QuEChERS-HPLC-MS/MS法在咖啡因中毒案例中的應用研究

(陜西津?qū)嵥痉ㄨb定中心， 西安 710075；2.山西警察學院，太原 030401；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，呼和浩特 010110)

1 前言

咖啡因(Caffeine)是從茶葉、咖啡果中提煉出來的一種生物堿，純咖啡因最初于1819年從咖啡植物中分離得到[1]。當咖啡因在人血液中濃度超過80μg/mL時就會導致死亡[2、3]。因此，在法醫(yī)工作中準確快速測定咖啡因在人體液中的濃度就成為十分重要的工作。測定血液和尿液中咖啡因濃度的常規(guī)方法有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[4]，高效液相色譜法(HPLC)[5、6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7]等，但以上方法中均存在前期處理復雜，分析時間長等缺點。

QuEChERS(SPE)法具有快速、簡單、廉價、有效、可靠和安全等特點，因此在農(nóng)獸藥殘留檢測中應用非常廣泛[8]，但在臨床毒物和法庭毒物學領(lǐng)域生物檢材中應用較少。在測定咖啡因中毒者血液與尿液中的咖啡因濃度時，采用QuEChERS-LC-MS/MS法可以快速、準確地得到測定結(jié)果。本研究通過對1例服用咖啡因中毒死亡的典型案例，利用QuEChERS前處理結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立一種快速、準確測定咖啡因中毒者血液和尿液中的咖啡因濃度的方法。

2015年初，作者對1例被發(fā)現(xiàn)死在家中的60歲女性尸體進行了尸檢。據(jù)警方介紹，死者有5年以上的肝硬化病史，經(jīng)勘察發(fā)現(xiàn)案發(fā)現(xiàn)場有感冒藥以及裝咖啡因片劑空瓶，推斷死亡時間在1d以內(nèi)。尸體在2～4℃冷藏柜中保存1d以后，送檢。

右手和左膝蓋部有輕微的皮下出血。眼瞼結(jié)膜、口唇粘膜、頭皮下、心臟表面有多數(shù)出血點。左心室內(nèi)膜有出血，心臟肥大，肺部淤血水腫，肝硬變。心臟重量為422g；胸腔內(nèi)積液右側(cè)為33mL，左側(cè)為7mL；肺重量，右肺為601g，左肺為517g。

采用氣相色譜用氫火焰離子檢測器(GC-FID)檢測死者血液中乙醇結(jié)果顯示陰性。采用免疫濫用藥物檢測板(Triage Drugs of Abuse Panel Plus TCA)對尿液進行檢測結(jié)果顯示陰性(該檢測板不具有咖啡因檢測屬性)。采用GC-MS(血液中常見藥毒物NAGINATA篩選法[9])分析股靜脈血，除檢出咖啡因外未檢出其他常見藥毒物，遂建立死者血液和尿液中咖啡因快速測定方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200系列快速分離液相色譜儀(美國 Agilent公司)；6460 三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(美國 Agilent 公司)，配有電噴霧離子源(ESI)。

標準品咖啡因(Product Number:C0750;CAS Number:58-8-2;Purity(HPLC):≥99%;Water(by Karl Fischer):≤0.5%)、內(nèi)標物己可堿(Pentifylline)(CAS No: 1028-33-7;Concentration:100%)與乙腈(色譜級)購于和光純藥工業(yè)株式會社。QuEChERS分散固相萃取柱(2mL，內(nèi)含25mg PSA、25mg C18EC、150mg MgSO4)和Captiva ND Lipids凈化管(3mL)購于安捷倫公司。

2.2 材料

檢材：死者股靜脈全血、尿液各采集10mL，-80℃超低溫冰箱保存。

2.3 色譜條件

實驗采用Agilent1200系列快速分離液相色譜系統(tǒng)和Agilent6460三重串聯(lián)四極桿儀。色譜柱：TSKgel Amide-80(2.0mm×25cm，粒徑3μm)；流動相A:0.1% TFA 超純水溶液:乙腈=5∶95(v∶v)溶液；流動相B:超純水溶液:乙腈=50∶50(v∶v)溶液；梯度洗脫：0～10min，0%B～60%B，平衡時間10 min，流速為0.25mL/min；柱溫：25℃；進樣量：3.5μL；

2.4質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓:500V，離子傳輸管溫度: 320℃。定性和定量均采用選擇性離子監(jiān)測(SRM)模式；咖啡因：m/z195→138、m/z195→110；己可堿：m/z265→138；碎裂電壓和碰撞能量；咖啡因：120和21V，己可堿：120和13V。

2.5 檢材前處理

采用1.5mL塑料離心管，加入0.1mL血液或尿液，加入內(nèi)標液(己可堿的乙腈溶液1mg/mL)10μL，再加入0.9mL乙腈溶液，渦旋10 s，離心 2min(20000r/min)，移取上清液至QuEChERS分散固相萃取(SPE)柱渦旋1min，離心 2min(20000 r/min)，移取上清液用Captiva NDLipids凈化管過濾至進樣瓶中，進行HPLC-MS/MS測定。

2.6 標準加入法

標準加入法是指將已知量的標準試樣加入到待測試樣中，測得試樣量和標準試樣的總響應值后，對試樣進行定量分析的方法，相比標準曲線法可以消除或減少基質(zhì)效應的影響。標準加入法經(jīng)常用于原子吸收光譜分析[10]以及人體體液檢材和固體組織檢材中毒(藥)物定量分析研究中[11]。

實驗具體步驟：配制咖啡因標準液濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、10μg/mL。取死者股靜脈全血和尿液各0.1mL7份置于1.5 mL離心管中，分別加入上述7個不同濃度的咖啡因標準液和10μg/mL的內(nèi)標溶液各10μL，按照“2.5”項前處理后進樣3.5μL，得7個點系列濃度。記錄咖啡因和內(nèi)標峰面積，以Y為樣品中咖啡因和內(nèi)標豐面積比值對添加的濃度X進行線性回歸，得到線性方程(Y等于0時X為樣品中咖啡因濃度的負值)。

2.7 基質(zhì)效應和提取回收率

本研究參考心臟肌肉和脂肪組織為基質(zhì)考察了基質(zhì)效應和提取回收率[12]中采用的方法應用到股靜脈血液、尿液的基質(zhì)效應和提取回收率。具體方法為:取0.1mL死者股靜脈全血和尿液樣品按“2.5”項前處理后用標準加入法[11]進行分析，得到股靜脈全血和尿液中的咖啡因濃度。準備咖啡因標準液兩種，其濃度分別為1/10樣品濃度和10倍的樣品濃度，然后取0.1mL股靜脈全血和尿液樣本按“2.5”項前處理后得到萃取液，取上述兩種萃取液各0.5mL加入5μL對應的 10倍樣品濃度的咖啡因標準液，渦旋，然后HPLC -MS/MS進樣3.5μL分析得到的峰面積為“A”，不加入標準液得到的萃取液進行HPLC-MS/MS進樣3.5μL分析得到的峰面積為“B”，對應的1/10樣品濃度的咖啡因標準液 HPLC-MS/MS進樣3.5μL分析得到的峰面積為“C”，基質(zhì)效應(%)等于[(A-B)/C]×100，提取回收率(%)等于[B/(A-B)]×100。

3 實驗結(jié)果

3.1 LC-MS/MS定性分析

圖1所示為標準品咖啡因乙腈溶液、死者股靜脈全血以及尿液萃取液的質(zhì)譜圖，結(jié)果顯示兩種萃取液的質(zhì)譜圖和標準物一致，無雜峰，確認物質(zhì)為咖啡因。

圖1 標本提取物的質(zhì)譜圖與標準咖啡因質(zhì)譜圖

圖2所示為咖啡因乙腈溶液、死者股靜脈全血和尿液萃取液、股靜脈萃取液添加和無添加內(nèi)標己可堿的選擇反應監(jiān)測色譜圖。結(jié)果表明咖啡因的保留時間為2.56min，內(nèi)標己可堿的保留時間為1.88min，無添加內(nèi)標的股靜脈全血在相應時間無干擾峰。

圖2 LC-MS/MS選擇反應監(jiān)測色譜圖

3.2 線性關(guān)系、檢測限

對案例血液和尿液中加入濃度為10～1000μg/mL 范圍的咖啡因時線性關(guān)系大于0.999，線性關(guān)系良好，如表 1所示。

表1 股靜脈全血和尿液中咖啡因標準加入法測定工作曲線

如果y=0，先前存在的濃度(x)可以以負值計算

空白血液和尿液中咖啡因在信噪比S/N=3的條件下檢出限(LOD)為10ng/mL，在信噪比S/N=10的條件下定量限(LOQ)為50ng/mL。

3.3 基質(zhì)效應、加標回收、精密度測定結(jié)果

由于正常人體血液和尿液中本身就含有咖啡因，因此無法做空白添加實驗，本次實驗使用標準添加法對死者血液、尿樣中咖啡因進行了定性和定量分析。取死者股靜脈全血和尿液各0.1mL置于1.5mL離心管中，按“2.7”項下方法計算基質(zhì)效應和提取回收率。結(jié)果顯示，基質(zhì)效應：股靜脈血液46.9%；尿液48.2%；提取回收率：股靜脈血液87.3%；尿液65.1%(n=5)。分別于當日和連續(xù)5日每天測定，計算日內(nèi)和日間精密度均小于15%。結(jié)果見表 2。

表2 股靜脈全血和尿液中咖啡因精密度測定結(jié)果

以平均標準偏差給出數(shù)據(jù)；RSD：相對標準偏差

3.4 定量結(jié)果

對死者的股靜脈全血和尿液進行了按“2.5”項前處理后用標準加入法[11]進行分析，結(jié)果顯示股靜脈全血樣品中咖啡因濃度為137μg/mL，尿液中咖啡因濃度為80.3μg/mL。

4 討論

已報道的全血和尿液中的咖啡因濃度分析方法， HPLC法[5、6]雖然成本低，但存在分析時間長、靈敏度低等缺點，不適合于全血和尿液中的咖啡因的快速測定。GC-MS[13、14]法存在預處理復雜，樣品需要氣化，檢測時間較長的不足，也不適合咖啡因中毒案例當中的快速測定。文獻[7]采用LC-MS/MS測定顯示咖啡因的出峰時間超過5min，而且預處理簡單沒有凈化管凈化，容易污染色譜柱。本實驗采用的QuEChERS 預處理法結(jié)合HPLC-MS/MS法分析血液和尿液中的咖啡因，全程分析在10min內(nèi)完成，具有靈敏度高、樣品處理簡單、快速的優(yōu)點。本研究另一優(yōu)勢在于試驗中使用標準加入法對被測的血液、尿液試樣中直接加入標準咖啡因液以及內(nèi)標液進行定量分析，無需空白樣品添加實驗，從而消除基質(zhì)效應、保證結(jié)果的準確性。

本方法分析經(jīng)勻漿處理的固體組織檢材，如腦、心臟、肝臟以及肌肉等組織中咖啡因，同樣取得了較高的提取回收率，證明該方法也適用于無體液材料的咖啡因中毒案例中咖啡因的定量分析。隨著QuEChERS 預處理技術(shù)發(fā)展，在臨床毒物和法庭毒物學領(lǐng)域生物檢材中有廣泛的應用空間。