核黃素介導的光動力技術的研究進展

林以琳,邱建清,李世洋,曾紹校,林少玲

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350000)

核黃素是人體必需的維生素,具有一定的熒光性及光敏特性。近年來,核黃素作為人體生命活動不可缺少的維生素,對改善生物體的新陳代謝以及促進人體的生長發育發揮著重要的作用。但核黃素作為一類重要光敏劑[1],在光生物學上具有一定的光動力治療特性。據報道,核黃素是異四氧嘧啶環激發產生的一種光敏劑,當氧化劑存在時,核黃素被氧化且在492～495 nm或517～527 nm的激發光發射范圍內可以檢測到熒光。核黃素光敏特性在治療腫瘤癌癥等疾病中已得到充分的應用,且作用效果顯著。

目前,應用較為廣泛的光敏劑主要有姜黃素、亞甲基藍、血啉甲醚等。光敏劑作為光動力技術的核心要素,參與光動力反應的全過程。因此,開發天然、有效、具有營養價值的光敏劑對于光動力技術的突破具有重大研究價值。光動力技術作為一種新型的治療手段,能夠有效地作用于目標物,且不損傷鄰近組織,在腫瘤與癌癥的治療當中已得到廣泛的關注。相較于傳統的放療、化療方式,光動力技術具有高效、安全、經濟環保等特點[2-3]。核黃素是一類新型的具有營養價值的光敏劑,已被應用于腫瘤癌癥、植物病蟲害及生物體中病毒和有害微生物的控制。

因此,本文綜述了核黃素作為光敏劑的光動力技術的研究進展,總結了核黃素介導的光動力技術在治療疾病、病蟲害以及生物體中發揮的應用,并就其對人體健康的影響進行總結,為將其進一步應用于食品安全領域提供參考。

表1 核黃素的功能Table 1 Functions of riboflavin

1 核黃素的生理功能及光學特性

1899年,英國化學家Wynter Blyth在牛奶中提取出一種亮黃色的色素,并將其命名為乳黃素,即核黃素[4]。核黃素作為水溶性B族維生素,微溶于水,呈強黃綠色熒光,其化學結構如圖1所示。核黃素主要由黃素單核苷酸(FMN)和黃素鳥嘌呤二核苷酸(FAD)兩種重要成分組成,參與機體復雜氧化反應。如表1所示,核黃素具有利尿、降血脂和改善心臟功能的作用,是生物體生命活動中必不可少的維生素[5],其生理功能主要包括:核黃素作為線粒體能量代謝的參與者,不僅可以改善其能量代謝,還可以作為自由基清除劑,清除脂質過氧化產生的自由基對線粒體功能的損害,從而對線粒體起到保護作用;在機體中具有遞氫的作用且具有極強的氧化能力[6],在鐵-硫簇(Fe-S)物質存在時可生成超氧負離子自由基,在光敏化后可進一步轉化為羥基自由基[7-10],對于氧活性物質的產生具有重要的作用等。因其具有廣泛的生理功能,現已被世界衛生組織作為評估人體身體與營養代謝狀況的指標之一[11]。

圖1 核黃素的化學結構Fig.1 Chemical structure of riboflavin

核黃素主要存在于蔬菜和動物的食物中,是多種氧化還原酶的輔酶,具有抗炎、抑癌和抗氧化等作用,熱穩定性強,對光極其敏感[15]。核黃素在強堿或可見光、紫外線下時不穩定,光照及紫外照射會引起核黃素不可逆的分解[16]。在337 nm激光作用下,核黃素僅產生三重激發態;而在248 nm激光作用下,可產生三重態激發和氧化型自由基,導致細胞衰老甚至死亡,因此核黃素是一種有效的光敏劑[17]。已有研究發現,核黃素經酯化作用可產生2′,3′,4′,5′-四乙酸核黃素,其具有延長壽命、保持良好的光敏特性的特點[18]。此外,研究表明核黃素可以結合微生物中的核酸,阻礙核酸的復制從而發揮光敏作用[19]。

2 核黃素介導的光動力技術

2.1 光動力技術的概述

光動力技術(PNST)指光源與光敏劑相互作用產生活性氧物質(ROS),殺死有害物質的新型冷殺菌方法。通過氧、光敏劑和可見光幾個基本要素之間的相互作用生成ROS,利用氧化作用破壞生物靶分子的結構,當破壞程度超過一定閾值,生物靶分子則會發生氧化損傷,導致細胞死亡[20]。近年來,光動力技術作為一種非手術代替療法在治療惡性腫瘤中已得到廣泛應用[21],成為治療癌前病變或皮膚腫瘤的常規方法;光動力技術有效地滅活單增李斯特菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等致病菌,保障了食品安全。

按光敏劑本身性質可分為:內源性光敏劑(5-擬氨基酮戊酸等)和外源性光敏劑(即第二代光敏劑)。按光敏劑的一般分類方法可分為:第一代光敏劑(血卟啉衍生物的混合劑)、第二代光敏劑(卟啉類衍生物)和第三代光敏劑(卟啉類衍生物與生物學特性的物質結合)。其中,第三代光敏劑處于研制階段,其改善了常規光敏劑的缺陷、提高靶向性,具有特異性識別功能[22],如酞菁類物質及Npe6等,具有良好的發展前景[23]。

2.2 核黃素介導光動力技術的作用機理

核黃素作為一類具有營養價值的光敏劑[24],其介導的光動力作用機理,如圖2所示:在光照條件下,基態(S0)核黃素吸收光能量生成壽命極短的單線態激發態(S1)后躍遷至三重激發態(T1)。在水環境中,通過光照的核黃素可產生大量的活性氧,如:1O2、O2·-和·OH。此時,大量的活性氧與三重激發態核黃素(T1)發生氧化作用,導致有害物質的結構及功能發生改變,從而破壞有害物質的正常生理活性,導致其死亡。在反應停止后,核黃素可從三重激發態(T1)直接恢復至穩定的激態,而不會降解[25-27]。

圖2 核黃素介導的光動力作用機理Fig.2 Mechanism of photodynamictechnology mediated by riboflavin

2.3 核黃素光敏劑介導的光動力技術的應用

2.3.1 在腫瘤治療中的應用 腫瘤癌癥的治療主要包括射線放療、全身熱療、基因療法。Long等[28]通過培養有無缺失核黃素的HEK293T和NIH3T3細胞,并觀察細胞的增殖狀態,研究發現缺乏核黃素致使NIH3T3和HEK293T細胞的腫瘤發生率增強2倍。此外,與正常HEK293T細胞相比,小鼠的致瘤性增強。Tutino等[29]采用聚合酶鏈反應(PCR)和Western blotting方法檢測人體結腸癌細胞和大腸癌患者組織中的基因及蛋白表達水平,結果表明核黃素促進了直腸癌細胞(CRC)的表達,減少了RFVTs 轉運蛋白的表達,以上發現為核黃素介導光動力技術治療腫瘤奠定基礎。

皮膚癌是一種惡性腫瘤,通常發生于皮膚的暴露部位,如手臂、面部、頭部等,對患者的生活造成了較大的困擾,其發病機制包括皮膚免疫系統的損傷、關鍵酶的誘導、細胞周期的延長等[30]。20世紀主要以維A酸、異維A酸或紫外線對皮膚病進行治療,其療效相對穩定,但其必須作用于早期階段的病患,不能根治皮膚病[31]。21世紀,核黃素作為光敏劑的光動力療法掀起了熱潮,其結合了早期治療皮膚病的方法,能夠從根本上解決皮膚病帶來的問題,效果顯著[32]。Miller等[33]將近紅外熒光分子探針與熒光分子成像結合對皮膚鱗狀細胞癌(SCC)進行實驗,結果表明,內源性熒光核黃素作為一種熒光探針對皮膚鱗狀細胞癌進行監測的同時,還有效降低了癌細胞活力。Salman等[34]采用順鉑、核黃素與光照聯合的方法治療小鼠皮膚瘤,研究發現,光照下核黃素的抗增殖作用顯著增強,可誘導皮膚癌細胞凋亡,有效降低了正常細胞的壞死,且治療的效果較好。由此表明,核黃素作為一種光敏劑對于皮膚癌的治療具有重要的意義。

2.3.2 在眼部疾病中的應用 眼睛是人類重要的器官,但眼病的快速發展已嚴重困擾人類的正常生活。世界衛生組織曾統計:至2020年,全球因眼病造成的失明人數將多達7600萬人[35]。目前,治療眼病的方法主要有:激素療法、放射療法或手術療法,但其對于機體本身造成了潛在的損傷[36]。目前,Foschini等基于核黃素介導的光動力技術原理發明了一種治療圓錐角膜的核黃素離子導入裝置,將裝置安放于待治療的眼睛上,施加0.5～5 min的陰極電流,在紫外光下輻照5～30 min,從而獲得核黃素的角膜交聯,此方法為眼病的治療提供新的有效手段[37]。此外,Lombardo等[38]發明了一種基于核黃素與紫外線的光動力技術角膜治療的無創光學方法,研究發現,基質內核黃素濃度及其紫外線照射角膜中的核黃素消耗量與治療所致基質硬化效應呈極顯著正相關。Hagem等[39]利用甲基纖維素與核黃素常規照射和紫外線照射(UVA)下眼角膜膠原交聯(CXL),研究發現,兩年后患者眼睛的視力得到改善,且使用核黃素與甲基纖維素可減少照射時間,加速CXL的治療。

2.3.3 在病蟲害領域的應用 核黃素介導的光動力技術在植物水平上已被用于研究棉蚜的致死情況。經研究發現,光照可促使棉蚜產生核黃素,內源性核黃素與光的相互作用產生的活性氧可引起細胞DNA氧化損傷,但外源核黃素對DNA具有一定的保護作用[40]。因此,過量表達的核黃素會累積DNA損傷,進一步引起細胞內促紅細胞生成素的積累,導致棉蚜死亡。此外,研究表明,植物不僅可以通過自身的生長代謝產生核黃素,還能經體外注射核黃素來防止植物病蟲害、促進植物生長[41],如鄧晟[42]在ParA1蛋白對煙草抗病性的研究中發現,只有在光源照射下的ParA1蛋白對細胞的誘導作用受到核黃素的抑制,而且這種抑制完全阻斷了過敏反應的進行,其可能通過活性氧產生的羥自由基的負調控過程,核黃素的含量在抑制過敏反應過程中發生了明顯的變化。同時,丁錦平等[43]在研究抑制棉花枯萎病菌生長時發現,當核黃素的濃度大于0.5 mg/mL,能顯著的抑制不同階段棉花枯萎菌絲的生長,以期為植物病蟲害的防治提供一定的參考價值。

2.3.4 在其他生物體中的應用 在波長為320～400 nm的廣譜近紫外線照射下,核黃素有效降低高等真核生物菌株(如真菌、動物細胞等)的存活率,并且隨著濃度的提高,其存活率相應下降[44]。在類似的光譜儀中,核黃素處理的小鼠胚胎纖維細胞的DNA損傷比空白組更嚴重;同時,與空白組對照,熒光燈照射對小鼠糖尿病的胚胎纖維細胞DNA損傷更嚴重[45]。王志勇等[46]在探討核黃素介導的光動力技術對病毒的滅活過程中也發現了類似現象,在紫外燈照射下,300 μmol/L核黃素作用10 min就可將水泡性口腔炎病毒殺死。因此,核黃素作為光敏劑在對病毒殺傷的同時,對動物細胞可能也會產生一定的損傷。此外核黃素對于某些酶類物質的生理功能也存在一定的影響[47],張兆霞等[48]利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳研究核黃素對溶菌酶的影響,發現在可見光波段下的核黃素對溶菌酶造成不可修復性損傷,經對SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的產物進行分析,結果表明:可見光的光照時間、核黃素的濃度等條件因素與溶菌酶的損傷呈現正相關關系,其作用機制符合光敏損傷機制。

2.3.5 核黃素降解產物介導的光動力技術的應用 核黃素的降解產物比核黃素本身穩定,且核黃素的降解產物2′,3′,4′,5′-四乙酸核黃素(2′,3′,4′,5′-tetraacetylriboflavin(RTA))介導的光動力技術在降解有毒有害物質中也發揮了極大的作用。羅沙砷是一種典型的有機砷飼料添加劑,用于治療腸道寄生蟲,可提高飼料的品質,但羅沙砷的自然界降解率低,降解產物具有毒性。因此,Meng等[49]以RTA為光敏劑,進行光催化降解硝羥苯胂酸,經90 min光照后,硝羥苯胂酸降解為As(III),進而氧化為As(V),達到降解的目的。但迄今為止,RTA作為光敏劑介導的光動力技術的研究報道還較少,其有效性和安全性仍需進一步探究。

2.4 核黃素對食品品質的影響

核黃素作為維生素的重要組成部分,其存在于動物內臟、奶類、蛋類、豆制品、蔬菜中。迄今為止,核黃素的多數研究還停滯于其營養價值的利用、維持其營養素不遭受破壞等[50-51]。Boyaci等[52]通過擠壓技術研究玉米營養素的破壞程度,結果表明核黃素的損耗量與溫度、含水量有關;因此,降低溫度或適量注射二氧化碳有利于保持微量營養素的結構,獲得品質較優良的玉米。此外,Jung等[53]采用分光光度計法研究核黃素介導的光動力技術檢測飲料中抗壞血酸含量,結果表明在核黃素和光照下,抗壞血酸的氧化速度極快,相較于高效液相色譜法,核黃素介導的光動力技術具有更高的準確度。到目前為止,核黃素作為光敏劑的光動力在食品安全領域的應用報道較少見。因此,基于核黃素的功能與研究背景,有望通過核黃素介導的光動力技術應用于食品安全領域,進而加強食品的安全性。

3 核黃素介導的光動力技術對人體健康及食品的影響

3.1 對人體健康的影響

葉酸是一種有效的核黃素光敏劑,抗氧化劑和α-葉酸含量控制著人體的衰老狀態[54]。據統計,人體每日所需的維生素B2較穩定(1～2 mg),人體在正常狀態下的核黃素含量就會引起光敏反應(8 mmol/kg),且葉酸對光照尤為敏感[55]。已有研究表明皮膚暴露在陽光下,可促使體內核黃素發生化學反應,形成不同程度的激發態,通過電子轉移與嘌呤堿基作用(鳥嘌呤和腺嘌呤的反應),導致人體部分細胞的DNA損傷,增加皮膚癌的發病率[56]。研究發現,通過內濾作用的類胡蘿卜素可預防核黃素的光敏反應對人體造成的損傷[57]。因此,當高強度的陽光照射時,可通過攝入適量的類胡蘿卜素來預防葉酸的光氧化從而降低人體的損傷,預防衰老。

在高度工業化發展的今天,眼病如:白內障、老年性黃斑變性(AMD)等是老年人群中日益增長的疾病。其病理與光化學反應歷程存在直接關聯[58]。過去研究認為,黃色素具有改善視力和防止紫外線激發的功能[59]。Tomany等[60]通過光動力技術,研究牛眼球晶狀體的蛋白病變中發現:核黃素與晶體蛋白的結合參與了光敏反應過程。在晶狀體中,色氨酸的氧化產物作為紫外線濾光器,對牛眼球具有保護作用。核黃素在治療眼病時可激活蛋白質的氧化活性,因此在光動力技術治療基礎眼角膜交聯手術中發揮主要作用[61]。從流行病學的角度來看,拖延治療眼病會導致老年人視力極速下降,甚至具有失明的可能性。研究表明,吸煙會增加體液中核黃素的濃度,是AMD發展的主要原因[62];類胡蘿卜素的攝入會大幅度的降低患AMD的風險;某些類黃酮似乎也具有保護視網膜色素上皮細胞免受氧化應激誘導的能力[63];大量攝入魚類也可以預防AMD的發生,其根本原因是一種長鏈U-3脂肪酸的有效調控[64]。因此,建議老年人群通過適當增加魚類和海產品以及富含類胡蘿卜素和類黃酮的水果和蔬菜的攝入來降低患AMD的風險。

3.2 對食品穩定性的影響

核黃素大量存在于肉類制品、乳制品和啤酒中,且對其品質都具有實際生物意義。Frederiksen等[64]對光照下的肉制品進行探究,發現在高氧包裝冷藏期間,高密度氧的環境可保持牛肉和豬肉的新鮮程度,以減少微生物的生長,用來維持肌紅蛋白鮮艷的紅色。但隨著貯藏時間的延長,肉質很快出現松軟現象,研究表明這種現象與核黃素的作用息息相關,高氧條件(80%)有利于核黃素發生光氧化,從而引起肉制品發生松軟現在,導致肉制品品質下降。Sattar等[65]對自然光照射下的乳制品進行感官評價,發現經自然光照射后,乳制品產生類似“紙板”或者“燒焦的羽毛”的味道;經過分析,乳制品內部發生了化學反應,促使牛奶的感官品質發生變化,這歸因于牛奶中的天然物質核黃素所致[66]。光照射下的啤酒也曾出現過類似變味的現象[41]。啤酒因含有核黃素,而具有強的光敏特性,光照后會產生一種類似于肛門腺排出的氣味,稱為“臭鼬”。研究表明,啤酒花中的苦味也是由核黃素所致[67]。

4 結論與展望

核黃素來源廣泛、價格低廉。近年來,核黃素作為藥物在醫學上的應用實例日益增多,諸多研究已證實核黃素作為光敏劑在腫瘤、癌細胞、病蟲害等領域的應用情況,為今后核黃素的大量開發和應用于食品冷殺菌領域提供了良好的研究基礎。然而,大量研究顯示,核黃素的光敏感性對人體健康和食品穩定性具有潛在的影響,大量的攝取或者攝取不足均會導致一些疾病的出現以及對食品品質的影響。因此,本文綜述了核黃素介導的光動力技術的研究進展,表明其具有良好的研究基礎和在食品冷殺菌技術領域的應用前景。此外,考慮到其可能存在的對人體健康的影響,在光動力技術的應用中,合理控制核黃素的使用量和光照強度是該技術需重點關注方向。