NaH催化合成3,4-二氫-2H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮及其抗肝癌細胞活性評價

葛維娟，孟 歌，謝紫軒，陳 萍，白 宏

(1.西安培華學院醫學院，陜西 西安 710125；2.西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061;3.復旦大學化學系手性分子合成工程中心，上海 200433)

稠合氮雜環普遍存在于多種天然產物中，在制藥工業和材料科學中發揮著重要作用[1-2]。特別是稠合的喹唑啉-4-酮是制備大量具有顯著生物活性的生物堿類化合物的重要骨架[3-4]。大約有150種天然的生物堿類化合物中含有稠合的喹唑啉-4-酮結構片段，其中很多稠環結構具有抗腫瘤活性，如色胺酮(Tryptanthrine)[5]、達尼喹酮(Batracyclin)[6]、鴨嘴花堿酮(Vasicinone)[7]、駱駝寧堿A(Luotonin A)[8]、吳茱萸次堿(Ruteacarpine)和吳茱萸堿(Evodiamine)[9]等。這些化合物具有類似的三環稠和喹唑啉雜環體系，包括A、B和C環,它們共有的主要結構骨架就是2,3-稠合的(3H)-喹唑啉-4-酮，結構如圖1所示。

圖1 具有稠合(3H)-喹唑啉-4-酮結構片段的代表性生物活性化合物Figure1 Representative bioactive compounds bearing fused quinazolin-4(3H)-ones as a structural fragment

雖然2,3-稠合(3H)-喹唑啉-4-酮類化合物是許多天然產物結構改造的核心，但由于合成難度較大，對此類環體系的合成及活性研究較少。例如，法國科學家Thierry Besson課題組[10]曾試圖以2-氨基苯甲酸(1)為原料，通過特殊試劑Appel鹽(4,5-二氯-1,2,3-二硫代鎓鹽氯化物，2)合成所設計的目標化合物3,4-二氫-2H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮(10)，卻只得到了亞氨基取代產物(4)，沒能如期獲得目標化合物，合成路線如圖2所示。

圖2 Thierry Besson課題組假設的化合物(10)的合成路線Figure2 Hypothetic synthetic route of compound (10) by Thierry Besson’s research group

本文經過反復探究，設計了一種合成化合物(10)的新方法，合成路線如圖3所示。以鄰氨基苯甲酰胺(5)為原料，通過與草酸二乙酯經分子間環合得到中間體(6)[11]，中間體(6)經二溴乙烷烷基化反應得到中間體(8)[12]，中間體(8)經乙酯基的氨解反應得到中間體酰胺(9)[13]，中間體酰胺(9)經分子內環合得到目標產物(10)[14]。所有新化合物結構經1H NMR和MS(ESI)確證，并采用MTT法對目標物進行初步的抗肝癌細胞活性研究。

圖3 化合物(10)的合成路線Figure 3 Synthetic route of compound (10)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

德國布魯克公司AVANCF-300 MHz型核磁共振儀，DMSO-d6或CDCl3為溶劑，TMS為內標；GC/MS-QP2010氣-質聯用儀；XT-4型雙目顯微熔點儀；酶標儀；二氧化碳培養箱。

鄰氨基苯甲酰胺、草酸二乙酯、二溴乙烷、氨甲醇溶液(7 N)、氫化鈉、N，N-二甲基甲酰胺、石油醚、乙酸乙酯、碳酸鉀、濃鹽酸、四氫呋喃，所用試劑和溶劑均為分析純。

人肝癌細胞(SM-7721)，舒尼替尼陽性對照藥。

1.2 化合物的合成

1.2.1 (6)的合成

將草酸二乙酯50 mL(0.366 mol)分批加入融化的鄰氨基苯甲酰胺(5)6.8 g(0.05 mol)中，回流反應48 h(TLC跟蹤)。反應完全后，減壓蒸干過量的草酸二乙酯。所得白色固體用冷的乙醇洗滌，過濾后濾餅在冷乙醚中攪拌0.5 h，過濾得細小白色針狀晶體(6)8.6 g，收率78.9%，熔點(190～191) ℃ [文獻[11]為(190～192) ℃]。

1.2.2 (8)的合成

稱取(6)2.18 g(10.0 mmol)和碳酸鉀1.52 g(11.0 mmol)，溶解于干燥N，N-二甲基甲酰胺(50 mL)中，室溫攪拌下，滴加1,2-二溴乙烷2.06 g(11 mmol)，30 min滴加完畢，室溫反應4 h(TLC跟蹤)。過濾除去碳酸鉀，并向濾液中加水200 mL，用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋蒸得到淡黃色油狀物。經硅膠柱層析[洗脫劑：V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1)]純化得無色油狀物，加入少量的乙醇和適量的水，超聲條件下析出白色固體(8)2.50 g，收率76.9%，熔點(73～74) ℃。1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ(ppm):8.32(d,J=7.9Hz,1H),7.81(d,J=3.5Hz,2H),7.59(dd,J=7.7,4.3Hz,1H),4.64～4.45(m,4H),3.86(t,J=6.5Hz,2H),1.48(t,J=7.1Hz,3H)。MSm/zcalculated for C13H13BrN2O3[M+H]+325.16,found 326.1。

1.2.3 (9)的合成

稱取中間體(8)1.30 g(4.0 mmol)于一個50 mL的圓底燒瓶中，分批加入氨的甲醇溶液8.0 mL (7 N)，室溫攪拌過夜(TLC跟蹤)。待反應完全后，將反應液傾入冰水(40 mL)中攪拌10 min。用濃鹽酸調節pH值為5～6，得到大量白色沉淀，抽濾并用水洗滌濾餅，真空干燥得白色固體(9)1.04 g, 收率為88.14%，熔點(171～173) ℃。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ(ppm):8.32(d,J=8.0Hz,1H),7.81(t,J=7.6Hz,1H),7.72(d,J=8.1Hz,1H),7.59(t,J=7.5Hz,1H),7.52(s,1H),5.84(s,1H),4.97(t,J=6.5Hz,2H),3.90(t,J=6.5Hz,2H)。MS(EI)m/zcalculated for C11H10BrN3O2[M+H]+. 296.12, found 216.1(MS-Br)。

1.2.4 (10)的合成

稱取化合物(9)0.89 g(3.0 mmol)溶解于四氫呋喃(25 mL)中，在(-5～0) ℃緩慢加入0.24 g(6.0 mmol)的60%NaH，室溫條件下攪拌1 h(TLC跟蹤)。待反應完全后，將混合物減壓濃縮，加入冰水淬滅反應，過濾得到白色粗產物，用冷水、石油醚依次洗滌濾餅得到目標化合物(10)0.56 g，收率為86.8%,熔點>300 ℃。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ(ppm):8.91(s,1H),8.18(d,J=7.7Hz,1H),7.89(t,J=7.2Hz,1H),7.82(d,J=8.0Hz,1H),7.63(t,J=7.4Hz,1H),4.22(m,2H),3.55(t,2H)。MSm/zcalculated for C11H9N3O2[M+H]+215.21, found 215.1。

1.3 抗肝癌細胞活性測定

以舒尼替尼(sunitinib)為陽性對照藥，肝癌細胞系SMMC-7721作為受試細胞株，采用MTT比色法初步測試目標化合物(10)體外抗肝癌細胞活性[15]。

肝癌細胞系SMMC-7721以含10%胎牛血清的DMEM培養基(Corning cat no. 10017236R)，37 ℃、5%CO2培養箱培養至對數生長期，然后以0.02%EDTA-0.25%胰酶37 ℃消化2 min，1 000 rpm離心5 min收集細胞，制備1×105/mL細胞懸液，按100 μL/孔將細胞接種于96孔細胞培養板，37 ℃、5%CO2培養箱過夜培養細胞。將所測試的化合物(10)以二甲基亞砜配置為100 mmol·L-1貯存液，分別按(0～50) mmol·L-1系列濃度梯度進行加藥處理，并設對照組，均設3個復孔，總體積200 μL/孔，繼續37 ℃、5%CO2培養細胞24 h、48 h、72 h。每孔加入20 μL/孔MTT(5 mg·mL-1), 繼續培養(3～4) h，移除培養液，加150 μL/孔二甲基亞砜，室溫下振蕩15 min，用酶標儀(λ=490 nm)測定待測液的吸光度值，分別在24 h、48 h、72 h測定并記錄產物對SMMC-7721細胞抑制活性。將抑制率與對應的藥物濃度數據輸入GraphPad Prism7.00軟件中，擬合抑制率變化曲線并計算半數抑制濃度(IC50)值。

2 結果與討論

2.1 化合物的合成

目標化合物(10)三個環的構建經過四步完成。其中第一步按照文獻報道的方法比較容易獲得了中間體(6)，從而構建了A環和B環。該合成路線的新穎之處在于通過后續三個步驟構建C環。盡管每一步類似反應的具體方法和條件已在文獻中報道，但用于構建這種特殊骨架的整體合成路線尚未報道。這種新設計的合成路線是我們研究小組首次提出并成功驗證，并且已在其他相關稠環系統的合成中得到實踐。

在探索這種合成路線的過程中，也遇到許多困難。首先，為了獲得關鍵的中間體羧酰胺(9)，我們最初設計了另一種替代方法(見圖3)，即將中間體(6)先經過氨甲醇氨解得到羧酰胺中間體(7)，然后嘗試通過將(7)與1，2-二溴乙烷進行常規烷基化來獲得羧酰胺(9)，但無論用何種堿性催化劑(包括碳酸鉀和氫化鈉)，都無法得到所需烷基化產物。猜想羧酰胺(7)的惰性性質可能與喹唑啉上3-NH的正電子密度比羧酸酯(6)更高，因為隨后(6)通過烷基化試劑成功轉化為中間體(8)，然后(8)經氨解又成功得到了中間體(9)。

合成路線的最后一步對我們研究小組來說是一項艱巨的任務，就像Thierry Besson小組的相關類似研究工作一樣。為了獲得化合物(10)，最初嘗試在室溫下用碳酸鉀對羧酰胺(9)進行分子內環化，在連續反應15 h的TLC分析中未檢測到任何新產物，在油浴上升高反應溫度也不能改善反應過程。經過反復試驗，考慮到催化堿的堿性可能太弱，于是選擇了堿性更強的氫化鈉作為催化劑，室溫條件下反應1 h，成功獲得目標化合物(10)，總收率46.5%。受此結果鼓舞，設想在相同的NaH條件下，是否可以通過(7)和二溴乙烷之間的一步分子間縮合直接獲得化合物(10)，但實驗結果表明，這種方法無法獲得目標產物(圖3)。

2.2 抗肝癌細胞活性

將化合物(10)通過配制成0 mmol·L-1、0.781 3 mmol·L-1、1.562 5 mmol·L-1、3.125 mmol·L-1、6.25 mmol·L-1、12.5 mmol·L-1、25 mmol·L-1、50 mmol·L-1共8個濃度，分別處理細胞株24 h、48 h、72 h,以舒尼替尼(sunitinib)為陽性對照藥，同法處理。采用MTT比色法測定其抗增殖作用，結果如圖4所示。 由圖4可以看出，肝癌細胞經8個不同濃度的化合物(10)作用24 h 后，細胞生長均受到抑制，但只有在濃度為50 mmol·L-1時，其對肝癌細胞抑制率優于陽性對照組，有極顯著差異(P<0.001)。化合物(10)與肝癌細胞作用48 h后,濃度分別為25 mmol·L-1、50 mmol·L-1時，其對肝癌細胞抑制率高于陽性對照組，有極顯著差異(P<0.001)。化合物(10)與肝癌細胞作用72 h后,在濃度為0.781 3 mmol·L-1時，其對肝癌細胞抑制率高于陽性對照組，有顯著差異(P<0.01)；在濃度為1.562 5 mmol·L-1時，其對肝癌細胞抑制率高于陽性對照組，存在極顯著差異(P<0.001)；在濃度為3.125 0 mmol·L-1時，其對肝癌細胞抑制率高于陽性對照組，有顯著差異(P<0.05)；而在其余的濃度條件下，與對陽性對照組相比,發現抑制率沒有明顯變化。

圖4 化合物(10)與舒尼替尼對SMMC-7721細胞系的生物抑制活性對比圖Figure 4 Biological inhibitory activity comparision of compound 10 with sunitinib against SMMC-7721 cell line

在GraphPad Prism7.00軟件中，擬合抑制率變化曲線并計算了化合物(10)、舒尼替尼對SMMC-7721細胞系分別在24 h、48 h和72 h的半數抑制濃度(IC50)值，結果如表1所示。由表1可以看出，化合物(10)在24 h、48 h和72 h的IC50值均小于陽性對照組，初步表明化合物(10)是一種很有前途的新型抗肝癌藥物先導化合物。

表1 化合物(10)、舒尼替尼對SMMC-7721細胞系分別在24 h、48 h和72 h的IC50值(mmol·L-1)

3 結 論

(1)以天然產物所共有的三環稠合喹唑啉結構模板，開發了一種有效的構建2,3-稠合的(3H)-喹唑啉-4-酮骨架的方法，經過分子間環合、烷基化、氨解、分子內環合四步化學反應合成出一個結構新穎的3,4-二氫-2H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮化合物(10)，并采用MTT法初步評價其體外抗肝癌活性。

(2)化合物(10)對肝癌細胞系SMMC-7721具有明顯的抑制活性，優于陽性對照藥舒尼替尼，為進一步發現新型抗腫瘤藥物提供先導結構，也為該類衍生物的大量合成和結構改造提供參考方法。