紅棗果汁果渣與果酒果渣中色素抗氧化活性的比較

(寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021)

紅棗富含多糖、酚類、環磷酸腺苷等生物活性成分,因其營養豐富,除鮮食外,現已被開發為棗汁、棗酒等多種產品,但加工產生的殘渣大多被廢棄處理,易造成資源浪費和環境污染。棗渣中含有大量色澤鮮艷的水溶性紅色素,安全無毒[1],且有一定止瀉、抗菌、抗癌、抗病毒等功能[2],是一種理想的天然色素資源。大量研究表明紅棗色素具有較好的體外抗氧化活性,且多酚和黃酮可能是其發揮抗氧化作用的物質基礎[3-4],對H2O2誘導血管內皮細胞氧化應激損傷[5]、常壓缺氧、拘束應激性肝損傷[6]、KBrO3誘導氧化應激性腎損傷小鼠均有保護作用[7],屬無毒級物質[8],因此,研究開發紅棗色素是大勢所趨。但天然色素極其不穩定,易受溫度、光照、pH、金屬離子等影響[9]。因從棗汁、棗酒廢棄棗渣中提取的紅色素加工處理方式不同,可能會導致抗氧化活性物質及抗氧化活性發生變化。棗汁果渣含有大量環核苷酸、黃酮類、五環三萜類化合物和多酚類等生理活性物質[10],資料表明,棗渣中紅棗色素發揮抗氧化作用的主要物質是多酚和黃酮[4],在發酵過程中多酚和黃酮等活性物質會浸入酒中,且發酵使活性物質發生聚合、縮合、水解及氧化等化學反應,而導致活性物質含量發生變化[11]。曹延俊[12]研究表明,發酵導致石榴中鞣花單寧、花青素等抗氧化活性物質含量下降是由于酵母細胞釋放自由基氧化所致。易橋賓等[13]研究顯示發酵使可可豆中多酚類物質含量明顯降低,抗氧化能力減弱。王大為等[14]比較了歐李果汁果渣與果酒果渣的基本成分,發現果酒果渣中多酚、原花青素和白藜蘆醇等活性物質含量低于果汁果渣。

目前對于紅棗果汁果渣色素的抗氧化活性已進行了較系統的研究,但對紅棗果酒果渣色素的抗氧化活性,以及果汁果渣與果酒果渣色素抗氧化活性的比較研究未見報道,本實驗以紅棗果汁果渣、果酒果渣為原料,探究其色素抗氧化活性成分含量及抗氧化活性的差異,以期為開發天然抗氧化劑、提高紅棗附加值、擴大棗渣利用途徑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗果汁果渣 寧夏靈武長棗榨汁后的副產物;紅棗果酒果渣 寧夏靈武長棗發酵棗酒的副產物;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、蘆丁標品、沒食子酸標品、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國Sigma公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯醋酸 均為國產分析純。

UV-2250型紫外可見分光光度儀 日本島津公司;RE-52-05旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;DZF-6053 真空干燥箱 上海恒科學儀器有限公司;5417R臺式離心機 德國Eppendorf公司;SHA-C水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;101-3型電熱鼓風恒溫干燥箱 上海車星建材實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅棗色素的提取 紅棗果汁果渣經發酵8 d后,殘糖量不再發生變化,且無氣泡產生,無明顯發酵跡象,說明發酵結束,即得果酒果渣。將紅棗果汁果渣、果酒果渣分別用清水清洗3次,烘干、粉碎,過40目篩。分別取一定量紅棗果汁果渣粉和發酵2、4、6、8 d的果酒果渣粉,以料液比1∶20 (g/mL)加入0.4 mol/L NaOH液于75 ℃提取2 h,過濾、3000 r/min離心5 min、濃縮、真空冷凍干燥制得色素[15]。

1.2.2 總多酚含量的測定 采用Aspe[16]Folin-Ciocalteu法,沒食子酸為標準品,繪得標準曲線為y=0.0012x+0.0007,R2=0.9996。分別取2 μg/mL紅棗果汁果渣色素和發酵不同天數(同1.2.1)的果酒果渣色素溶液0.5 mL,分別加5.0 mL水,混勻,加1.5 mL福林酚試劑,混勻,室溫放置6 min,加3.0 mL 10%碳酸鈉溶液,用水稀釋至25 mL,30 ℃水浴加熱30 min后,取出,搖勻,試劑空白為參比,在765 nm處測定吸光度,結合標準曲線計算樣品中的多酚含量。

式(1)

式中:c1為樣品多酚濃度(mg/mL);V為樣品液體積(mL);W為樣品質量(g)。

1.2.3 總黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[17],蘆丁為標準品,繪得標準曲線為y=0.0123x+0.0018,R2=0.9993。分別取2 mg/mL紅棗果汁果渣色素和發酵不同天數果渣色素液各300 μL和5% NaNO2溶液90 μL,加至裝有1.5 mL去離子水的離心管中,振蕩混勻,靜置6 min,加10% AlCl3·6H2O溶液180 μL,振蕩混勻,待反應5 min后再加入1 mol/L NaOH溶液0.6 mL,加水稀釋至3.00 mL,測定510 nm處吸光度值,根據標準曲線計算樣品中總黃酮含量。

式(2)

式中:c2為樣品總黃酮濃度(mg/mL);V為樣品液體積(mL);W為樣品質量(g)。

1.2.4 DPPH·清除率的測定 分別取1.0 mg/mL果汁果渣色素和發酵不同天數果渣色素液4 mL,加0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL,搖勻,25 ℃水浴20 min,在517 nm波長處測定吸光度,實驗三次取平均值,計算清除率[3]。

式(3)

式中:Ai為色素液與DPPH乙醇溶液混合后的吸光度;Aj為色素液與體積分數95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液混合后的吸光度;A0為蒸餾水代替樣液做空白對照測定的吸光度。

1.2.5 ABTS+·清除率的測定 參照文獻[18],配制 ABTS工作液備用。分別取1.5 mg/mL果汁果渣和發酵不同天數果渣色素液0.1 mL,加3.9 mL ABTS溶液,混勻,室溫下反應6 min,734 nm處測定吸光度,實驗三次取平均值,計算清除率。

式(4)

式中:Ai為色素液與ABTS自由基工作液混合后的吸光度;A0為0.1 mL蒸餾水代替樣液作空白對照測定的吸光度。

1.2.6 ·OH清除率的測定 參照文獻[19],分別取1.0 mg/mL發酵不同天數果酒果渣和果汁果渣色素液1 mL,加6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液3 mL,3 mmol/L FeSO4溶液3 mL和9 mmol/L H2O2溶液3 mL,搖勻后于510 nm處測定吸光度,實驗三次取平均值,計算清除率。

式(5)

式中:Ai為樣液反應后測定的吸光度;Aj為3 mL蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液測定的吸光度;A0為蒸餾水代替樣液做空白對照測定的吸光度。

式(6)

式中:Ai為樣液反應后測定的吸光度;Aj為蒸餾水代替鄰苯三酚溶液測定的吸光度;A0為蒸餾水代替樣液做空白對照測定的吸光度。

1.2.8 還原能力測定 參考文獻[18],分別取2.0 mg/mL發酵不同天數果酒果渣和果汁果渣色素液0.5 mL,加入0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.6)和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL,混勻,50 ℃水浴20 min,加10%三氯醋酸溶液2.5 mL,離心(3000 r/min,10 min),取上清液2.5 mL,加蒸餾水2.5 mL和0.1% FeCl3溶液1 mL,混勻后靜置10 min,在700 nm處測吸光度,實驗三次取平均值,由吸光度的大小來判斷還原能力的強弱。

1.3 數據處理

所有實驗進行3次重復測定,測定結果以平均數±標準差表示,采用SPSS 18.0進行差異分析,以P<0.05判斷為差異顯著,相關性分析采用相關系數法,并用Microsoft Excel軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 紅棗果汁果渣與果酒果渣色素的活性成分含量

紅棗色素中抗氧化活性成分含量結果顯示(圖1),果汁果渣色素中總多酚、總黃酮含量均較高,分別為(11.293±0.739)和(3.059±0.044) mg/100 g,且果汁果渣色素中抗氧化活性成分含量顯著高于8 d發酵結束的果酒果渣色素(P<0.05);果酒果渣色素中活性成分含量隨發酵時間延長而明顯降低(圖2),其總多酚含量變化范圍為5.481～11.293 mg/100 g,總黃酮含量變化范圍為0.742～3.059 mg/100 g。多酚是存在于植物體內的具有多個羥基的酚類成分,黃酮類化合物是指2個具有酚羥基的苯環相互連接并具有多羥基、雙鍵、芳香環等結構的一類化合物[21]。楊艷艷等[22]在棗醋發酵時發現,與棗汁相比,棗醋中多酚類、黃酮類物質含量明顯下降。酵母菌在發酵中會產生如丙酮酸、乙醛等代謝產物,與果渣中多酚類物質反應生成一些大分子物質[23]。另外,在果膠酶和微生物的作用下,隨發酵時間延長,酒精含量逐漸升高,果渣中活性成分被浸出[24],從而使果酒果渣中活性成分含量明顯低于果汁果渣。

圖1 紅棗果渣色素的活性成分含量Fig.1 The active components contents of pigment from jujube pomace注:不同小寫字母表示在P<0.05 水平差異顯著,圖2～圖12同。

圖2 發酵對紅棗果渣色素活性成分含量的影響Fig.2 The effect of the fermentation on the content of the active components of pigment from jujube pomace注:0 d代表未經過發酵的果汁果渣色素,8 d代表發酵結束的果酒果渣色素;圖4、圖6、圖8、圖10、圖12同。

2.2 紅棗果汁果渣與果酒果渣色素清除DPPH·能力

DPPH·是一種穩定的以氮為中心的有機自由基,能夠被具有抗氧能力的物質清除[25]。紅棗果汁果渣與果酒果渣色素均具有較好的清除DPPH·能力(圖3),且果汁果渣色素清除DPPH·能力顯著強于果酒果渣色素(P<0.05);但果渣發酵6 d后,色素清除DPPH·能力降低速率減緩(圖4)。發酵過程中,黃酮類物質因其酚羥基和羰基發生氧化、聚合而導致含量減少[13]。研究發現[3],總多酚、總黃酮與紅棗色素抗氧化活性有較強的相關性,發酵使紅棗果渣色素抗氧化活性降低可能是由于果渣中活性成分浸入到酒中,使活性成分含量下降所致。

圖3 紅棗果渣色素清除DPPH·的能力Fig.3 The DPPH· scavenging ability of pigment from jujube pomace

圖 4 發酵對紅棗果渣色素清除DPPH·能力的影響Fig.4 The effect of the fermentation on the DPPH· scavenging ability of pigment from jujube pomace

2.3 紅棗果汁果渣與果酒果渣色素清除ABTS+·能力

ABTS法是一種被廣泛用于測定總抗氧化能力的方法[26],紅棗果汁果渣與果酒果渣色素均具有一定的清除ABTS+·能力(圖5),且果汁果渣色素清除ABTS+·能力顯著強于果酒果渣色素(P<0.05);隨發酵時間延長,果渣色素清除ABTS+·能力逐漸降低(圖6),發酵4 d后,清除能力降速減緩,并趨于穩定。發酵后果渣色素清除ABTS+·能力降低可能是因酵母菌活動與抗氧化活性成分生成大分子物質及酒精含量逐漸升高有關[23]。

圖5 紅棗果渣色素清除ABTS+·的能力Fig.5 The ABTS+· scavenging ability of pigment from jujube pomace

圖 6 發酵對紅棗果渣色素清除ABTS+·能力的影響Fig.6 The effect of the fermentation on the ABTS+· scavenging ability of pigment from jujube pomace

2.4 紅棗果汁果渣與果酒果渣色素清除·OH能力

羥自由基(·OH)是生物體內最活潑且最具進攻性的活性氧自由基[27],因此·OH的檢測對評價清除自由基活性物質的活性作用研究具有重要意義。紅棗果汁果渣與果酒果渣色素清除·OH能力均較弱(圖7),但果汁果渣色素的清除能力顯著高于果酒果渣色素(P<0.05);發酵能明顯降低果渣色素清除·OH能力(圖8),發酵8 d的果渣色素清除·OH能力較未發酵的果汁果渣色素降低了10.32%。果渣經發酵處理后,色素清除·OH能力降低,可能是發酵促使棗渣中活性成分溶出,微生物破壞了棗渣中黃酮類和多酚類物質所致。

圖7 紅棗果渣色素清除·OH的能力Fig.7 The ·OH scavenging ability of pigment from jujube pomace

圖 8 發酵對紅棗果渣色素清除·OH能力的影響Fig.8 The effect of the fermentation on the ·OH scavenging ability of pigment from jujube pomace

2.5 紅棗果汁果渣與果酒果渣色素清除能力

圖9 紅棗果渣色素清除的能力 Fig.9 The scavenging ability of pigment from jujube pomace

圖 10 發酵對紅棗果渣色素清除能力的影響Fig.10 The effect of the fermentation on the scavenging ability of pigment from jujube pomace

2.6 紅棗果汁果渣與果酒果渣色素的還原力

抗氧化劑通過自身的還原作用,給出電子而使自由基變為穩定的分子,其本身失去活性[27],還原力與抗氧化活性呈明顯的量效關系,供電子能力越強,吸光值越大,還原力越強,即抗氧化活性越強[30]。紅棗果汁果渣與果酒果渣色素的還原力結果顯示(圖11),果汁果渣色素的還原力顯著高于果酒果渣(P<0.05)。發酵能降低紅棗果渣色素的還原力(圖12),但變化不甚明顯?？寡趸钚猿煞滞ㄟ^提供電子而使自由基被還原,起到抗氧化作用[31]。經過試驗表明發酵會影響紅棗果渣色素的還原力,但影響相對較小。

表1 紅棗果汁果渣色素抗氧化活性物質含量與抗氧化活性的相關性Table 1 Correlation between antioxidant components and antioxidant activity of pigment from jujube juice pomace

注:*,顯著相關(P<0.05);**,極顯著相關(P<0.01),表2同。

表2 紅棗果酒果渣色素抗氧化活性物質含量與抗氧化活性的相關性Table 2 Correlation between antioxidant components and antioxidant activity of pigment from jujube wine pomace

圖11 紅棗果渣色素的還原力Fig.11 The reducing power of pigment from jujube pomace

圖12 發酵對紅棗果渣色素的還原力的影響Fig.12 The effect of the fermentation on the reducing power of pigment from jujube pomace

2.7 抗氧化活性成分含量與抗氧化活性的相關性分析

3 結論

本實驗探究了紅棗果汁果渣與果酒果渣色素活性成分及抗氧化活性的差異,結果顯示紅棗果汁果渣色素抗氧化活性成分含量、抗氧化活性均顯著高于8 d發酵結束的果酒果渣色素(P<0.05),隨發酵時間延長,果渣色素抗氧化活性成分含量、抗氧化活性均明顯降低,說明發酵可使果渣色素抗氧化活性成分含量降低、抗氧化活性減弱,但果汁果渣色素抗氧化活性成分含量與抗氧化活性相關性較強,而果酒果渣色素總黃酮含量與抗氧化活性相關性相對較弱。綜上所述,紅棗果汁果渣或者發酵初期果酒果渣含有較多抗氧化活性成分,具有較高的抗氧化活性,可為開發天然抗氧化劑、提高紅棗附加值、開發功能性保健產品提供一定的理論參考。