發酵罐結構對浙江玫瑰醋品質的影響

方冠宇，穆曉靜，蔣予箭

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

浙江玫瑰醋是江浙一帶的傳統調味品，有著悠久的生產歷史。玫瑰醋生產一年只投料一次，大米經浸米、蒸飯、發花、沖缸放水發酵、后熟、壓榨、滅菌等生產步驟需要耗時達6 個月之久，整個生產過程以天然發酵、手工操作為主[1-2]，品質難控制、勞動強度大、規模效益很差[3]。隨著勞動力成本的不斷提高，急需尋求能有效替代傳統手工生產工藝的機械化生產方式。

傳統發酵食品一般采用純手工釀造工藝[4-5]，為提高生產效率，很多企業對傳統發酵食品的生產工藝進行了機械化改進。鎮江香醋實現了微機集散控制系統制酒醪，實現了大罐發酵，對糯米粉碎蒸煮實現了機械化和連續化，對蒸煮、液化、糖化、冷卻、發酵各個環節的溫度時間實施自動控制，改變了傳統酒醪生產隨季節變化易產生的不穩定性，用冷卻設備調節室溫和發酵溫度，實現了酒醪常年生產質量穩定[6]。洪厚勝等[7]通過添加糖化曲和多菌協調發酵改善風味，實現了米醋的半連續發酵。劉選成等[8]利用數字化釀造工藝管理系統在濃香型白酒生產中應用，實現了濃香型白酒機械化、自動化和智能化生產。劉杰等[9]利用高溫糖化酵母和干酵母實現了黃酒機械化生產。

由于浙江玫瑰醋獨特的生產工藝，攪拌方式對其品質會有很大的影響。不同的攪拌方式以及攪拌頻率對發酵過程會有不同的影響[10-11]。Goksel等[12]用通氣法對發酵液進行攪拌，發現攪拌效果良好；Karim等[13]研究發現，在不同條件下，回流攪拌法和機械攪拌法對厭氧發酵的影響不同；阮富升等[14]曾嘗試用自吸式發酵生產玫瑰醋，但其成品的色澤及風味均與傳統方法生產的玫瑰醋有顯著差異。本研究設計了回流攪拌發酵罐、氣動攪拌發酵罐和機械攪拌發酵罐，對浙江玫瑰醋沖缸放水后，進行機械化釀造，并對發酵結束后浙江玫瑰醋的理化指標、有機酸、氨基酸、揮發性成分及感官指標進行測定分析，得出不同機械化釀造工藝對浙江玫瑰醋理化指標和風味的影響，為浙江玫瑰醋實現機械化生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米產自安徽滁州。

乳酸、丙酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、L-酒石酸、α-酮戊二酸、草酸（純度＞99%） 國藥集團化學試劑有限公司；2-乙基丁酸、乙醇、乙酸、乙酸乙酯、苯甲醛（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

LC-2010AHT高效液相色譜 日本島津儀器公司；UPWS-1-60D超純水設備 杭州永潔達凈化科技有限 公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；85 μm PA固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 浙江玫瑰醋傳統釀造工藝

以秈米為原料，常溫浸米7 d（隔天換水），常壓蒸飯（控制出飯率220%）；每缸投入飯220 kg，搭窩，常溫（5 月份）發花16 d；發花結束時，按米-水質量比1∶3沖缸放水，進行為期4 個月左右的發酵，當酸度不再上升時，添加3%食鹽，進行后熟。

1.3.2 實驗設計

本研究在浙江玫瑰醋沖缸放水之后，選取回流攪拌、氣動攪拌和機械攪拌3 種發酵罐對玫瑰醋進行發酵，回流攪拌發酵罐、機械攪拌發酵罐、氣動攪拌發酵罐和傳統發酵缸裝液量均為1 000 L，發酵罐設計見圖1。

圖 1 發酵罐設計圖Fig. 1 Design drawing of fermenters

對每一種發酵罐的攪拌頻率進行探索（3 d 1 次、5 d 1 次、7 d 1 次），以傳統方法釀造的玫瑰醋為發酵過程對照。實驗設計見表1，實驗流程見圖2。

表 1 發酵罐生產浙江玫瑰醋實驗方法設計（n＝3）Table 1 Experimental design for producing Zhejiang rosy vinegar with different fermenters (n = 3)

圖 2 實驗流程圖Fig. 2 Flow chart of the experiment

1.3.3 產醋得率的測定

總酸含量測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，得率以1 kg大米產醋質量計。

1.3.4 有機酸高效液相色譜測定條件

Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相5%甲醇-95% 6 g/L磷酸二氫銨（pH 2.60）；流速0.8 mL/min；進樣體積5 μL；柱溫30 ℃；紫外檢測器；檢測波長210 nm。

1.3.5 揮發性風味物質的測定

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；進樣口溫度240 ℃，不分流進樣，載氣為氦氣，恒流模式，柱流速1 mL/min；柱溫：30 ℃保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

質譜條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍33～500 u。

將內標物2-乙基丁酸溶液和乙醇、乙酸、乙酸乙酯、苯甲醛混合標樣等體積混合后，吸取100 μL加入到10 mL醋樣中，計算各香氣組分的相對校正因子，得出各組分的保留時間和峰面積。相對校正因子（fi）和待測風味物質含量的計算如式（1）、（2）所示：

式中：ΔWi和ΔAi分別為組分標品i的增加含量和對應增加峰面積；Ws和As分別為內標物s含量與峰面積。

式中：Wi和Ai分別是被測組分含量與峰面積；Ws和As分別為內標物含量與峰面積。

1.3.6 感官鑒定

選取1 0 人（釀醋企業員工5 人，實驗室人員5 人），按要求進行培訓。對玫瑰醋各項指標進行打分，最好為10 分，最差為0 分，取平均值[15]。

1.4 數據分析

采用E x c e l 等軟件對數據進行統計分析，折線圖、柱狀圖等采用采用Origin 8進行繪制，聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）以及圖形繪制采用SIMCA-P軟件。

2 結果與分析

2.1 發酵結束浙江玫瑰醋得率分析

表 2 發酵結束玫瑰醋得率Table 2 Yield of rosy vinegar produced using different fermenters with different stirring frequencies

不同發酵罐的攪拌方式和攪拌頻率對浙江玫瑰醋發酵過程有顯著影響，為探究不同發酵罐以及不同攪拌頻率對浙江玫瑰醋得率的影響，將發酵結束的玫瑰醋換算成4 g/L的成品醋，計算浙江玫瑰醋的得率。由表2可以看出，2-2和3-2組玫瑰醋的得率高于傳統玫瑰醋，說明用氣動攪拌發酵罐和機械攪拌發酵罐，攪拌頻率為5 d 1 次生產浙江玫瑰醋可以提高浙江玫瑰醋的得率。機械攪拌發酵罐攪拌頻率為7 d 1 次生產玫瑰醋的得率與傳統玫瑰醋相近。采用回流攪拌發酵罐生產浙江玫瑰醋其得率都顯著低于傳統玫瑰醋，因此不適宜用回流發酵罐生產浙江玫瑰醋。

浙江玫瑰醋的發酵是一種靜態表面發酵過程，其表面的菌膜在玫瑰醋的醋酸發酵中起重要作用。大量研究表明菌膜是由醋酸菌產生的細菌纖維素[16-17]。在靜態表面發酵過程中，由醋酸菌產生的多糖菌膜使細胞聚集并可以改善細菌適應環境的能力。此外，菌膜將醋酸菌漂浮在發酵液表面，為醋酸菌提供呼吸空間，促進乙酸發酵過程。隨著時間的推移，在醋酸菌細胞周圍產生過量的纖維素，這將阻礙醋酸菌與空氣和發酵液之間的物質交換。攪拌頻率過高，會持續對菌膜進行破壞；攪拌頻率過低，則產生的細菌纖維素會對醋酸菌產生消極 作用[18]，都會影響醋酸菌的生長。

在乙醇發酵階段，以較高頻率攪拌可以使發酵液通入適量氧氣、排出二氧化碳和生化作用產生的熱量，并且使物料混勻，有利于酵母菌的增殖。但乙醇發酵過快，乙醇體積分數快速升高，會對酵母產生抑制，而淀粉轉化為糖卻在繼續進行，導致玫瑰醋殘余的還原糖較高，最終得率較低；攪拌頻率過快，會對醋酸菌菌膜產生持續破壞，并且乙醇體積分數過高也會對醋酸菌產生抑制，導致醋的酸度很難上升，容易引起醋的腐敗。攪拌頻率最低，酵母菌的增殖速度最慢，乙醇發酵速度較慢，以至于在有較多還原糖剩余時，由于酸度上升酵母菌生長受到抑制，停止了乙醇發酵，也會降低玫瑰醋最終得率。

2.2 玫瑰醋有機酸含量分析

在各組玫瑰醋發酵完成之后，利用高效液相色譜對各組玫瑰醋樣品中有機酸含量進行測定。并用HCA、PCA等方法對玫瑰醋中有機酸含量進行分析，比較不同發酵罐以及攪拌頻率對玫瑰醋樣品中有機酸含量的影響，以傳統玫瑰醋為對照。

表 3 發酵結束玫瑰醋中有機酸質量濃度Table 3 Organic acid contents of rosy vinegars produced using different fermenters with different stirring frequencies

由表3可以看出，9 種特征性有機酸在玫瑰醋樣品里都有檢出，用回流攪拌法生產玫瑰醋的有機酸含量低于其他組玫瑰醋樣品。乙酸和乳酸在所有玫瑰醋樣品中所占比例最大，占特征性總酸的90%左右。其他7 種有機酸（草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、焦谷氨酸、丙酮酸）含量較低，這些有機酸大部分是三羧酸循環途徑的中間代謝物，在生成的同時也被作為其他代謝途徑的前體進入更為復雜的代謝途徑，所以其在醋酸發酵過程中不會有大量積累[19]，但它們對食醋的滋味和風味起重要的作用。乙酸是食醋酸味的主要來源，主要是乙醇發酵環節的密閉發酵期或醋酸發酵環節后期的米醋發酵醪中的乳酸桿菌和鏈球菌作用而生成，除此之外，有些種類的乳酸菌能將丙酮酸作為受氫體而生成乳酸[20]。單純的醋酸刺激性很大，回味短。非揮發性酸含量提高對豐富醋的風味有重要意義，蘋果酸酸味圓潤持久，琥珀酸有鮮味，蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸能緩沖乙酸的刺激性，可以提高食醋的酸味平和性[21-24]。

圖 3 發酵結束玫瑰醋中非揮發酸含量Fig. 3 Non-volatile acid contents of rosy vinegars produced using different fermenters with different stirring frequencies

由圖3可以看出，各醋樣的非揮發性酸含量差異比較顯著。用機械攪拌法生產的玫瑰醋的非揮發性酸含量顯著高于其他醋樣，這是由于機械攪拌對發酵液攪拌比較劇烈，對物料破碎比較充分，可以增加發酵液中的溶氧量，有利于微生物的繁殖代謝，因此可以積累大量代謝產物，非揮發性有機酸大量積累。3-3醋樣中的非揮發性酸質量濃度最高，高達25.59 g/L，說明用機械攪拌法生產玫瑰醋有助于非揮發性酸的積累。用回流攪拌法生產的玫瑰醋的乳酸含量顯著高于其他醋樣。氣動攪拌法生產的玫瑰醋的非揮發酸含量與傳統方法生產的玫瑰醋非揮發酸含量相當。由圖4可以看出3 種發酵罐的攪拌效果，利用發酵罐以及傳統手工對發酵液進行攪拌后，發酵液中溶氧量以及發酵罐氧氣體積分數均會大幅上升，但攪拌后，兩者均會快速下降，在120 min后維持動態平衡。說明攪拌對發酵提供的氧氣很有限，基本可以忽略，因此攪拌頻率對玫瑰醋中的有機酸影響較小。這與浙江玫瑰醋是靜態表面發酵的情況相符。回流攪拌發酵罐在攪拌后發酵罐氧氣含量顯著低于其他組，發酵液溫度顯著高于其他組，這是由于回流攪拌發酵罐口徑較小，不利于氣體交換和散熱。而低氧氣濃度和高溫都有利于乳酸菌的生長，因此回流攪拌發酵罐中的乳酸含量顯著高于其他組。氣動攪拌發酵罐的形狀與傳統缸一致，因此攪拌后發酵液中的溶氧量、發酵罐內其他氧氣含量、發酵液溫度無顯著差異，兩者有機酸含量較相似。

圖 4 3 種發酵罐攪拌效果圖Fig. 4 Changes in the amount of oxygen dissolved in fermentation broth, oxygen concentration in fermenters and fermentation broth temperature after stirring

圖 5 發酵結束玫瑰醋中有機酸HCA（A）和PCA（B）結果Fig. 5 HCA (A) and PCA (B) plots of organic acid contents in rosy vinegars produced using different fermenters

由圖5可以看出，不同發酵罐發酵對玫瑰醋中有機酸含量影響較大。HCA將醋樣分為4 大類，由PCA結果可以看出，回流法發酵罐發酵的玫瑰醋乳酸含量比較突出，氣動攪拌發酵罐和傳統方法生產的玫瑰醋呈味有機酸為琥珀酸，機械攪拌發酵罐生產的玫瑰醋呈味有機酸主要為α-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸，以上結果說明攪拌方法對玫瑰醋中的有機酸含量影響較大，攪拌頻率對有機酸含量基本無影響。

2.3 玫瑰醋中揮發性成分分析

玫瑰醋香氣是衡量其品質的一個重要指標，實驗用氣相色譜-質譜對各組玫瑰醋樣品中的揮發性成分進行分析，采用計算機檢索譜庫，由Xcalibur軟件系統完成，未知化合物通過計算機檢索與NISTDEMO2.0譜庫相匹配，對正反匹配度都大于800（最大值為1 000）的鑒定結果給予定性，結合化學成分的保留時間、質譜圖譜、實際成分和保留指數等鑒定化合物結構，從而確定浙江玫瑰醋的香氣組成成分。

用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜對機械化生產醋樣的揮發性成分進行測定，以傳統釀造玫瑰醋作對照，共檢測出67 種揮發性成分，結果見表4。其中醇類物質10 種、酸類物質10 種、酯類物質29 種、醛類物質4 種、酚類物質6 種、酮類物質6 種。各類揮發性成分含量見 圖6（由于乙酸已經用高效液相色譜精確測出，因此這里不對乙酸進行討論）。

表 4 玫瑰醋發酵結束發酵罐中揮發性成分質量濃度Table 4 Volatile composition of rosy vinegars produced using different fermenters mg/L

續表4

在所有玫瑰醋樣品中，含量較高的醇類物質為乙醇、苯乙醇、3-甲基正丁醇。采用機械攪拌法生產的玫瑰醋其醇類物質含量要高于其他組。這些醇是醋中風味的重要貢獻者[25]。苯乙醇是苯丙氨酸在酵母作用下經Strecker降解產生醛后進一步還原生成[26]，這種化合物目前被鑒定為酒中主要的芳香族化合物[27]。苯乙醇在玫瑰醋樣品中含量很高，占醇類物質總含量的60.00%左右，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香可以賦予玫瑰醋良好的香味。

圖 6 發酵結束玫瑰醋中揮發性成分含量Fig. 6 Contents of various classes of volatile components in rosy vinegars produced using different fermenters

在玫瑰醋樣品中檢出含量較高的酸類物質（除乙酸）為3-甲基丁酸、辛酸、癸酸。但在回流法釀造的玫瑰醋中未檢出3-甲基丁酸和癸酸。3-甲基丁酸是以支鏈氨基酸L-亮氨酸為前體經微生物降解生成。3-甲基丁酸被認為是酵母蛋白質代謝的副產物。3-甲基丁酸是牛奶香氣、酸味香氣、水果香氣和脂肪香氣的組合。可以賦予玫瑰醋良好風味[28]。

酯類物質在玫瑰醋中含量很高，玫瑰醋中主要的酯類物質為乙酸乙酯、2-苯乙酸乙酯、乙酸異戊酯。機械攪拌法生產的玫瑰醋乙酸乙酯含量顯著高于其他各組樣品。用回流攪拌法生產的玫瑰醋酯類物質含量顯著低于其他組。用氣動攪拌法生產的玫瑰醋其酯類物質含量與傳統方法生產玫瑰醋相當。酯類化合物的形成途徑主要有兩條：一是在酯酶的催化下由酸類化合物和相應的醇類化合物縮合而成；二是乙酰輔酶A在醇酰基轉移酶的作用下和相應的醇類化合物縮合形成。酯類物質大多具有花香和果香味，可以賦予玫瑰醋良好的香味[29-30]。

玫瑰醋中檢測出的醛類、酚類和酮類物質的種類很少。各組玫瑰醋醛類和酚類物質含量相當。但用氣動攪拌法生產的玫瑰醋的酮類物質顯著低于其他各組。玫瑰醋中醛類物質含量最高的是苯甲醛，其具有甜味、果味、堅果和焦糖氣味，可以賦予醋樣品良好的香氣。由圖6可以看出，酚類物質含量是所有香氣成分中最低的，但由于它們的氣味閾值低，它們的味道是食醋特有的香氣[31-33]。

回流攪拌發酵罐的氣體交換和散熱效果比其他發酵罐差（圖4），發酵過程出現異常，因此用回流攪拌發酵罐生產的玫瑰醋酯類、酸類、醛類揮發性成分顯著低于其他玫瑰醋樣品，品質較差。機械攪拌發酵罐攪拌強度很大，對物料攪拌較為充分，有利于發酵液中的生化反應，生產的玫瑰醋中酯類物質含量顯著高于其他玫瑰醋樣品，酯類物質具有花香和果香味，可以賦予玫瑰醋良好的香氣。氣動攪拌發酵罐形狀及攪拌效果與傳統手工釀造相似，因此其揮發性成分的組成與傳統玫瑰醋相似，其品質與傳統玫瑰醋接近。

圖 7 發酵結束玫瑰醋中揮發性成分含量HCA（A）和PCA（B）結果Fig. 7 HCA (A) and PCA (B) plots of volatile components of rosy vinegars produced using different fermenters

對各醋樣的揮發性成分（包括揮發性有機酸）含量進行HCA和PCA[34-36]，結果見圖7。可以看出，攪拌頻率對玫瑰醋揮發性成分含量影響不大，但攪拌方法對揮發性成分的影響較大。HCA將玫瑰醋樣品分為3大類：Group 1：以不同頻率攪拌的回流攪拌法生產的玫瑰醋；Group 2：以不同頻率攪拌的機械攪拌法生產的玫瑰醋；Group 3：以不同頻率攪拌的氣動攪拌法生產的玫瑰醋和傳統方法生產的玫瑰醋。回流攪拌法生產的玫瑰醋與機械攪拌、氣動攪拌和傳統玫瑰醋有較大差異。傳統方法生產的玫瑰醋與氣動攪拌生產的玫瑰醋聚為一類，說明氣動攪拌法釀造的玫瑰醋與傳統方法釀造的玫瑰醋的揮發性成分構成比較接近。其中2-2與傳統方法釀造的玫瑰醋單獨聚為一個小類，說明用氣動攪拌并且攪拌頻率為5 d 1 次生產的玫瑰醋的揮發性成分構成與傳統方法釀造的玫瑰醋最接近。

由圖7B可以看出，各類玫瑰醋的呈味物質有所差異，由回流攪拌法生產的玫瑰醋分布很集中，處于第4象限。傳統方法生產的玫瑰醋與氣動攪拌法生產的玫瑰醋比較靠近可以分為一類，說明以氣動攪拌法對玫瑰醋進行攪拌時，其攪拌強度和攪拌后的溶氧量與傳統方法對玫瑰醋進行攪拌相似。PCA的結果與HCA結果一致。由圖7可以看出，Group 1的呈味物質主要有辛酸、苯乙酸乙酯、2-乙基丁酸乙酯、十二烷酸、2-苯乙酸乙酯等；Group 2的呈味物質主要有辛酸乙酯、壬酸乙酯、丁二酸二乙酯、2-甲基丙酸乙酯等；Group 3的呈味物質主要有糠醛、癸酸乙酯、己酸乙酯、苯甲醛等。

2.4 感官評定

圖 8 發酵結束的玫瑰醋感官評定結果Fig. 8 Sensory evaluation of rosy vinegars produced using different fermenters

由圖8可以看出，由氣動攪拌發酵罐生產的浙江玫瑰醋與傳統玫瑰醋感官比較相近。各感官指標在達到最佳時得分最高，因此各組玫瑰醋在雷達圖上圍成的面積可以定量評價醋樣的感官得分，分別為：1-1：204.34；1-2：226.25；1-3：209.89；2-1：230.71；2-2：270.28；2-3：214.89；3-1：208.87；3-2：240.28；3-3：215.39；傳統：256.12。由于氣動攪拌發酵罐的形狀與攪拌效果與傳統玫瑰醋相似，氣動攪拌發酵罐生產的玫瑰醋在有機酸、揮發性成分組成與傳統玫瑰醋最接近，因此其感官評定結果也與傳統玫瑰醋接近。回流攪拌發酵罐由于設計的不合理性，導致散熱和氣體交換受阻，因此玫瑰醋的感官評定結果較差。由結果可以看出，只有2-2玫瑰醋的感官得分高于傳統玫瑰醋。因此用氣動攪拌發酵罐，并且攪拌頻率為5 d 1 次的生產方式可以生產較高質量的玫瑰醋。

3 結 論

用氣動攪拌發酵罐和機械攪拌發酵罐，攪拌頻率為5 d 1 次的釀造方式，可以將浙江玫瑰醋得率從傳統的7.84 kg分別提高到8.25 kg和8.13 kg；用回流攪拌發酵罐生產的玫瑰醋乳酸含量較高，機械攪拌發酵罐可以提高玫瑰醋中非揮發有機酸酸含量，對有機酸含量進行PCA和HCA，發現不同發酵罐對浙江玫瑰醋有機酸組成有較大影響，攪拌頻率對有機酸影響不大；隨著攪拌頻率的增加可以增加玫瑰醋中氨基酸含量；用回流攪拌發酵罐生產的浙江玫瑰醋揮發性成分顯著低于其他玫瑰醋，對揮發性成分含量進行PCA和HCA，發現不同發酵罐對玫瑰醋中揮發性成分影響較大，攪拌頻率影響較小。采用氣動攪拌發酵罐并且攪拌頻率為5 d 1 次的生產方式生產的玫瑰醋與傳統玫瑰醋品質最接近。本研究為浙江玫瑰醋實現機械化生產提供了理論支持。