協同發酵在植物乳桿菌發酵乳中的應用研究進展

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(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(揚州)食品生物技術研究所,江蘇揚州 225004;3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

植物乳桿菌被廣泛應用于發酵食品中,如干酪、發酵蔬菜、發酵肉類等[1],主要作用是為了提高產品風味以及延長保存時間[2]。近年來,該菌被發現具有眾多益生作用,具有緩解肥胖癥[3]、糖尿病[4]等慢性疾病的作用,因此廣受關注。發酵乳是乳酸菌在食品中一個重要應用領域,除了能解決乳糖不耐癥人群不能食用牛乳的問題,同時還是益生菌的良好載體[5]。但由于植物乳桿菌在牛乳中生長不佳,該菌在發酵乳中應用不多。本文綜述植物乳桿菌生理特性尤其在牛乳中的生長不佳問題,及相關解決辦法等方面的研究進展。旨在對植物乳桿菌在牛乳中生長不佳現象有系統的認識,并為植物乳桿菌應用提供參考。

1 發酵乳的生理功能及研究趨勢

雖然牛乳中含有豐富營養物質,但患有乳糖不耐癥的人群因缺乏乳糖酶,食用牛乳后會產生胃腸脹氣、胃腸痙攣、腹瀉等癥狀[6],而發酵乳是乳糖不耐癥人群的良好選擇,在發酵過程中,乳酸菌可以將乳糖轉化成乳酸,從而降低乳糖不耐癥的影響[7]。

發酵乳制品有很多種類,如酸乳(yoghurt)、發酵奶油(cultured cream)、發酵黃油(cultured butter)、酪乳(buttermilk)、干酪(cheese)、開菲爾(kefir)[8]。發酵乳中含有豐富營養物質,包括豐富蛋白質,礦物質鈣(126～200 mg/100 g)、磷(138～170 mg/100 g),以及B族維生素(維生素B6、B12)和維生素D[9-10]。

發酵乳是益生菌的良好載體[5]。Linares等用StreptococcusthermophilusAPC151 生產含有γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的發酵乳,其具有緩解壓力、抗焦慮作用[11]。Lee等成功將兩株具有抗過敏功能的植物乳桿菌(L.plantarumSY11、SY12)應用于酸乳發酵[12]。

食品工業中生產酸乳的主要菌種是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌,雖然嗜熱鏈球菌有減輕幼兒腹瀉癥狀[13]、抗感染[14]、抗氧化[15]的功能,但Fang等發現嗜熱鏈球菌在pH2.0、2.5的模擬胃酸中培養1 h后無活菌存活[16],Campo通過分析定期飲用酸乳的114名健康年輕志愿者的糞便,表明由嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌發酵的酸乳不能為人體腸道提供有效數量的活菌,從而難以起到促進健康的作用[17]。為了使發酵乳具有更好的健康功能,近年對發酵乳的研究集中在功能性發酵乳。Elfahri等發現Lactobacillushelveticus1315發酵乳對結腸癌HT-29細胞有明顯抑制作用(50.98%),且具有抗氧化作用[18];Chen等發現L.helveticusH9生產的發酵乳有很強的ACE(angiotensin-converting enzyme)抑制活性,能抗高血壓[19];Chaves-López等用PichiakudriavzeviiKL84A、L.plantarumLAT3、EnterococcusfaecalisKL06協同發酵生產發酵乳,其ACE抑制活性強(IC50=30.63±1.11 mg/mL),且產品無苦味[20]。

2 植物乳桿菌生存特性及功能特性

2.1 來源及生存特性

植物乳桿菌是一類革蘭氏陽性、兼性厭氧的乳酸菌,可在植物、土壤、人類或動物的排泄物以及發酵食品(發酵蔬菜、發酵肉制品、發酵魚制品、干酪)等中發現,且該菌是人體腸道的原籍菌[21]。L.plantarumWCFS1是第一株被測定全基因序列的植物乳桿菌[22],其基因序列表明此菌中有眾多糖代謝相關的酶,能有效利用多種碳源并對不同環境有很強的適應性[23]。植物乳桿菌的基因組在乳酸菌中是最大的(約3.3 Mb)[24],其中很多的基因與不同種類糖的調節、代謝、運輸有關,Evanovich等表明該菌主要基因組中有1425個基因編碼有關代謝的蛋白質,輔助基因組中有平均1320個基因編碼有關細菌素生成、鹵素分解、砷毒性降解、乳酸鏈球菌素抗性的蛋白質[25]。

植物乳桿菌具有獨特的生理功能,Bergillos-Meca等發現L.plantarumC4作為輔助發酵劑生產發酵山羊乳,可提升多種礦物質(Ca、Mg)的生物活性(溶解性、滲透性、吸收性)[26]。Aguilar-Toalá等發現從植物乳桿菌發酵的發酵乳中提取的肽碎片具有抗感染、抗溶血、抗氧化的功能,其中小于3 kDa的肽碎片具有更高活性[27]。Wang等研究了L.plantarumYW32 產生的多糖(exopolysaccharide,EPS),其由甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖組成,具有清除羥基和超氧自由基、抑制致病菌生物膜形成、抑制結腸癌細胞的作用[28]。

植物乳桿菌在干酪成熟過程中起到重要作用,能提高干酪中的游離氨基酸(free amino acid,FAA)含量,其是風味物質的重要前體[29],從而增強干酪的風味[30]。在亞洲國家中,該菌廣泛應用于發酵蔬菜,包括腌黃瓜、腌蘿卜、發酵橄欖、韓國泡菜、越南泡菜等[31]。該菌還可以在肉類(發酵牛肉香腸[32]、意大利香腸[33])、魚類的發酵中應用[34-35]。

2.2 功能特性

傳統上植物乳桿菌在食品中的應用是為了提高產品的風味,但近年來發現其具有眾多益生特性,如Choi等人發現L.plantarumEM的細胞在存活、死亡狀態都能吸附膽固醇,從而降低膽固醇水平[36]。Zago等研究發現植物乳桿菌能產生葉酸、核黃素,且在發酵乳中具有較好的抗氧化能力[37]。在治療糖尿病方面,該菌被發現有獨特作用,Bejar等發現L.plantarumTN627能保護胰臟組織,降低胰臟、血漿中α-淀粉酶活力,降低血糖,并緩解一系列糖尿病并發癥[38];Abbasi等發現患有腎病的2型糖尿病病人飲用含有植物乳桿菌的豆乳后,各項腎功能指標明顯提高[4]。該菌對于肥胖癥也有重要作用,Xie等發現含有L.plantarumP1201的發酵豆乳能降低體重、減少體重的增加、肝和腸系膜的白色脂肪組織,改善高脂飲食引發的肥胖癥[39];Park等發現L.plantarumQ180抑制胰脂肪酶,抑制前脂肪細胞3T3-L1的分化,從而抑制肥胖[40]。該菌吸附重金屬功能近年來受到關注,如L.plantarumCCFM8246吸附銅[41],L.plantarumCCFM639吸附鋁[42],L.plantarumCCFM8661吸附鉛[43]。因此該菌在食品、藥品中的應用的研究逐漸增多。

3 植物乳桿菌在發酵乳中的生長

雖然植物乳桿菌在多種食品中都有重要應用,但多個研究表明該菌在乳中很難生長,這使利用該菌生產發酵乳存在困難。而乳酸菌在乳中的生長情況與蛋白水解系統有很大關系。

3.1 乳酸菌蛋白水解系統

乳酸菌為了能在蛋白質豐富的環境中具備生長優勢,在進化過程中逐漸形成了蛋白水解系統。蛋白水解系統的激活和培養環境中肽含量密切相關。Hebert等[44]認為當乳酸菌在含肽豐富的培養基中生長時,乳酸菌的蛋白酶活力將會降低,L.helveticusCRL1177在MRS培養基中生長時,細胞蛋白酶活力比在牛乳中生長降低了100倍。雖然牛乳中蛋白質含量較高,但能夠被乳酸菌直接利用的游離氨基酸卻很少,最多不超過100 mg/L[45]。因此,乳酸菌在牛乳等游離氨基酸含量匱乏的培養基中生長時,其蛋白水解系統會被激活。

表1 不同乳酸菌中編碼CEP的基因Table 1 The genes that code CEP in different lactic acid bacteria

注：-表示該菌沒有編碼CEP的基因。

乳酸菌在乳中生長時,通過復雜的蛋白水解系統降解蛋白質,產生游離氨基酸,以滿足自身的生長需要。蛋白水解系統主要由三部分組成:細胞壁蛋白酶(cell-envelope proteinase,CEP)將蛋白質水解成寡肽;轉運系統將寡肽運送到細胞之內;然后細胞內的肽酶進一步將寡肽水解成短肽和游離氨基酸[46]。

乳酸菌的蛋白水解能力與CEP有重要關聯。不同乳酸菌中編碼CEP的基因數量、種類不同,如表1所示。雖然乳酸菌水解蛋白質是為了滿足生長需求,但水解蛋白過程中會產生益生物質,這已引起眾多研究的關注。瑞士乳桿菌發酵牛乳能產生抗高血壓作用的兩種多肽valyl-prolyl-proline(VPP)和isoleucyl-prolyl-proline(IPP)[47-48]。VPP和IPP能抑制血管緊張肽轉換酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性,從而起到降高血壓的作用[49-50]。因此具有高效蛋白水解系統的乳酸菌可應用于功能性食品。

3.2 植物乳桿菌蛋白水解系統

植物乳桿菌的蛋白水解系統不完備。Georgieva等研究從Bulgarian干酪中分離出的8株具有益生功能的植物乳桿菌,發現其有很高的氨基肽酶活性,但水解蛋白能力微弱[60]。Kleerebezem等研究發現植物乳桿菌中缺乏編碼CEP的基因,但存在肽轉運系統:寡肽運輸酶(oligopeptidespermease,Opp)和二三肽運輸體(di-and tripeptides transporter,DtpT),可以將胞外的肽轉運到胞內,而且胞內具有眾多肽酶,可進一步降解肽[23]。Liu等研究來源于發酵大豆的L.plantarum5-2的全基因組,發現有104個基因編碼轉運系統,其能轉運肽、氨基酸,有19個基因編碼不同特性的胞內肽酶,但并未發現編碼CEP的基因[61]。

雖然大部分植物乳桿菌缺乏CEP,但最近研究發現少數具備CEP。Li等[62]的研究發現來源于健康嬰兒糞便的L.plantarumZJ316中存在prtM編碼CEP,Strahinic等發現來源于干酪的L.plantarumBGSJ3-18中存在類似prtP的基因編碼CEP[63]。

3.3 植物乳桿菌利用多肽能力與生長情況

植物乳桿菌在乳中生長不佳,Georgieva等將8株植物乳桿菌在分別接種于脫脂乳,16 h后均不增殖[64]。Ma等的研究中,接種該菌的樣品發酵72 h的pH僅達到5.81,且未出現凝乳現象[65],表明牛乳中游離氨基酸的量不能滿足植物乳桿菌的生長需求。

雖在乳中生長不佳,但植物乳桿菌作為輔助發酵劑在干酪生產中占據重要地位。在干酪成熟過程中,該菌利用乳酸菌發酵劑(starter lactic acid bacteria,SLAB)產生的多肽進行次級水解,釋放出更多小分子肽[66]。Poveda等[67]研究表明,向發酵劑中額外添加植物乳桿菌,能提高Manchego干酪中游離氨基酸含量,這表明,該菌能夠水解進入細胞中的肽類物質,生成游離氨基酸。

植物乳桿菌被歸類于非發酵劑乳酸菌(non-starter lactic acid bacteria,NSLAB)[68],干酪生產過程中,非發酵劑乳酸菌的生長受到發酵劑乳酸菌的促進,如乳酸乳球菌的蛋白酶陰性變種(proteinase negative,Prt-)的生長受到乳酸乳球菌蛋白酶陽性變種(proteinase positive,Prt+)的促進,如圖1所示[69],Prt+變種提供肽和氨基酸,促進Prt-變種的增殖,但隨著Prt-變種的大量繁殖,會爭奪營養物質,從而抑制Prt+變種的生長。這表明干酪的發酵分為兩個階段:第一階段,發酵劑乳酸菌產酸、水解蛋白質;第二階段,非發酵劑乳酸菌利用產生的短肽和游離氨基酸進行生長。Aydemir等的研究也表明在干酪生產過程中,起初植物乳桿菌等非發酵劑乳酸菌數量很少,但在成熟后期能夠在干酪中成為主導菌群[70]。

圖1 乳酸乳球菌Prt+變種和乳酸乳球菌Prt-變種在干酪中的相互作用。Fig.1 The interaction between protease-positive(prt+)variants and protease-negative(prt-)variants of Lactococcuslactisin cheese注:(a)表示牛乳發酵時期,Prt+變種提供肽和氨基酸促進Prt-變種生長;(b)表示Prt-變種大量繁殖后,通過競爭營養對Prt+變種的抑制。灰色箭頭代表促進生長以及提供,黑色箭頭代表抑制生長。

這些現象表明,植物乳桿菌蛋白水解系統不完備,水解蛋白能力微弱,但可以利用環境中的多肽。可以考慮采用協同培養的方法,用蛋白水解能力強的乳酸菌將牛乳中蛋白質進行初步降解,產生多肽,植物乳桿菌可將這些多肽轉運進細胞,用胞內肽酶進一步降解,從而滿足自身生長的氨基酸需求。

4 植物乳桿菌在牛乳生長不佳的解決策略

4.1 添加蛋白水解酶

表2 協同發酵對部分乳酸菌生長情況的影響Table 2 The effect of co-culture on the growth of some lactic acid bacteria

由于絕大部分植物乳桿菌中缺乏編碼細胞壁蛋白酶的基因,所以無法水解和進一步利用乳蛋白。因此可以嘗試向牛乳中添加蛋白酶,促進乳蛋白的水解,從而促進植物乳桿菌對乳蛋白的利用和生長。Cagno等研究表明,多種發酵劑乳酸菌的細胞壁蛋白酶都能促進L.plantarumDPC2741在脫脂乳中的生長,而且促進程度表現為:Lactococcuslactissubsp.cremorisST2>L.helveticusPR4>S.thermophilesST8[71]。

4.2 添加氨基酸及其他營養物質

乳中營養物質(游離氨基酸)不能滿足植物乳桿菌的生長,因此可以考慮額外添加。Ma等的研究已表明6種氨基酸和1種核苷酸前體是植物乳桿菌生長的必需物質,直接向牛乳中添加這些營養物質,促進該菌的生長[65]。Yang等的研究表明,黑莓汁在全部生長時間(24、48、72 h)都能明顯促進植物乳桿菌在脫脂乳中的生長,促進增長量為2.74～4.20 log CFU/mL[72]。Robitaille等發現向牛乳中添加用胃蛋白酶處理的酪蛋白巨肽(caseinomacropeptide,CMP)可促進L.plantarum299 V生長[73]。但植物乳桿菌的不同株對于營養物質需求存在差異,且添加這些物質可能會影響產品最終品質,因此仍需進一步研究。

4.3 協同發酵

微生物群體之間的關系分為多種,競爭關系(competition)、互利共生(mutualism)、偏利共生(commensalism)、偏害共生(amensalism)、寄生(parasitism)等。協同發酵是利用微生物之間的關系以達到更好的發酵效果。在乳品工業中常用的關系有互利共生、偏利共生,如生產發酵乳最常用發酵菌種嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌之間是互利共生的關系,在發酵過程中利用彼此產物促進各自的生長[74]。干酪生產中,SLAB和NSLAB之間是偏利共生的關系,這種關系中一方受到另一方的促進,而另一方不受影響,SLAB初步水解蛋白質產生的多肽、游離氨基酸滿足了NSLAB的氮源需求,促進其生長,而SLAB不受影響[75]。復合的微生物發酵劑有多方面的優勢,一是發酵效果更好,這是由于微生物之間可以相互利用代謝物或交換信號分子,從而實現相互交流,產生更好的發酵效果;二是復合微生物群體能夠對外界環境具有更強的耐受力[76-77]。利用協同發酵促進乳酸菌的研究可見表2。

為解決植物乳桿菌在乳中的生長問題,可借鑒干酪生產過程中的偏利共生關系的協同發酵。在這種關系中,具有較強蛋白酶活力的乳酸菌水解乳中的蛋白質,生成多肽和游離氨基酸,為植物乳桿菌生長提供氮源,促進其生長,而植物乳桿菌對蛋白酶活力強的乳酸菌生長無影響[75]。

5 可與植物乳桿菌協同發酵的乳酸菌

5.1 瑞士乳桿菌

瑞士乳桿菌被廣泛應用于干酪、發酵乳等食品的生產。該菌能緩解干酪的苦味,這是因為該菌能分解其它微生物產生的苦味肽,并產生獨特的風味物質,因此在干酪生產中具有重要的作用[86]。瑞士乳桿菌被認為具有益生功能,研究表明,L.helveticusH9發酵牛乳對小鼠有抗高血壓作用[19],L.helveticusNS8能夠緩解壓力過大引起的系列病癥[87]。

瑞士乳桿菌本身是多種氨基酸的營養缺陷型,而且在眾多乳酸菌中是營養缺陷程度最高的一種,但該菌能在氨基酸稀少的牛乳中良好生長,這都歸功于其強大的蛋白質水解能力。大部分的乳酸菌只有一種細胞壁蛋白酶(CEP),瑞士乳桿菌通常有至少兩種細胞壁蛋白酶,另外,編碼細胞壁蛋白酶的基因PrtM在該菌中也存在兩種,而大部分乳酸菌中只有一種。由于數量眾多的基因編碼了其蛋白水解系統,才使該菌具有高效的蛋白水解能力[86]。

瑞士乳桿菌較強的蛋白水解能力對其他乳酸菌有顯著的影響。Bergamini等研究表明L.helveticus138在干酪中初步水解產物可被L.plantarumI91有效利用,并促進其生長,而且發現L.plantarumI91對蛋白質的初級水解無影響,主要作用于次級水解(FAA的釋放)[88]。

5.2 干酪乳桿菌

干酪乳桿菌存在于牛奶、干酪及其它乳制品,也存在于人類口腔、腸道中,并且是人體腸道中的原籍菌[89]。眾多研究已表明該乳桿菌中存在細胞壁蛋白酶及完善的蛋白水解系統[54]。Lisa等研究表明,L.caseiPRA205發酵牛乳過程中,水解蛋白產生了ACE抑制肽VPP和IPP[90]。Kato-Kataoka研究表明定期飲用含有干酪乳桿菌的發酵乳能明顯減輕由壓力導致的腸道功能紊亂現象、緩解壓力感,而且維護了腸道菌群的多樣性[91]。該菌還有抑制腸道有害菌、調節免疫系統的作用[92]。丘裕等研究植物乳桿菌和干酪乳桿菌在火龍果汁中發酵,發現干酪乳桿菌對植物乳桿菌生長有促進作用,但其本身生長未受到影響[93]。

5.3 嗜熱鏈球菌

嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的組合在發酵乳的生產中占據重要的地位,常常被用作主要的發酵劑。該菌可從乳制品、植物中收集得到[94]。嗜熱鏈球菌適合在初始牛乳環境中生長,它能快速產酸,這是因為其具有兩方面的能力:不僅能夠水解牛乳蛋白為自身生長提供營養物質;而且能自身合成生長所需的氨基酸[95]。但這種合成氨基酸的能力并不是全能的,而是只能合成部分氨基酸[45],因此對于牛乳中蛋白質的水解也是其良好生長的必要能力。

部分嗜熱鏈球菌具有蛋白水解酶[96]。Fernandez-Espla 等發現嗜熱鏈球菌中存在蛋白水解酶PrtS、PrtS與其它乳酸菌中的蛋白酶如PrtP、PrtH、PrtB有很多相似之處,唯一的特異性是其蛋白酶中缺少B結構域[97]。當該菌單獨在牛乳中生長時,PrtS起到重要作用。

嗜熱鏈球菌與其他乳酸菌的協同發酵被廣泛研究,其中包括植物乳桿菌。Morenomontoro等研究了嗜熱鏈球菌和L.plantarumC4協同發酵山羊乳,發現嗜熱鏈球菌促進L.plantarumC4在山羊乳中的生長(6 h內增長量約為0.90 log CFU/mL),L.plantarumC4對嗜熱鏈球菌的生長無影響[98]。Turchi等用嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌協同發酵驢乳,發現植物乳桿菌能促進嗜熱鏈球菌的生長(增長量約為1 log CFU/mL),但嗜熱鏈球菌對植物乳桿菌的生長并無顯著影響,其推測是植物乳桿菌的次級產物促進嗜熱鏈球菌生長[85]。

5.4 保加利亞乳桿菌

嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的組合已經成為發酵乳生產中最主要的發酵劑,當它們在牛乳中發酵時,保加利亞乳桿菌水解酪蛋白產生的肽能被嗜熱鏈球菌利用并促進其生長[99]。這表明保加利亞乳桿菌有較強的蛋白水解能力。

保加利亞乳桿菌中已經發現蛋白水解酶PrtB[100],Courtin等研究表明,嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的組合在牛乳中生長時,蛋白酶PrtB的存在對于嗜熱鏈球菌的生長起到重要作用[101]。Mao等研究保加利亞乳桿菌水解酪蛋白情況,發現該菌CEP活性較高,水解酪蛋白并產生多種肽,但不同菌株之間存在較大差異[102]。該菌還能夠水解乳清蛋白中的β乳球蛋白,產生抗氧化和抗高血壓的活性肽[103]。

保加利亞乳桿菌與嗜熱乳桿菌良好的協同發酵效果為其與植物乳桿菌協同發酵提供了參考。Cemile等研究保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌協同發酵,促進植物乳桿菌生長(增長量為0.2 log CFU/mL),且協同發酵乳中FAA含量較植物乳桿菌單一發酵有顯著增長,表明植物乳桿菌利用了保加利亞乳桿菌產生的多肽,并產生FAA[104]。

5.5 乳酸乳球菌

乳酸乳球菌主要應用于發酵乳制品(酪乳、酸乳、酸奶油、干酪等),以及生產乳酸、B族維生素(B11、B12)、乳酸鏈球菌素(nisin)、以及多種酶制劑[105]。該菌有四個亞種:乳酸亞種(lactis)、乳脂亞種(cremoris)、霍氏亞種(hordniae)和 tructae亞種[106],最常見的是前兩個亞種。

眾多乳酸乳球菌中存在編碼CEP的基因(主要是prtP)[107],但部分菌種缺乏這類基因,這可能菌種的來源有關,非乳源的菌種常缺乏CEP[108]。同時該菌還存在兩種寡肽轉運系統(Opp,Opt)[109]和小肽轉運系統(DtpT),這保證其能進一步利用CEP產生的各種肽。

乳酸乳球菌與植物乳桿菌的協同發酵主要在干酪中應用。Ciocia等研究發現干酪中的植物乳桿菌可利用乳酸鏈球菌乳脂亞種、乳酸亞種水解蛋白產生的多肽和游離氨基酸,以滿足自身生長需求,且urea-PAGE實驗表明植物乳桿菌對于酪蛋白的降解無作用[110]。

6 展望

植物乳桿菌在牛乳中生長不佳的原因,一方面是牛乳中游離氨基酸含量低,不能滿足植物乳桿菌生長需要;另一方面是植物乳桿菌蛋白水解系統不完善,缺乏重要的細胞壁蛋白酶,無法像其它那些在牛乳中生長良好的乳酸菌一樣利用牛乳中的酪蛋白。

偏利共生關系的協同發酵是較好的解決辦法,此方法在干酪生產中早已有良好應用。此方法利用蛋白酶活力強的乳酸菌水解牛乳中蛋白質,釋放多肽,而植物乳桿菌利用這些多肽在胞內進行進一步水解生成氨基酸,滿足生長需求。在這種協同發酵中,蛋白酶活性力強的乳酸菌參與蛋白質的初級水解、次級水解,而植物乳桿菌僅參與蛋白質的次級水解。

使用植物乳桿菌和其他乳酸菌協同發酵乳制品時,應注意乳酸菌的同一種下的不同株之間存在較大差異。同時為了在發酵乳中有良好的應用,協同發酵之后的產品應具有好的感官評定結果。