50 mL容量瓶,各取10 μL于400倍顯微鏡下觀察并計數。測定得靈芝孢子粉標準曲線的回歸方程為:y=989.31839x+0.7085,R2=0.9989。式中:y代表每個計數單位的孢子數(個);x代表未破壁靈芝孢子粉稱樣量(g)。

1.2.1.3 靈芝孢子粉破壁率測定 參照倪偉鋒等人[24]改進的破壁率測定方法進行測定。經高壓脈沖電場處理后的靈芝孢子粉樣液60 ℃烘箱中烘干,于1.5 mL離心管4 ℃避光冷藏。稱取0.10 g使用0.07 g/mL硫酸鋅定容于50 mL容量瓶,取10 μL于血球計數板上,400倍顯微鏡下觀察并記錄完整孢子數。其中,完整孢子為未破壁孢子,除完整孢子外其余均視為已破壁孢子。破壁率按下式計算。

X(%)=(N1-N2)/N1×100

式中:X-靈芝孢子粉的破壁率(%);N1-從標準曲線查到的與待測樣品相同質量的完整孢子個數;N2-計數得到的破壁孢子粉樣品中完整孢子的個數。

1.2.2 單因素實驗 影響靈芝孢子粉破壁率的主要因素有:電場強度、脈沖個數、脈沖寬度,分別考察它們對靈芝孢子粉破壁率的影響。

1.2.2.1 電場強度對靈芝孢子粉破壁率的影響 固定脈沖個數30000個,脈沖寬度50 μs,考察電場強度(10、15、20、25、30 kV/cm)對靈芝孢子粉破壁率的影響。

1.2.2.2 脈沖個數對靈芝孢子粉破壁率的影響 固定電場強度20 kV/cm,脈沖寬度50 μs,考察脈沖個數(10000、20000、30000、40000、50000個)對靈芝孢子粉破壁率的影響。

1.2.2.3 脈沖寬度對靈芝孢子粉破壁率的影響 固定電場強度20 kV/cm,脈沖個數30000個,考察脈沖寬度(10、30、50、70、90 μs)對靈芝孢子粉破壁率的影響。

1.2.3 響應面試驗 在1.2.2單因素實驗的基礎上,根據單因素試驗結果進行響應面試驗設計。以靈芝孢子粉破壁率為響應值,以電場強度(A)、脈沖個數(B)以及脈沖寬度(C)為試驗因子,共17個試驗點,進行三因素三水平響應面試驗。試驗因子水平編碼表見表1。

表1 靈芝孢子粉高壓脈沖電場響應面試驗因子水平編碼表Table 1 The code table of factors and levels for high-voltage pulsed electric field response surface test of ganoderma spores powder

1.2.4 靈芝孢子粉活性物質溶出量測定

1.2.4.1 靈芝孢子粉粗多糖溶出量的測定 多糖溶出量按照NY/T1676-2008苯酚-硫酸法[25]進行測定。

以0.1 mg/mL葡萄糖溶液為標準品,以葡萄質量(mg)為橫坐標,吸光值為縱坐標,得葡萄糖質量與吸光值的回歸方程為:y=0.0106x+0.0008,R2=0.9980。稱取破壁靈芝孢子粉0.25 g,經超聲提取后離心,殘渣洗入刻度試管,沸水浴2 h,待冷卻至室溫后,過濾后合并洗滌液,加水定容至刻度。測定時取1 mL待測液,加入蒸餾水、苯酚、濃硫酸,30 ℃水浴保溫20 min,于490 nm處比色,測定其吸光值。樣品中的粗多糖溶出量以質量分數(%)表示,結果按式(1)計算。

式(1)

式中:m1-從標準曲線上查得樣品測定液中含葡萄糖量(μg);V1-樣品定容體積(mL);V2-比色測定時所移取樣品測定液的體積(mL);m2-樣品質量(g);0.9-葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數。

1.2.4.2 靈芝孢子粉總三萜溶出量的測定 總三萜溶出量參照陳冠州等[26]的方法進行測定。

0.1 mg/mL熊果酸為標準品,以熊果酸質量(mg)為橫坐標,吸光值為縱坐標,得熊果酸質量與吸光值的回歸方程為:y=0.0053x+0.0038,R2=0.9982。稱取破壁靈芝孢子粉0.50 g,乙酸乙酯溶解,經超聲提取后過濾,續濾液用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶。測定時取1 mL待測液,于100 ℃水浴蒸干,加入香草醛-冰乙酸溶液、高氯酸,65 ℃水浴保溫45 min,轉入冰浴后加入冰乙酸,15 min后于548 nm處比色,測定其吸光值。樣品中的總三萜溶出量以質量分數(%)表示,結果按式(2)計算。

式(2)

式中:m1-從標準曲線上查得樣品測定液中含熊果酸量(μg);V1-樣品定容體積(mL);V2-比色測定時所移取樣品測定液的體積(mL);m2-樣品質量(g)。

1.2.5 數據處理與統計分析 每組單因素和響應面試驗均重復3次取平均值,采用EXCEL 2003進行單因素試驗數據處理,采用Design-Expert 10.0.7進行響應面試驗設計與數據分析,采用Origin 2017軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 電場強度對靈芝孢子粉破壁率的影響 由圖1可知,在靈芝孢子粉破壁過程中,隨著電場強度的增加,破壁率呈現上升趨勢。這可能是電場強度的增加產生的能量越大,對靈芝孢子粉細胞壁的破壞作用越大,使破壁率大有提高[27]。但當電場強度過大時,對細胞壁的破壞作用越大,但也可使部分糖苷鍵發生斷裂,使細胞內活性物質發生降解[28]。另外,考慮到能耗的損失問題,在響應面試驗中避免采用過高的電場強度,以20～30 kV/cm為宜。

圖1 電場強度對靈芝孢子粉破壁率的影響Fig.1 Effect of electric field intensity on the rate of wall breaking

2.1.2 脈沖個數對靈芝孢子粉破壁率的影響 由圖2可知,隨著脈沖個數的增加,靈芝孢子粉破壁先呈現上升趨勢;在脈沖個數達到40000個時,破壁率達到最大為70.2%±1.64%。隨后,破壁率隨著脈沖個數的增加,呈現下降趨勢。增大脈沖個數,則脈沖作用時間延長,即脈沖效應累積,在脈沖個數達到40000個時,脈沖效應在靈芝孢子壁上累積達到最大,進而使破壁率達到最大。馮彩霞[29]在使用顯微鏡觀察破壁靈芝孢子粉時發現,當脈沖個數過大時,靈芝孢子粉粘結成團,脈沖與單個靈芝孢子粉接觸面積變小,進而導致破壁率降低。因此,在響應面試驗中脈沖個數宜采30000～50000個為宜。

圖2 脈沖個數對靈芝孢子粉破壁率的影響Fig.2 Effect of the number of pulses on the rate of wall breaking

2.1.3 脈沖寬度對靈芝孢子粉破壁率的影響 由圖3可知,隨著脈沖寬度的增加,靈芝孢子粉破壁率呈現快速上升趨勢;脈沖寬度增加至50 μs時,靈芝孢子粉破壁率的增加逐漸趨于穩定;當脈沖寬度達到70 μs時,破壁率達到最大值,為68.7%±1.02%。周連寧等[23]進行了不同高壓脈沖電場條件對小球藻破壁的影響研究,其結果表明,隨著脈沖寬度的增大,小球藻的破壁率也呈現先增加后減少的趨勢。脈沖寬度即單個脈沖作用于靈芝孢子粉細胞壁的時間,增加脈沖寬度,直接增加了單個脈沖對靈芝孢子粉細胞壁的破壞力,脈沖效應逐漸積累,最后達到了較高的破壁效果。因此,在響應面試驗中脈沖寬度采用50～90 μs為宜。

圖3 脈沖寬度對靈芝孢子粉破壁率的影響Fig.3 Effect of pulse width on the rate of wall breaking

2.2 靈芝孢子粉破壁工藝響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗結果 根據單因素試驗結果,進行靈芝孢子粉高壓脈沖電場破壁工藝響應面優化試驗。試驗結果見表2。

表3 方差分析與顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance and significance test

表2 靈芝孢子粉破壁工藝響應面試驗結果Table 2 Response surface test results of wall breaking technology for ganoderma spores powder

2.2.2 模型建立與方差分析 對表2試驗結果進行方差分析(表3),得到靈芝孢子粉破壁率回歸方程:Y=64.06+6.14A+2.64B+4.03C+1.72AB+5.05AC-1.9BC-8.97A2-7.17B2-6.04C2。

通過比較P值可判斷回歸模型中各因素影響的顯著程度。模型中因素AB、BC為不顯著項(P>0.05),其余均為極顯著項(P≤0.01)。各因素對靈芝孢子破壁效果從大到小依次為:電場強度、脈沖寬度、脈沖個數。

2.2.3 響應曲面分析 圖4～圖6可直觀地反映電場強度、脈沖個數和脈沖寬度三試驗因子對響應值破壁率的影響。在試驗范圍內,響應值破壁率先不同程度地增大,當響應值增大到最大值后,響應值破壁率又呈現不同程度地下降趨勢。因此,在試驗因子水平范圍內,存在靈芝孢子粉高壓脈沖電場的最大破壁率。

由圖4響應曲面可知,靈芝孢子粉破壁率隨著脈沖個數的增加而增加,趨于平緩后略有下降;靈芝孢子粉破壁率隨著電場強度的增加快速增加至最大值,而后略有下降。由圖5響應曲面可知,在較低的脈沖寬度范圍內,靈芝孢子粉破壁率隨著脈沖寬度的增加而迅速增加,之后隨著脈沖寬度的繼續增大,破壁率增加趨勢變得平緩,但最高值與最低值之間變化幅度較大;靈芝孢子粉破壁率隨著脈沖個數的增加呈現先增加后略有下降的趨勢,但下降趨勢較為平緩。

由圖6響應曲面可知,隨著脈沖寬度的增加,響應值破壁率呈現先增大后減小趨勢,但最高值與最低值之間變化幅度較小;靈芝孢子粉破壁率隨著電場強度的增加而逐步增加,當電場強度進一步增大時,靈芝孢子粉破壁率出現下降趨勢。圖6等高線圖趨于橢圓形,表明電場強度與脈沖寬度的交互作用顯著。其可能的原因是:電場強度越大,脈沖沖擊到靈芝孢子壁的能量越大,進而引起胞壁的通透性增大,更易被擊穿;脈沖個數是影響脈沖作用時間的主要因素,脈沖個數的增加表明脈沖作用總時間的延長。當電場強度與脈沖個數二者的破壁效應累加時,即相當于高壓脈沖作用于通透性較大的細胞壁上,脈沖效應長時間累積后對孢壁造成破壞。因而,電場強度和脈沖個數的互作效應對靈芝孢子粉的破壁效果較為顯著。

圖4 電場強度和脈沖個數對靈芝孢子粉破壁率影響的響應曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour line of the effect of electric field intensity and number of pulses on the rate of wall breaking

圖5 脈沖個數和脈沖寬度對靈芝孢子粉破壁率影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface and contour line of the influence of pulse number and pulse width on the rate of wall breaking

圖6 電場強度和脈沖寬度對靈芝孢子粉破壁率影響的響應曲面和等高線Fig.6 Response surface and contour line of the effect of electric field intensity and pulse width on the rate of wall breaking

2.2.4 靈芝孢子粉破壁工藝的驗證及對比試驗 靈芝孢子粉高壓脈沖電場破壁條件為:電場強度27.52 kV/cm,脈沖寬度80.31 μs,脈沖個數41761.11個,靈芝孢子粉破壁率為66.88%。考慮到儀器參數設置及現實因素,取電場強度25 kV/cm、脈沖寬度80 μs,脈沖個數40000個,在此條件下,重復3次試驗得靈芝孢子粉破壁率平均值為66.74%±0.03%,與預測值相對誤差小于3%,回歸模型可靠。唐慶華等[30]使用低溫研磨粉碎技術進行了峨眉山靈芝孢子破壁試驗,結果表明靈芝孢子粉破壁率僅為46%,而本試驗所使用的高壓脈沖電場破壁技術將靈芝孢子粉破壁率提高了45%。

2.3 靈芝孢子粉活性物質溶出量分析

靈芝多糖和三萜是靈芝的主要生物活性物質[31-32],破壁前靈芝孢子粉粗多糖和總三萜含量分別為(0.88±0.02) g/100 g和(1.63±0.03) g/100 g,而經高壓脈沖電場破壁后的靈芝孢子粉中,粗多糖和總三萜溶出量分別為(0.99±0.11) g/100 g和(1.79±0.03) g/100 g。試驗結果表明:使用高壓脈沖電場破壁工藝對靈芝孢子粉破壁后,孢內活性物質溶出量均有所提高。

3 結論

本試驗利用高壓脈沖電場對靈芝孢子粉進行了單因素破壁試驗以及響應面優化試驗。其結果為:電場強度、脈沖寬度、脈沖個數對靈芝孢子粉破壁試驗結果表明,它們對破壁率的影響順序為:電場強度>脈沖寬度>脈沖個數。在對響應面試驗回歸模型綜合分析的基礎上,得到靈芝孢子粉高壓脈沖電場破壁的最佳工藝參數:電場強度25 kV/cm,脈沖寬度80 μs,脈沖個數40000個,靈芝孢子粉破壁率達到66.74%±0.03%。

高壓脈沖電場破壁破壁后的靈芝孢子粉中粗多糖和總三萜溶出量分別為(0.99±0.11) g/100 g和(1.79±0.03) g/100 g。可見,該工藝既能提高靈芝孢子粉較高破壁率,也可避免因處理時間長對靈芝孢子粉內部活性物質(粗多糖以及總三萜)的破壞,可為靈芝孢子粉破壁以及高壓脈沖電場的新領域應用提供參考。