大鯢皮膠原蛋白制備工藝優化及其抗氧化活性研究

楊碧仙1,2,曹 宇2,3,范琴芳1,袁 敏1,李 燦

(1.貴陽學院食品與制藥工程學院,貴州貴陽 550005;2.貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲重點實驗室,貴州貴陽 550005;3.貴陽學院生物與環境工程學院,貴州貴陽 550005)

中國大鯢(Andriasdavidianus)為我國特有珍稀物種之一,廣泛分布于長江、珠江及黃河的中上游支流的山溪河流中,尤以貴州、陜西、四川、湖南、湖北等省多山地區較為多見[1-2]。現代研究發現,大鯢肉及皮膚中含蛋白質、多種氨基酸、礦物質及微量元素、免疫及抗氧化酶、膠原蛋白等物質,具有較高的營養價值[3-4];中醫認為大鯢性味甘平,有滋補強壯功效,藥效學研究證實大鯢有抗氧化、抑菌等藥理作用[5-7]。大鯢因生長期較長,皮膚厚實緊致,既具有治療燒燙傷作用[8],又富含膠原蛋白,是優質的食藥兼用膠原蛋白來源之一。膠原蛋白分子含有獨特的“三螺旋”結構,具有良好的生物活性[9],廣泛應用于功能食品[10-11]、化妝品[12]、醫藥和生物材料[13-14]等行業。

大鯢因肉質鮮美且具有滋補強壯作用,故被大量捕殺食用,加之人類活動范圍擴大的影響,自上世紀50年代野生大鯢數量急劇下降,被列為國家二級保護動物。因此,人工養殖與野化馴養大鯢受到研究者的關注[15]。貴州作為野生大鯢的主產區,雖然在自然原生態下大鯢種群不容樂觀[16],但在人工養殖方面取得了較好的成果,養殖大鯢可以作為商品供給[17],奠定了合理開發利用大鯢資源的基礎。

隨著人工養殖大鯢數量的增加,如何有效開發利用大鯢的科學和應用價值受到關注,其中對大鯢膠原蛋白成為研究熱點之一。目前,提取動物膠原蛋白主要采用低溫酸提[18]和超聲輔助酶解[19-20]等方法。而以往對大鯢皮膠原蛋白提取方法的研究主要集中在酶解法,如李莉等[21]采用胃蛋白酶提取大鯢皮膠原蛋白,但得率(12.73%)偏低的問題。因膠原蛋白三螺旋結構在采用酸提法時更容易得以保持,且提取所得的膠原蛋白呈現弱酸性狀態而穩定性較高。因此,為提高大鯢皮利用價值,本研究參照文獻[21]選擇操作簡單、經濟適宜的酸提法,確定提取大鯢膠原蛋白最佳提取條件,并進一步對其體外抗氧化活性開展研究。相關研究將有助于大鯢皮的開發利用,為今后相應的膠原蛋白產品研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢皮 由貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲重點實驗室提供;L-羥脯氨酸(批號111578-200201) 中國食品藥品檢定研究院;1,1,-二苯基-2-苦基肼1898-66-4 北京中生瑞泰科技有限公司;氯胺T、鹽酸、檸檬酸、甲酸、乙酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、正丙醇、高氯酸、對二甲基氨基苯甲醛、水楊酸、30%過氧化氫、7水合硫酸亞鐵等 均為國產分析純。

FA124電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;手提式高速分散器S10 寧波新芝生物科技股份有限公司;Allegrax-30R高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;SY2015JX136紫外分光光度計 濟南海能儀器股份有限公司;722可見分光光度儀 上海欣茂儀器有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;DW-40L508醫用低溫保存箱 青海海爾特種電器有限公司;DF-101S集熱式磁力攪拌器 鄭州長城科工有限公司;101-Z型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;FD1C-80真空冷凍干燥機 浙江臨海市譚氏真空設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鯢皮預處理 將大鯢皮上殘余的肉、筋膜、脂肪等清除干凈,剪成0.5 cm×0.5 cm小片,清洗后放入冰箱中-20 ℃凍藏備用[22]。

1.2.2 不同種類酸對浸提膠原蛋白的影響 稱取1.2.1處理后的大鯢皮1.0 g,分別以1.0 mol/L 的鹽酸、檸檬酸、甲酸和乙酸為浸提劑,料液比為1∶20 (g∶mL),用手提式高速分散器進行勻漿,勻漿后置于具塞試管在25 ℃條件下放置24 h,抽濾,離心10 min(轉速10000 r/min),即得不同種類酸浸提膠原蛋白液。分別測定并計算膠原蛋白得率。

1.2.3 不同溫度對膠原蛋白液提取的影響 由于蛋白超過38 ℃會變性,因此選擇提取溫度應在38 ℃以下[23]。設定溫度分別為5、15、25、35 ℃,以1.2.2中選出的最適宜酸為浸提液,并按1.2.2相同的提取方法制備不同提取溫度下膠原蛋白液。分別測定并計算膠原蛋白得率。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 鹽酸濃度對膠原蛋白得率的影響 稱取1.2.1處理之后的大鯢皮1.0 g,在料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度為35 ℃、提取時間24 h的條件下,分析不同質量濃度的鹽酸(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)對膠原蛋白得率的影響。

1.2.4.2 料液比對膠原蛋白得率的影響 稱取1.2.1處理之后的大鯢皮1.0 g,在鹽酸濃度為0.4 mol/L、提取溫度為35 ℃、提取時間24 h的條件下,分析不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)對膠原蛋白得率的影響。

1.2.4.3 提取時間對膠原蛋白提取率的影響 稱取1.2.1處理之后的大鯢皮1.0 g,在鹽酸濃度為0.4 mol/L、提取溫度為35 ℃、料液比1∶15的條件下,分析不同提取時間(12、24、36、48、60 h)對膠原蛋白得率的影響。

1.2.5 正交試驗設計 結合單因素實驗結果,在最適宜酸為浸提劑、最適宜提取溫度條件下,考察浸提液的酸濃度、提取時間、料液比三個因素對膠原蛋白得率的影響,設計三因素三水平的正交試驗方案L9(34)。試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor and levels table of orthogonal experiment

1.2.6 膠原蛋白得率的測定 參照文獻[24]方法,精密移取質量濃度為0.0、1.6、3.2、4.8、6.4、8.0 μg/mL的L-羥脯氨酸對照液1.0 mL標準液于試管中,依次加入2.0 mL正丙醇以及0.5 mL氯氨T試劑,室溫下放置25 min,加入顯色劑對二甲氨基苯甲醛溶液0.5 mL放入80 ℃水浴加熱10 min,冷卻,在560 nm處測吸光度。空白對照用蒸餾水替代,操作同上。以L-羥脯氨酸對照液質量濃度Y為橫坐標,吸光度X為縱坐標,進行標準曲線繪制,得到回歸方程Y=0.0726X+0.0015,相關系數R2=0.9901。結果表明,L-羥脯氨酸在0～8.0 μg/mL的范圍內,呈線性關系,并具有較好的重現性、穩定性和精密度。

L-羥脯氨酸含量M(%)=(C×V)/m×100

膠原蛋白得率(%)=(M×11.1)×100

式中,M為大鯢皮中L-羥脯氨酸含量(g/100 g);C為待測液中的L-羥脯氨酸濃度(mg/mL);V為待測液體積;m為大鯢皮干品質量,m=鮮大鯢皮質量×(1-鮮大鯢皮水分含量);11.1為L-羥脯氨酸轉化為膠原蛋白的系數,其中參照文獻[25]測得鮮大鯢皮中水分含量為71%。

1.2.7 抗氧化性實驗 取工藝優化試驗獲得的大鯢皮膠原蛋白液,處理后進行抗氧化性實驗。

1.2.7.1 大鯢皮膠原蛋白粉制備 參照文獻[26]方法,取優化提取的膠原蛋白液,加入70%硫酸銨溶液鹽析,離心,棄去上清液,沉淀,用去離子水清洗,冷凍干燥,即得大鯢皮膠原蛋白粉。

1.2.7.2 清除DPPH自由基的試驗 參照文獻[27-28]方法,將膠原蛋白粉配制成質量濃度為2、4、6、8、10 mg/mL溶液,移取2 mL樣品液于具塞試管中,加入2 mL新配制的3×10-2mg/mL的DPPH溶液,振蕩搖勻,在室溫黑暗處靜置30 min后,于515 nm處測定吸光度。同時測定不加樣品溶液的DPPH溶液(陰性對照)的吸光度及不加DPPH溶液(空白對照)的吸光度。以膠原蛋白質量濃度為橫坐標,DPPH自由基清除率為縱坐標繪制曲線。以不同濃度VC溶液(質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL)作為陽性對照組,采用同樣測定方法,計算其DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1:加入樣品及DPPH溶液時的吸光度;A2:加樣品及無水乙醇的吸光度(空白對照);A3:加入DPPH溶液及蒸餾水的吸光度(陰性對照)。

1.2.7.3 清除羥基自由基(·OH)的試驗 參照文獻[29-30],分別移取質量濃度為2.4、3.6、4.8、6.0、7.2和8.4 mg/mL的樣品溶液1.0 mL于具塞試管中,分別加入2.0 mL 1.8×10-3mol/L的硫酸亞鐵溶液,1.5 mL的1.8×10-3mol/L水楊酸-乙醇溶液,再加入0.8 mL 30%過氧化氫溶液,37 ℃水浴1 h,于520 nm波長處測定吸光度。空白組中用1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液;對照組中用蒸餾水代替過氧化氫溶液。以膠原蛋白質量濃度為橫坐標,羥基自由基(·OH)清除率為縱坐標繪制曲線。以不同濃度VC溶液(質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL)作為陽性對照組,采用同樣測定方法,計算其對羥基自由基(·OH)的清除率。

羥基自由基(·OH)清除率(%)=[A0-(A1/A1′)/A0]×100

式中:A0:以蒸餾水代替樣品液的吸光度(空白組);A1:加入樣品的吸光度;A1′:蒸餾水代替H2O2的吸光度(對照組)。

1.3 數據處理

數據采用Origin 9.1處理繪圖,用SPSS 23.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 提取條件

2.1.1 不同種類酸浸提膠原蛋白液的效果 膠原肽鏈存在著許多堿性基團,與酸結合后,膠原分子間及肽鏈間的離子交聯鍵和氫鍵將被打開,膠原就會發生酸溶,因此低濃度的酸溶液能使得魚皮組織纖維膨脹溶解。而不同種類的酸對膠原分子內部結構的影響不同,最終使得不同的酸對膠原蛋白得率產生不同的影響[31]。由圖1可知,在相同的質量濃度和提取條件下,鹽酸對大鯢皮膠原蛋白的提取效果最優,其次是甲酸和乙酸,而檸檬酸的提取效果最弱。因此,在后續膠原蛋白的提取過程中選用鹽酸為浸提劑。

圖1 不同種類酸提取大鯢皮膠原蛋白得率的影響Fig.1 Effect of different types of acid extraction on the yield of collagen

2.1.2 不同溫度下提取大鯢皮膠原蛋白效果 由圖2可知,隨著溫度的增加,提取大鯢皮膠原蛋白的得率也隨之提高,在35 ℃時,膠原蛋白的得率可達25.5%。張敏[23]報道,蛋白質在超過38 ℃后,會出現變性的趨勢,因此,選擇35 ℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對大鯢皮膠原蛋白得率的影響Fig.2 Effect of different extraction temperature on the yield of collagen

2.2 單因素實驗

2.2.1 鹽酸濃度對大鯢皮膠原蛋白提取的影響 由圖3可知,大鯢皮膠原蛋白得率呈現隨鹽酸濃度增加先上升,至鹽酸濃度0.4 mol/L時,膠原蛋白提取得率達到最大值,此時大鯢皮中膠原蛋白浸提得率為29.4%,之后逐步下降,推測是在膠原蛋白的提取過程中pH過低會導致膠原的變性和破壞。因此,選擇濃度0.4 mol/L的鹽酸為浸提液。

圖3 鹽酸濃度對膠原蛋白得率的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid concentration on the extraction yield of collagen

2.2.2 料液比對大鯢皮膠原蛋白提取的影響 由圖4可知,料液比達到1∶15 (g/mL)時,大鯢皮中膠原蛋白的提取效果較好,得率為27.1%,之后雖然溶劑量持續加大,但是當料液比超過一定限度時,可能因為攪拌子形成的剪切力變小[32],使得膠原蛋白得率出現下降趨勢。因此,料液比選擇為1∶15 (g/mL)。

圖4 料液比對膠原蛋白得率的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction yield of collagen

2.2.3 提取時間對大鯢皮膠原蛋白提取的影響 由圖5可知,隨著提取時間的增加,膠原蛋白得率先增加,在提取時間36 h時,大鯢皮中膠原蛋白得率較高,為23.3%,之后開始下降。因此,浸提時間選擇為36 h。

圖5 提取時間對膠原蛋白得率的影響Fig.5 Effect of extration time on the extraction yield of collagen

2.3 正交試驗

由表2比較R值的大小可以看出,浸提液鹽酸濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)三個因素中,對大鯢皮中膠原蛋白提取效果的影響程度由大到小為:A>B>C,即鹽酸濃度的影響最大,其次是料液比,而提取時間的影響最小,可確定最佳提取條件為A2B2C1,即鹽酸濃度為0.4 mol/L、料液比1∶15 (g/mL)、提取時間24 h。該條件為篩選所得的鹽酸法提取大鯢皮膠原蛋白的最優條件。由表3方差分析可以看出,浸提液鹽酸濃度對大鯢皮中膠原蛋白提取效果具有顯著性影響(P<0.05),料液比和提取時間對大鯢皮中膠原蛋白提取效果無顯著性影響(P>0.05)。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

注:* 影響顯著,P<0.05。

2.4 驗證實驗

根據優化得到的大鯢皮中膠原蛋白提取條件:鹽酸濃度為0.4 mol/L、料液比1∶15 (g/mL)、提取時間24 h。在該條件下進行三次驗證實驗,得到膠原蛋白得率分別為39.8%、40.3%、40.5%,平均值為40.2%,RSD值(n=3)為0.90%。驗證實驗表明,優化獲得的大鯢皮中膠原蛋白的提取條件A2B2C1是可信可行的。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 大鯢皮中膠原蛋白對DPPH自由基清除能力 由圖6 可知,大鯢皮中膠原蛋白質量濃度和VC清除DPPH自由基的能力表現出劑量相關性。其IC50分別為9.96 mg/mL和2.14 μg/mL,表明雖然弱于VC對照,但大鯢皮的膠原蛋白具有較好的清除DPPH自由基的能力。

圖6 膠原蛋白清除DPPH自由基的能力Fig.6 Scavenging effects of collagen on DPPH free radical

2.5.2 大鯢皮中膠原蛋白對羥基自由基(·OH)清除能力 由圖7可知,大鯢皮中膠原蛋白與VC對羥基自由基(·OH)清除能力均隨樣品質量濃度的增加而增大,且呈現出良好的劑量依賴效應,通過計算得到IC50值分別為7.79 mg/mL和1.75 μg/mL。當膠原蛋白質量濃度為8.4 mg/mL 時,其清除率為51.6%,且仍保持上升趨勢,表明大鯢皮中膠原蛋白具有較強的羥基自由基清除能力。

圖7 膠原蛋白清除·OH 的能力Fig.7 Scavenging effects of collagen on hydroxyl free radical

3 結論

影響大鯢皮中膠原蛋白提取效果的因素順序為:鹽酸濃度>料液比>提取時間,優化獲得的最佳工藝條件為:以0.4 mol/L 的鹽酸作為浸提劑,采用1∶15 (g∶mL)的料液比,提取時間為24 h。通過三次重復驗證實驗,表明在此優化工藝條件下,運用酸法浸提大鯢皮中膠原蛋白得率可達40.2%,高于文獻報道[21]的酶法提取大鯢皮膠原蛋白得率,且與酶法比較所用提取時間無明顯差異。體外抗氧化試驗表明,酸法提取大鯢皮中膠原蛋白具有較好的清除DPPH自由基和羥基自由基(·OH)能力,IC50值分別為9.96和7.79 mg/mL。工藝優化實驗和體外抗氧化性實驗的綜合結果表明,酸法提取大鯢皮中膠原蛋白不僅能獲得較高的得率,且因酸法提取可較好地保持膠原蛋白的三螺旋結構,加之制備膠原蛋白粉采用硫酸銨鹽析法而使終產品呈pH5.5～6.7的弱酸性狀態,有利于保持膠原蛋白的穩定,因而能較好地保留其抗氧化活性,與目前文獻[21]報道的相關研究比較,本研究對大鯢皮膠原蛋白提取有一定的指導價值,對合理利用和開發大鯢資源具有一定意義。