杏鮑菇菌糠制備氨基酸水溶肥

陸歡，徐寧*，王小艷，王春暉，彭運祥，夏姣

1. 湖南省食用菌研究所（長沙 410013）；2. 漣源市食品藥品監督管理局（婁底 417199）

食用菌采收后剩余的廢棄培養料稱為菌糠，與原始培養料相比，其粗纖維含量大幅度降低，粗蛋白含量顯著提高，且富含多種微量元素。近年來，我國食用菌產業發展迅速，2017年全國食用菌總產量為3 712萬 t，杏鮑菇159.71萬 t，菌糠年生產量在2×108t以上。這些菌糠除少部分被循環利用為食用菌培養料外，往往被丟棄或燃燒，不但造成資源浪費，同時還導致霉菌和害蟲的滋生，污染環境。目前，食用菌菌糠的資源化利用已受到廣泛關注，已報道的利用途徑不下10種[1-13]，但大多數研究還不夠深入，未在生產實踐中得到廣泛推廣。

水溶肥料是指能夠完全溶于水的多元素復合型、速效性肥料，可以完全溶解于水中，能被作物的根系和葉面直接吸收利用，可水肥同施，以水帶肥。近年來，水溶肥料產業發展迅速，與傳統的復合肥等相比，有效吸收率高，肥效快，可解決高產作物快速生長期的營養需求。近年來，氨基酸作為小分子有機物質，不僅能促進植物生長發育、增強抗逆性、改善土壤狀況、提高作物產量和改善品質，還能減輕植物重金屬離子毒害、鈍化病原菌毒素等[14-16]，具有很好的經濟和生態效應。

腐熟后的菌糠采用酶法結合微波提取法制備氨基酸水溶肥，是在利用菌糠生產肥料的基礎上，通過酶解過程釋放出更多的游離氨基酸和營養物質。氨基酸水溶肥是一種高效安全肥料，菌糠為氨基酸的生產來源提供了很好的資源，而不再局限于皮革、毛發這類原料。因此，氨基酸肥料的研究和應用，是目前肥料發展的重要方向，此次研究為菌糠制備氨基酸水溶肥開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇菌糠（產地湖南），曬干粉碎后，腐熟發酵備用。

風味酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

D 101大孔樹脂（天津）；電子天平；旋轉蒸發儀；H 1850 R離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；HWS-26恒溫水浴鍋（蘇州江東州精密儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 游離氨基酸提取方法

稱取50 g腐熟菌糠，按照料液比1︰20（g/mL）加入蒸餾水，充分浸泡3 h，分離出浸液，取濾渣按照料液比1︰20（g/mL）加入蒸餾水，充分浸泡3 h。2次浸泡處理水的溫度均保持為70 ℃，每間隔10 min進行攪拌，并在攪拌后進行微波處理3 min。冷卻后加酶控溫40 ℃反應5 h，然后升溫至90 ℃滅酶活20 min。以12 000 r/min離心5 min，過濾，收集濾液，過大孔樹脂除去色素，濾液按濃縮比1︰10（g/mL）通過回旋蒸發儀濃縮濾液。冷卻后加入無水乙醇進行醇沉，過夜，離心后取上清液，用茚三酮比色法測游離氨基酸。

1.3.2 酶種類及復合比例篩選

酶種類篩選：選擇風味酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶進行單酶和復合酶的配比，酶添加總量為0.5%，以可溶性固形物和游離氨基酸為指標，選擇提取效果最好的單酶或復合酶進行復合酶比例的篩選。

1.3.3 酶反應條件優化

確定復合酶用量后，對反應時間和溫度進行優化。以游離氨基酸為指標篩選最佳反應條件，試驗安排見表1。

表1 酶反應條件

1.3.4 減壓蒸餾工藝優化

濾液濃縮選擇蒸餾時間、蒸餾溫度為自變量，以固形物為參考指標，平行取樣重復3次，取平均值。以濾液為原料，蒸餾溫度120 ℃，選擇在蒸餾時間10，20，30，40，50和60 min下進行蒸餾；蒸餾時間30 min，選擇在蒸餾溫度100，110，120，130和140℃下進行蒸餾。

根據蒸餾時間、蒸餾溫度單因素試驗結果設計均勻試驗，以固形物為參考指標，觀察各組合濃縮效果，因素水平表見表2。

表2 均勻試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 酶種類對氨基酸含量的影響

采用風味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶分別對腐熟菌糠進行氨基酸提取，結果見表3。在單酶作用下，添加風味酶進行提取，可溶性固形物含量最高，添加木瓜蛋白酶提取，游離氨基酸含量最高。將3種酶中的任意2種分別按1︰1比例復合后進行提取試驗，結果顯示，風味酶與木瓜蛋白酶復合有利于提高氨基酸含量，木瓜蛋白酶和纖維素酶復合有利于提高可溶性固形物。將3種酶按1︰1︰1比例復合進行提取，結果不僅有利于提高氨基酸含量，還有利于增加可溶性固形物。將風味酶和木瓜蛋白酶以1︰1（1指添加量為0.25%）的比例作為一個整體，在與纖維素酶進行不同比例復合，結果見表3。結果表明，3種酶其余比例相較于比例為1︰1︰1，添加量為0.5%時的氨基酸增加量并不明顯，但酶添加量增多，成本加大。因此，生產時選擇復合酶添加比例為1︰1︰1，總添加量為0.5%更為合適。

表3 不同酶對游離氨基酸提取效果的影響

2.2 酶反應條件優化結果

對表1中4種反應條件下得到的提取液中游離氨基酸進行分析，結果見表4。提取條件1，即提加酶后40℃反應2 h，再提高至50 ℃反應2 h，氨基酸含量較高；取條件2，即加酶后50 ℃反應4 h，上清液中游離氨基酸含量最高，可見50 ℃酶反應有利于氨基酸釋放；提取條件4，即不加酶50 ℃提取4 h，氨基酸含量最低。因此，加酶50 ℃反應4 h有利于氨基酸的提取。

2.3 減壓蒸餾工藝優化

2.3.1 蒸餾時間對游離氨基酸含量的影響

蒸餾時間對提取液濃縮后游離氨基酸含量的影響比較明顯。由表5可知，在10～30 min范圍內，隨著時間的增加，游離氨基酸釋放量增大。在30 min以后，隨著時間繼續延長，蒸餾時間對氨基酸釋放量影響不顯著，氨基酸含量沒有顯著差異，原因可能是后期因水分已被大量蒸發，多糖等含量增加導致稠度加大，不利于氨基酸釋放，因此蒸餾時間宜設定為20～40 min。

表5 蒸餾時間對游離氨基酸含量的影響

2.3.2 蒸餾溫度對游離氨基酸含量的影響

蒸餾溫度對提取液濃縮后游離氨基酸含量影響比較復雜，不同溫度對游離氨基酸釋放量有完全不同的影響。由表6可知，在10～120 ℃范圍內，隨著溫度的升高，游離氨基酸含量增大。在120 ℃以后，隨著溫度升高，游離氨基酸含量增加不顯著。原因可能是溫度增加破壞了濃縮液中所含物質的結構活性，影響氨基酸釋放量。

表6 蒸餾溫度對游離氨基酸含量的影響

2.3.3 減壓蒸餾均勻試驗結果

根據單因素的試驗結果，以蒸餾溫度、蒸餾時間2個因素，選取因素水平進行均勻試驗，結果見表7。組號5的氨基酸含量最高，通過3組平行試驗驗證，氨基酸含量分別為13.57，13.62和13.70 g/L。由驗證試驗結果可知：適宜水平組合為A2B2，即最適條件選取為蒸餾時間30 min、蒸餾溫度120 ℃。

表7 均勻試驗方案與結果

3 結論與討論

菌糠制作有機肥的研究較少，且對氨基酸水溶肥的制備研究少有報道，而菌糠富含豐富的營養成分，值得綜合開發利用。試驗對復合酶+微波法提取腐熟菌糠中的游離氨基酸進行了研究。結果表明0.5%復合酶（風味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶以1︰1︰1的比例復合）提取后效果最好，提取得到的游離氨基酸含量達到14.89 g/L。酶反應條件優化研究結果表明，加酶后先50 ℃反應4 h效果最佳，分析原因可能是酶提一段時間后，游離氨基酸溶出速率穩定，繼續升溫酶反應對于其游離氨基酸含量增加影響不大。結合酶種類（風味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶以1︰1︰1的比例復合），得到的游離氨基酸含量為13.02 g/L。減壓蒸餾通過單因素試驗的結果得出，蒸餾時間的范圍宜設定為20～40 min，蒸餾溫度的范圍宜設定為100～120℃。由均勻試驗結果分析可得到最優組合，再通過驗證試驗綜合分析可知，適宜水平組合為A2B2，即蒸餾時間30 min，蒸餾溫度120 ℃，得到的游離氨基酸含量為13.64 g/L。試驗為菌糠制備水溶肥提供了參考，具有一定的指導意義。