基于LF-NMR技術下3種豬肉水分含量預測模型的建立與比較

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(1.農業農村部肉品加工重點實驗室,教育部肉品加工與質量控制重點實驗室, 江蘇省肉類生產與加工質量控制協同創新中心,南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2.南京農業大學理學院,江蘇南京 210095)

水是肉與肉制品的主要組分之一,對肉品品質具有重要影響[1]。水分含量測定是判定肉品品質的重要指標,在肉制品加工原料的控制、肉品質量安全檢測等方面具有廣泛的應用。傳統肉中水分含量的檢測方法有干燥法、近紅外光譜法等,但這些方法都存在一定缺陷,如干燥法耗時長、能耗高[2];近紅外光譜法檢測準確性不高等缺點[3]。

低場核磁共振技術(Low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)是一種使用特定的脈沖序列(CPMG),通過測定樣品中氫質子在橫向xy平面上發生共振后由非平衡狀態進入平衡狀態的橫向弛豫過程變化,進而分析樣品中實際水分分布的技術。LF-NMR在畜禽肉品質檢測方面已有廣泛應用,主要根據T2弛豫時間來評價樣品中水的分布狀態[4-8]:T2b=1～10 ms為結合水,T21=30～60 ms為不易流動水;T22=100～400 ms為自由水。正是基于以上的這些特性,王欣等[9]、陳昊等[10]在豬肉水分檢測方面進行了大量研究;同時,低場核磁共振技術在樣品中實際水分含量檢測方面也顯示出了巨大的潛力,其檢測速度快、操作簡單、可實現無損檢測等優點,近年來逐漸成為食品水分含量檢測[11-12]、水分遷移[13-14]、結構分析[15-16]、鑒別[17]和品質鑒定[18-19]等多方面研究的熱點,在功能性油脂[20]、蔬菜[21]等諸多食品中有了廣泛的應用。但豬肉中弛豫特性與實際含水量的關系尚不明確。

針對以上問題,本實驗以新鮮豬肉為實驗材料,研究了LF-NMR弛豫特性與豬肉中水分含量的預測模型并進行驗證,為實現肉中水分含量的快速檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

宰后36～48 h的豬肉背最長肌(剔除皮、筋膜、脂肪) 南京玄武區紫金城集貿市場。

MesoMR23型低場核磁分析實驗儀器 配有25 mm直徑線圈,上海紐邁電子科技有限公司;SQP電子天平 精度0.001 g，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;DGG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品準備 共采集宰后36～48 h的豬最長肌肉樣119份,其中106份做校正集用于方程擬合,13份做預測集用于驗證試驗。用刀修整肉塊邊沿,并找出肌纖維的自然走向,用雙片刀(間距1 cm)沿肌纖維的自然走向分切成多個1 cm厚的小塊,再用陶瓷刀從1 cm厚的肉塊中切成大小為1 cm×1 cm×2 cm的肉柱。在肉樣的切取過程中應避免肉眼可見的結締組織、血管以及其他缺陷。

1.2.2 LF-NMR弛豫時間測定 將肉柱放到特定的樣品管中,在(32.00±0.01) ℃情況下用于低場核磁共振儀進行T2的測定,每個肉樣平行測定三次,取平均值。

1.2.2.1 校正儀器的參數測試 選擇FID序列,SW=100 kHz,質子共振頻率SF=21 MHz,RFD=0.08 ms,Tw=2000 ms,模擬增益RG1=20 db,采樣點數TD=1024,DRG1=3,PRG=1,累加次數NS=2。

1.2.2.2 儀器參數的設定 選擇CPMG序列,SW=200 kHz,質子共振頻率SF=21 MHz,RFD=0.08 ms,Tw=8000 ms,模擬增益RG1=15 db,采樣點數TD=1024,DRG1=3,PRG=2,累加次數NS=8,DR=1,TE=0.3 ms,NECH=3200。

1.2.3 干燥法測定肉中水分的含量 參照國家標準《食品安全國家標準食品中水分的測定》(GB 5009.3-2016)[22]中的方法測定。

1.2.4 數據標準化處理 鑒于本研究的回波峰點數和樣本數之間的數量級差別過大(大于2個數量級),所以在測得樣本回波峰點數據之后,采用數據標準化處理方法以滿足偏最小二乘回歸及主成分回歸探尋回波峰點數據與豬肉中真實水分含量的模型精度需求,防止出現模型擬合不合理的情況。標準化方法如下:設X=(x1,x2,…,xn)T是某一變量的一組觀測,那么標準化處理即:

式(1)

1.2.5 最小二乘法(LSE) LSE是曲線擬合中估計回歸參數的基本方法。該方法可以簡便地求得未知的數據,并使得這些求得的數據與實際數據之間誤差的平方和為最小。以兩個變量為例,假定我們要研究兩個變量(X,Y)之間的線性相關關系如式(2):

Y=a0+a1X

式(2)

通常可以得到一系列成對的數據(xi,yi),i=1,2,…,n。應用最小二乘法原理來估計未知參數,就是求滿足式(3)的a0和a1:

式(3)

將目標函數式分別對a0和a1求偏倒數,并使這兩個偏導數等于0即可求得參數估計值。

1.2.6 偏最小二乘回歸(PLSR) 偏最小二乘法是一種數學優化技術,它通過最小化誤差的平方和找到一組數據的最佳函數匹配。這種基于特征變量的回歸方程在多元校正中得到了越來越多的應用。在PLSR建模之前需要優先確定最優主成分數。本研究中采用留一交叉驗證確保樣品都有同等的可能性參與訓練從而提高擬合精度[23],并用PRESS確定主成分個數,采用均方根誤差(RMSE)作為評價標準,按式(4)、(5)計算:

式(4)

式(5)

采用偏最小二乘法對校正集樣品進行訓練后建立PSLR校正模型,并用預測集樣本進行測試。

1.2.7 主成分回歸法(PCR) PCR是一種基于主成分分析(PCA)與多元線性回歸的擬合方法。核心原理是以3200個回波數據矩陣X∈Rnxp(n為樣本數,p為特征數),根據累積貢獻率確定主成分數實現降維,從而使得多元線性回歸方法能夠適用。

PCA的主成分提取模型如下:

式(6)

式中,i表示索引各樣本;Yij為第i個樣本的第j個特征數值;Lij為第i個樣本的第j個標準化特征的分量系數Fij(i=1,2,…,n,j=1,2,…,p)為目的提取出的主成分數據集的分量數值;Fi為第i個主成分。

Y=β0+β1F1+β2F2+…+βiFi

式(7)

根據均方差根誤差(RMSE)判斷擬合方法的準確性。

1.3 數據處理

用R Language對試驗數據進行作圖與統計分析,其中,統計結果以 “平均值±標準誤”表示。

表1 不同含水率實驗結果t檢驗分析表Table 1 t-text for means of the measurements of moisture content

注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2 豬肉水分化學值的統計結果Table 2 Statistical results of pork moisture chemical values

2 結果與分析

2.1 低場核磁共振測量結果

所有樣品的T2譜如圖1所示,應用紐邁核磁共振分析應用軟件Ver4.0對CPMG曲線進行反演擬合得T2弛豫圖像如圖2所示。根據各峰橫向弛豫最大值所對應的時間從小到大為T2b、T21和T22,依次表明該峰所含信息對應結合水、不易流動水和自由水;各峰峰面積所占總峰面積的比例依次稱為P2b、P21、P22,分別對應結合水、不易流動水和自由水水分含量占肉中總水分含量的比例。

圖1 豬肉樣品連續分布馳豫衰減曲線Fig.1 Continuous distribution relaxation attenuation curve of pork samples

圖2 豬肉樣品的橫向弛豫時間(T2)反演曲線Fig.2 Inversion curves of the transverse relaxation time(T2)for pork samples

2.2 弛豫特性分析

根據肉中水與其他物質的結合狀態可以分為結合水、不易流動水和自由水。由于三種水的結合強度不同,所在受到磁場擾動之后呈現出不同的回波特性,可在T2弛豫時間的長短方面有所體現。將106份樣品分為兩組:高含水量組(含水率≥75%)與正常組(含水率<75%),53組高含水率組,53組正常組,其弛豫特性結果如表1所示。

橫向弛豫時間T2分為T2b、T21和T22三個指標,分別對應結合水、不易流動水和自由水。高水分含量組的T21、T22、P2b、P21、P22與正常組有顯著區別(P<0.05)。隨著含水率的升高,T21、T22均顯著增大,T2b則無顯著性差異;通過進一步對比P2b、P21、P22等數據可以發現,水分含量的增大可以顯著改變肉中各組水分的比例(P<0.05)。隨著含水率的增加,不易流動水的峰面積占總峰面積的比例增大,自由水、結合水峰面積占總峰面積的比例顯著減少(P<0.05)。

2.3 樣品水分實際含量測定結果

表2所示為實驗所選豬肉119個樣本水分含量的參照值統計表,其中校正集106個樣品用于最小二乘法,主成分回歸法和偏最小二乘法的方程擬合,13個樣品用于預測集以驗證方程準確性。

2.4 水分實際含量測定結果

2.4.1 最小二乘法模型的建立與評價 使用核磁共振儀對肉樣進行檢測,將采集數據與肉樣中水分含量(g)關聯分析建立方程,以結合水、不易流動水、自由水對應的反演峰面積為Y值,以真實水分含量為X值,表3為肉中水分含量與核磁共振峰面積之間回歸分析的結果,發現當Y值包含A21項的峰面積的時候,其對應擬合方程的系數與常數項都明顯變化,這與肉中不易流動水占70%～80%的現狀十分符合;同時比較發現,使用A2b+A21或A2b+A21+A22為Y值的擬合效果最好,決定系數分別為0.9339與0.927,所以綜合考慮后選用A2b+A21所對應的Y=7538.4X-1102.9方程作為最終的相關方程。

表3 水分含量與核磁共振峰面積擬合方程Table 3 Equation for fitting moisture content and nuclear magnetic resonance peak area

為驗證水分預測模型的精度與可靠性,另取13個肉樣進行驗證性試驗。將樣品放置在32 ℃條件下重復測量步驟收集峰面積的數據(A2b+A21)并演算出肉中水分含量(g),進而與烘干法所測相比較。如圖3所示,方程為Y=1.018X-0.05,決定系數R2=0.9604,表明該方程具有一定的穩定性以及該方法預測精度較高。

圖3 直接干燥法驗證方程Fig.3 Verification equation of direct drying method

2.4.2 偏最小二乘法(PLS)回歸模型的建立 偏最小二乘法回歸模型以校正集106樣本的3200個CPMG回波峰點數據作為自變量X,以豬肉水分的化學值為因變量Y,采用偏最小二乘法(PLS)對校正集的豬肉進行訓練以建立X與Y的相關模型,應用留一交互驗證法進行確定,如圖4所示,當主成分數為3時,RMSECV值在相鄰兩點中值最小,故選擇3作為模型的最佳主成分數以訓練預測模型。運用模型對于預測集的13個數據進行預測,預測值與化學值的相關曲線如圖5所示,橫坐標為通過物理化學方法測得的水分含量在實際值,縱坐標為水分含量預測值,決定系數R2為0.969。

圖4 交互驗證均方根誤差與主成分數的關系Fig.4 Correlation between PRESS and the number of principal component

圖5 豬肉預測集樣品水分的化學值與PLS方法獲得的預測值關系Fig.5 Correlation between reference and predicted values by PLS for pork water content of calibration set and prediction set samples

2.4.3 主成分回歸法(PCR) 如圖6所示,為了避免主成分數n不足導致擬合效果不好,降維效果不理想,n過大導致出現過度擬合的問題,取n=5,此時隨著n逐漸增大其累積貢獻率到達85.31%,且基本不再增長,認為n+1時(n=6)累計貢獻率變化可以忽略不計,此時5維矩陣已可較好的實現降維。運用模型對于預測集的13個數據進行預測,預測值與化學值的相關曲線如圖7所示,橫坐標為通過物理化學方法測得的水分含量在實際值,縱坐標為水分含量預測值,擬合曲線的決定系數R2為0.9409,具有較好的準確性與精確性。

圖6 累積貢獻率與主成分關系Fig.6 Relationship between cumulative contribution rate and principal components

2.4.4 模型評價 試驗中所得核磁共振數據是一個3200維的數據矩陣,也可以反演后線性回歸分析或者在原數據基礎上直接進行多元擬合,這兩類方法的分析結果(表4)可以看出,PLS都在校正集和預測集都顯示出了更高的決定系數R2與更低的預測標準誤差值RMSEP;傳統的最小二乘法擬合的回歸曲線(Y=7538.4X-1102.9)擬合效果相對較差,同時,PCR作為另一種多元擬合方法,其決定系數與預測標準誤差值都不如最小二乘法,表明在該情形的豬肉實際水分擬合模型中,偏最小二乘法效果最好,其次是最小二乘法,最后是主成分回歸法。

表4 最小二乘法、偏最小二乘法和主成分回歸法預測豬肉水分的統計結果Table 4 Statistic of pork moistness content for Least squares,PLS and PCR

圖7 豬肉預測集樣品水分的化學值與PCR方法獲得的預測值關系Fig.7 Correlation between reference and predicted values by PCR for pork water content of calibration set and prediction set samples

3 討論

本試驗根據國標法檢測106份肉樣的實際水分,參照《畜禽肉水分限量》[24]對不同含水率的肉樣進行分類,發現肉樣可分為53份正常肉組(含水率<75%)與53份高含水率組(含水率≥75%),證明市售豬肉含水率存在一定差異,根據本試驗結果發現不同含水率組弛豫特性具有顯著差異,這與王勝威等[25]關于注水、注膠肉的研究結果一致,同時,李健等[26]發現采用不同發酵床墊料優化棚舍結構對豬肉持水力影響顯著,證明豬肉含水率的不同可能是由于豬養殖管理過程的飼料、環境差異性所造成;而劉萍等[27]進行豬肉含水率測量過程不確定因素分析發現重復測量對結果產生的影響最大,這也可能是豬肉含水率差異性的原因之一。

低場核磁共振通過測定恒定磁場中射頻脈沖作用下氫原子的擾動規律,檢測肉樣中水分的實際含量與分布情況,在肉中實際水分的現實快速檢測方面顯現出巨大潛力。Bertram等[28]通過大量基礎研究為低場核磁共振檢測水分提供理論依據,龐之列等[29]通過探討不同含水量豬肉的弛豫特性變化論證核磁共振快速檢測的現實可行性,然而其研究并未能深入探討弛豫特性與肉中實際含水量的模型關系。本試驗通過對不同含水率下豬肉弛豫特性的差異性比較發現豬肉含水率對于T21、T22、P2b、P21和P22有顯著影響(P<0.05)。高含水率組與正常組相比,T21、T22顯著延遲(P<0.05),T2b無顯著變化(P>0.05),說明含水率對于豬肉內部結合水自由度無顯著影響(P>0.05),對于自由水與不易流動水有顯著影響(P<0.05),T21顯著增加(P<0.05)可能由于高水分含量組肉樣豬在屠宰過程處于應激狀態,使豬肉中肌原纖維的內環境發生改變,結構變得松散導致存在于肌原纖維內部的不流動水自由度增加,伴隨有細胞膜通透性變化造成肌細胞內滲透壓改變致使細胞內部空間膨脹,導致部分自由水與細胞結合能力進一步降低,從而體現為不易流動水與自由水弛豫時間顯著延遲[7],T2b沒有顯著變化(P>0.05)主要是由于此部分水分子與蛋白質形成緊密結合,受到較強的束縛作用[30],從而使得弛豫時間沒有顯著變化,這與吳兆良等[31]的研究基本一致;P2b、P22顯著低于正常組(P<0.05),而P21顯著高于正常組(P<0.05)說明應激條件下,豬肉的組織結構可能存在損傷導致肉樣保水性下降,如體細胞膨脹性破裂使得部分結合水擺脫原有束縛進而轉換為不易流動水,這與蓋圣美等[32]的結果相似。

建立模型是一種研究物質特性的良好方法,本實驗中以標準誤差值與決定系數作為模型評價指標,分別對最小二乘法、偏最小二乘法和主成分回歸法進行模型評價。通過比較這三類方法的分析結果發現對于PLS方法而言,最小二乘法擬合的回歸曲線擬合效果相對較差,可能是因為最小二乘法對于干擾信息過分敏感而PLSR模型采用了完整的豬肉樣品弛豫信號,更能準確的代表整個樣品的弛豫特性與具有更強的抗干擾能力[33]。同時,PCR作為另一種多元擬合方法,雖然充分利用3200個回波參數作為研究對象,但是在降維過程只解釋85.31%數據導致并不能充分代表全部樣本,這與高興盛等[34]的研究結果相似;證明多元擬合校正方法可有效地減小了測量誤差,能快速解決多維數據校正問題;曹曉蘭等[35]采用OSC(orthonormal signalcorrection)預處理方法,通過選擇特征波段作為輸入變量可顯著提高準確度,所以本文選用PLSR方法能較好地快速預測肉中的水分含量。與此同時,可以廣泛地考慮不同多元擬合方法之間的優勢互補,充分發各方法擬合特色,吉琳琳等[36]通過多元擬合中的人工神經網絡方法(BP-ANN)對大米中水分進行快速測量,表明多元擬合技術在食品檢測中新的應用前景;同時,張海云等[37]采用支持向量機技術(SVM)進行水分測量,發現在小樣本、非線性、維數多和局部極小等數據情形下,SVM預測效果更好,表明在多元處理方面可以考慮PLSR降維后結合SVM進行模型預測效果良好[38]。

4 結論

本試驗主要研究了肉中水分含量與低場核磁弛豫特性之間的關系并結合最小二乘法、偏最小二乘法和主成分回歸法建立預測模型,發現豬肉中含水率對于T21、T22、P2b、P21和P22有顯著差異(P<0.05),在此基礎上采用偏最小二乘法(PLS)建立的模型具有可靠地預測結果,為以后豬肉水分快速檢測研究與建立提供參考。