酸化速率對大豆蛋白凝膠結構的調控

李倩如，熊 瑤，林嘉諾，葉 倩，繆 松，張龍濤,，鄭寶東

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.中愛國際合作食品物質學與結構設計研究中心，福建 福州 350002；3. Teagasc食品研究中心，愛爾蘭 科克 999014）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）作為一種優(yōu)質的植物蛋白源[1]，具有良好的功能特性[2]，如凝膠 性[3-6]、溶解性、保水性[7-10]等，因而被廣泛應用于食品工業(yè)。目前，SPI及其深加工產(chǎn)品遍及食品的各個領域，對其聚集和凝膠特性進行研究，力求對其凝膠過程進行調控也是研究熱點。Campbell等[11]通過控制SPI溶液的加熱次數(shù)，調控SPI聚集體的性質，進一步調控了大豆蛋白凝膠的質構特性。研究表明，大豆蛋白的聚集情況顯著影響大豆蛋白的凝膠性質[12]。

葡萄糖酸內酯（glucono-δ-lactone，GDL）誘導的大豆蛋白凝膠的凝固機理為GDL在水溶液中緩慢水解為葡萄糖酸，通過降低體系pH值，使蛋白質分子負電荷集團間靜電斥力降低，蛋白分子間不斷聚集、成膠。 武肖[13]通過對比不同的加熱和冷卻速率對大豆蛋白聚集和凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)凝膠點受加熱速率調控，而與冷卻速率無關，并且，較低加熱速率形成的三維網(wǎng)絡凝膠結構更加致密。李云[14]研究GDL誘導形成的大豆蛋白凝膠時，也發(fā)現(xiàn)慢速加熱時凝膠的保水性提高，而快速加熱時結果相反。GDL在水中的水解（酸化）速率與溫度成正相關，溫度越高，GDL酸化速率越快，蛋白分子的聚集和凝膠速率越快[15-16]。

迄今為止，關于酸化速率對大豆蛋白凝膠結構的研究較少。本實驗通過改變保溫溫度，以pH值、濁度為指標，揭示GDL酸化速率的變化，進一步探討GDL酸化速率對大豆蛋白凝膠的凝膠強度、剛性、保水性和微觀結構的影響，對調控大豆蛋白凝膠的形成過程、開發(fā)質構各異的大豆蛋白凝膠制品具有重要的理論意義和實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（＞90%蛋白） 山東嘉華保健品股份有限公司； GDL、Rhodamine B 麥克林生化科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司； TA.XT plus質構測試儀 英國Stable Micro System公司； UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司； MCR 301高級旋轉流變儀 奧地利安東帕有限公司；pH700型pH計 德信科技有限公司；JB300-D型攪拌器 上海標本模型廠；Allegra X-30R離心機 美國貝克曼有限公司；BSA224S電子天平、BSA2202S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TCS SP8X DLS激光共聚焦顯微鏡 Leica生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 GDL誘導的SPI凝膠的制備

將蛋白樣品取出添加去離子水配制60 g/L的SPI溶液，攪拌器攪拌2 h至完全溶解后，在4 ℃水化12 h，貯藏于4 ℃?zhèn)溆谩PI溶液在95 ℃水浴60 min至完全變性，加入GDL溶液至最終溶液中的SPI質量濃度為50 g/L，凝固劑質量濃度為5 g/L，SPI混合液放置于30、40、50、60、70、80、90 ℃條件下保溫30 min后自然冷卻成型，在4 ℃放置24 h，待測。

1.3.2 酸化速率的分析

1.3.2.1 樣品pH值的測定

將新鮮配好的GDL溶液加入大豆蛋白溶液，使蛋白總質量濃度為50 g/L，凝固劑質量濃度為5 g/L，SPI混合液放置在30、40、50、60、70、80、90 ℃條件下保溫，每隔10、20、30、60、90、120、180、240、360、480 min，將SPI凝膠取出，在25 ℃水浴鍋內平衡5 min后，測定pH值。

1.3.2.2 濁度測定

根據(jù)María等[17]的方法作適當修改，用UV-1800紫外-可見分光光度計測量共混溶液的濁度。蛋白溶液在95 ℃加熱1 h后，與新鮮配制的GDL溶液混合至最終溶液中的SPI質量濃度為50 g/L，凝固劑質量濃度為5 g/L。取4 mL的液體混合物在波長600 nm處測量吸光度。

1.3.3 凝膠強度的測定

按照1.3.1節(jié)方法制備凝膠。參照Cardoso等[18]的方法并稍作修改，將凝膠在4 ℃貯藏24 h之后，利用TA. XT plus物性測試儀測定凝膠強度。探頭型號P/0.5，測前速率1 mm/s，測試速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，測定距離為10 mm，觸發(fā)力5 g，觸發(fā)類型為自動，實驗設置6 個平行樣品。

1.3.4 保水性的測定

參照Maltais等[19]的方法，將含有凝膠的試管在25 ℃條件下10 000×g離心10 min，然后倒轉30 min，使析出的水分充分釋放。保水性為離心后凝膠質量占離心前凝膠質量的百分比，實驗設置3 個平行樣品。

1.3.5 頻率掃描測定

使用MCR 301旋轉流變儀，配備PP50（1 mm間隙）平行板進行頻率掃描。用刀片剪切凝膠，制備樣品。在25 ℃、0.1～10 Hz、應力1%條件下進行頻率掃描，記錄模量。

1.3.6 微觀結構分析

1.3.6.1 激光共聚焦掃描測試

將成膠前的大豆蛋白共混溶液與染色染料Rhodamine B（10 μg/g）混合后，按1.3.1節(jié)方法，將共混溶液滴入凹槽載玻片，加一層蓋玻片且在四周涂一層指甲油防止水分蒸發(fā)后，分別放在各溫度下保溫成膠。激發(fā)波長543 nm，在560～700 nm范圍內進行觀測。

1.3.6.2 圖像的分形分析

采用ImageJ 1.50i對激光共聚焦圖像進行處理，閾值化所用的灰度值是根據(jù)Eduard等[20]的方法分析每幅圖像的灰度直方圖的中值。按式（1）和（2）的分形盒計數(shù)法計算分形維數(shù)（D?）：

式中：N?為包含某一部分圖像的某一尺度上的盒子的數(shù)量；?為對應的尺度；D為分形維數(shù)；D?為一個額外的維度用于真實地表示凝膠的三維特征。

1.4 數(shù)據(jù)分析

除凝膠強度測定6 次，其他均測定3 次。實驗數(shù)據(jù)采用DPS和Origin 8.5軟件進行統(tǒng)計分析，每組數(shù)據(jù)均進行單因素方差分析（ANOVA），平均值差異的統(tǒng)計學顯著性 （P＜0.05）通過LSD測試進行評估，所有結果均以±s表示。

2 結果與分析

2.1 酸化速率的分析

圖 1 保溫溫度對SPI凝膠pH值的影響Fig. 1 Effect of incubation temperature on the pH value of soy protein isolate gels

2.1.1 pH值的測定結果

GDL溶于水后會逐漸分解成葡萄糖酸，釋放酸性離子H+，中和蛋白質的表面電荷，降低共混體系的pH值，使蛋白質聚集、沉淀、成膠[11,21-23]。如圖1所示，SPI凝膠樣品的最終pH值穩(wěn)定在5.17。隨著保溫溫度的升高，SPI凝膠的pH值下降速率增加，這是因為GDL分解速率隨保溫溫度的升高而加快，酸化速率增加[15-16]。當保溫溫度不大于60 ℃時，樣品在10 h之后達到穩(wěn)定pH值，酸化速率慢。當保溫溫度為90 ℃時，樣品在2 h時便達到穩(wěn)定pH值。由此表明，通過改變保溫溫度，可以顯著調控大豆蛋白凝膠被酸化的速率。

2.1.2 濁度測定結果

圖 2 保溫溫度對SPI溶液濁度的影響Fig. 2 Effect of incubation temperature on the turbidity of soy protein isolate solution

當?shù)鞍拙奂脑窖杆伲奂潭仍礁撸鞍诐岫仍礁遊17]。由圖2可知，隨著保溫溫度的升高，SPI溶液的濁度越高，形成凝膠的時間越短。當保溫溫度不大于40 ℃時，蛋白溶液在保溫30 min后仍未形成凝膠，而當保溫溫度不小于50 ℃時，蛋白在保溫30 min的過程中均已開始形成凝膠，SPI溶液在90 ℃保溫1 min后即形成凝膠。結合SPI凝膠pH值的測定結果，不同的保溫溫度可以調控SPI凝膠被酸化的速率。

2.2 凝膠強度的測定

圖 3 保溫溫度對SPI凝膠的凝膠強度的影響Fig. 3 Effect of incubation temperature on the gel strength of soy protein isolate gels

由圖3可知，隨著保溫溫度的升高，SPI凝膠的凝膠強度不斷提高。30 ℃和40 ℃保溫形成的蛋白凝膠的凝膠強度無顯著差異，這是因為當保溫溫度不大于40 ℃時，酸化速率較慢，蛋白聚集程度較低，蛋白溶液在保溫30 min后均未形成凝膠，凝膠結構極弱。當保溫溫度提高到50 ℃時，酸化速率加快，蛋白聚集加快，蛋白溶液在保溫20 min后便凝固成膠，凝膠強度顯著增大。當保溫溫度不大于60 ℃時，凝膠樣品在10 h之后才達到穩(wěn)定pH值，凝膠結構固化時間短，凝膠強度較低，當保溫溫度由60 ℃提高到70 ℃時，酸化速率顯著加快，蛋白在保溫10 min的過程中均已開始形成凝膠，蛋白凝膠固化時間較長，凝膠結構更為穩(wěn)定，所以凝膠強度顯著增大[24-25]。

2.3 頻率掃描結果

圖 4 保溫溫度對SPI凝膠頻率掃描過程中G’的影響Fig. 4 Effect of incubation temperature on the storage modulus of soy protein isolate gels during frequency sweep

由圖4可知，SPI凝膠的儲能模量（G’）在0.1～10 Hz范圍內是頻率相關的，即形成了SPI凝膠結構，具有典型的黏彈性材料屬性[26-27]。當保溫溫度不大于50 ℃時，酸化速率較慢，SPI凝膠達到穩(wěn)定pH值需較長的時間（≥10 h），蛋白聚集體之間彼此交聯(lián)形成凝膠的時間長，凝膠固化時間短，因此，在30、40、50 ℃的保溫溫度下G’間無顯著性差異。當保溫溫度為60 ℃時，酸化速率加快，蛋白聚集體之間迅速發(fā)生交聯(lián)，蛋白凝膠在保溫10 min后便固化成膠，G’增大，凝膠剛性增大。隨著保溫溫度的升高，酸化速率不斷增加，蛋白聚集和凝膠速率不斷增加，凝膠剛性不斷增加，90 ℃時達到最大[28]。

2.4 保水性的測定

圖 5 保溫溫度對SPI凝膠的保水性的影響Fig. 5 Effect of incubation temperature on the water holding capacity of soy protein isolate gels

如圖5所示，隨著保溫溫度的升高，SPI凝膠的保水性先增加后降低，60 ℃時達到最大。當保溫溫度小于60 ℃時，酸化速率過慢，pH值變化緩慢，聚集速率過慢，凝膠形成緩慢，需較長時間才可達到穩(wěn)定狀態(tài)，凝膠結構較弱，因而形成的凝膠保水性差。當保溫溫度大于60 ℃時，酸化速率過快，pH值下降過快，聚集過快，形成的聚集體較大，凝膠結構粗糙，不均勻，凝膠的保水性相較于最優(yōu)的酸化速率條件下（60 ℃保溫）的保水性有所下降[17]。當保溫溫度為60 ℃時，GDL分解速率最為適中，SPI被酸化的速率最優(yōu)，因而形成的三維網(wǎng)絡結構最為致密均勻，凝膠保水性最優(yōu)。該結果與SPI凝膠的凝膠強度變化趨勢不同，這是因為蛋白凝膠的保水性主要受蛋白分子網(wǎng)絡結構的致密程度所調控，而不是凝膠強度[29-30]。

2.5 微觀結構分析

圖 6 不同保溫溫度形成的SPI凝膠的共聚焦圖和對應的二進值圖Fig. 6 Confocal laser scanning microscopic images and corresponding binary images of soy protein isolate gels formed at different incubation temperatures

如圖6所示，當保溫溫度在60 ℃時，形成的SPI凝膠結構最為均勻致密，其分形維數(shù)達到最大值2.90±0.010；30 ℃保溫時，分形維數(shù)為2.88±0.010，凝膠結構松散、不致密，這是因為酸化速率過低，蛋白分子聚集速率過慢，不能形成致密的凝膠結構，保水性較低；90 ℃保溫時，分形維數(shù)最低2.86±0.010，這是因為在該溫度下體系酸化速率過快，蛋白分子迅速聚集沉淀，形成團簇狀結構，因而凝膠結構空隙較多，凝膠的致密均勻程度降低。該結果與SPI凝膠保水性的結果相同，這也進一步表明蛋白凝膠的保水性主要受蛋白分子結構的致密程度調控[29-30]。

3 結 論

本實驗研究酸化速率對GDL誘導的SPI凝膠結構的影響，pH值和濁度的測定結果表明，通過改變保溫溫度可以顯著調控蛋白凝膠的酸化速率。當保溫溫度不斷升高，GDL凝固劑的釋放速率越來越快，SPI凝膠的pH值的下降速率越來越大，同時，蛋白溶液的濁度不斷增加，表明蛋白聚集速率的增加，凝膠形成速率的加快。隨著酸化速率的增加，SPI凝膠的凝膠強度和剛性不斷提高，但是，保水性先增加后降低，在60 ℃時達到最大值。微觀結構的測定結果顯示，在60 ℃保溫的SPI凝膠的結構最為均勻致密。綜上所述，GDL的酸化速率可以調控SPI凝膠的質構特性，制成質構各異的SPI凝膠。