酪蛋白-葡萄糖共聚物的制備

董建瓊，高昕悅，張春蘭, *

1. 塔里木大學生命科學學院（阿拉爾 843300）；2. 南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室（阿拉爾 843300）

乳中含量較高的蛋白質是酪蛋白，它是一種含有磷和鈣的結合蛋白質。在牛奶中主要以磷酸二鈣、磷酸三鈣或兩者的復合物形式存在，結構比較復雜[1]。目前利用蛋白質作為天然的乳化劑和功能因子載體的研究報道較為常見。但是目前酪蛋白的一些功能特性還是存在一定的不足，極大地影響在一些領域的應用，例如酪蛋白在較低的pH下，溶解性和乳化性都較差，限制了其使用范圍。因此，為了改善酪蛋白的功能特性，擴大其使用途徑、范圍，需要對酪蛋白進行改性研究。

蛋白質和糖類作為食品中不可缺少的一部分，在食品體系中往往共存，在加熱條件下兩者會自發地進行美拉德反應，不需要使用任何化學物質作為催化劑。反應后蛋白質的水溶性、乳化性等都有較顯著的提高[2-3]，是目前蛋白質改性眾多方法中較為理想的方法。蛋白質接枝改性能提高蛋白質的功能特性[4-7]，并具有安全性，在食品行業中得到廣泛的應用。試驗以濕法接枝反應制備酪蛋白-葡萄糖的接枝物，通過在不同的條件（pH、溫度、時間、底物濃度）對該接枝反應進行分析，以期為酪蛋白-葡萄糖的實際制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉、葡萄糖、β-巰基乙醇、鄰苯二甲醛等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；酪蛋白，阿拉丁試劑有限公司。

UM-4T磁力攪拌器，北京優晟聯合科技有限公司；LE 2002E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-2F精密pH計/酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；UM-4T數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，金壇區科順儀器廠；GZX-9240 MBE電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司；TGL-16C高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 酪蛋白-葡萄糖共聚物的制備

取1 g酪蛋白，加入5 mL的0.1 mol/L NaOH溶液使酪蛋白溶解，用pH 7的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液定容至100 mL，加入轉子，在磁力攪拌器上以1 000 r/min的轉速持續攪拌3 h，放入冰箱靜置過夜，待用。

酪蛋白-葡萄糖共聚物制備方法：將一定量的酪蛋白溶液與一定量的葡萄糖溶于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，在磁力攪拌器上攪拌使其充分混勻，用1 mol/L的HCl或NaOH調節pH至適宜的酸堿度。取2 mL處理好的溶液于離心管中，密封后在一定溫度下反應一段時間后，立即用冰水浴冷卻至室溫，以7 000 r/min離心10 min，取上清液測定游離氨基含量。分別考察反應時間（40，50，60，70和80 min）、反應溫度（60，70，80，90和100 ℃）、pH（6，7，8，9和10）以及酪蛋白、葡萄糖這兩種底物的質量配比（0.5︰10，1︰10，1.5︰10，2︰10和2.5︰10 g/g）對酪蛋白-葡萄糖共聚物接枝度的影響。

1.2.2 游離氨基的測定及接枝度的計算

采用OPA法進行游離氨基的測定[8]。OPA試劑的配制：稱取40 mg的鄰苯二甲醛于1 mL甲醇中攪拌溶解，加入2.5 mL 20%的SDS、25 mL 0.1 mol/L的硼砂和100 μL的β-巰基乙醇，用蒸餾水定容至50 mL。取4 mL的OPA試劑于試管中，加入200 μ L的樣品溶液，混合均勻后在35 ℃下水浴2 min，在340 nm下測定吸光度A1，以在OPA試劑中注入200 μL蒸餾水為空白樣。接枝度（DG）按式（1）計算。

式中：A0為未反應時游離氨基的吸光度；A1為反應一定時間后的游離氨基吸光度。

2 結果與分析

2.1 不同反應時間對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

在反應初始pH為8、溫度為90 ℃條件的情況下，DG隨反應時間變化的關系如圖1所示。隨著加熱時間的延長，酪蛋白-葡萄糖接枝度呈先升后降趨勢。酪蛋白的ε-氨基酸與葡萄糖分子的還原性醛基接觸后才會發生反應，隨著加熱時間的延長，蛋白質結構逐漸展開，將ε-氨基酸暴露在外，接枝度逐漸提高。在70 min時接枝度達到17.07%。當加熱時間達到80 min時，接枝度稍有下降，這可能是過度加熱會使蛋白質分子的一些賴氨酸結構被破壞，并使蛋白質結構伸展而增加蛋白質之間的相互作用而導致絮凝和沉淀，不利于接枝反應進行。

圖1 不同反應時間對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

2.2 不同反應溫度對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

在反應初始pH為8、反應時間為70 min條件的情況下，DG隨反應溫度變化的關系如圖2所示。隨著溫度的提高，接枝度在不斷提高，當溫度為90 ℃時，DG達到12.73%；當溫度大于90 ℃時，接枝度降低。這可能是反應溫度過高使蛋白質分子的賴氨酸部分破壞或蛋白質的絮凝沉淀，阻礙了接枝反應的進行。

圖2 不同溫度對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

2.3 不同pH對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

將酪蛋白與葡萄糖以質量比1︰10（g/g）混合后，調節pH至6，7，8，9和10，在水浴溫度90 ℃下加熱70 min，測定接枝度。由圖3可知，當pH小于8時，接枝度隨pH的增大而增大；當pH為8時，接枝度達18.61%；而pH大于8時，接枝度隨pH增加而減小。導致這一結果的原因可能是在pH小于8時，美拉德反應由于反應環境偏酸而被抑制；在pH大于8時堿性逐漸增強，從而導致酪蛋白的一級結構發生變化如脫氨、脫羧和肽鍵斷裂，引起“胱賴反應”，將氨基酸轉變成有毒的化合物[9-10]，因此不利于接枝反應的進行。

圖3 不同pH對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

2.4 不同酪蛋白-葡萄糖配比對接枝度的影響

在反應初始pH為8、水浴溫度90 ℃下加熱70 min后，測定接枝度。如圖4所示，隨著酪蛋白-葡萄糖配比的增加，接枝度呈先上升后下降的趨勢。當底物配比為1︰10（g/g）時，接枝度最大，為24.82%；當底物配比大于1︰10（g/g）時，接枝反應受到抑制，說明適當的底物配比有利于酪蛋白的接枝反應。若添加比例過高，羰基供體不足以與氨基供體結合，接枝反應程度不足；若添加比例過低，葡萄糖會使溶液的空間位阻增大，分子之間的碰撞概率會減少而阻礙反應的進行。

圖4 不同酪蛋白-葡萄糖配比對接枝度的影響

2.5 酪蛋白-葡萄糖濕法接枝反應工藝優化

從表1可以看出，影響酪蛋白-葡萄糖接枝反應的因素依次為：pH＞底物配比＞時間＞溫度。酪蛋白-葡萄糖接枝反應的最佳條件是A3B3C2D1，即反應時間為80 min，反應溫度為100 ℃，pH為8，底物配比為1︰10（g/g），此條件下接枝度為23.31%。

表1 酪蛋白-葡萄糖濕法接枝反應正交試驗結果

3 結論

試驗研究了不同反應時間、溫度、pH以及酪蛋白-葡萄糖配比對酪蛋白-葡萄糖共聚物接枝度的影響。結果表明：影響酪蛋白-葡萄糖濕法接枝反應的因素依次為pH＞底物配比＞時間＞溫度，濕法接枝反應時間為80 min，反應溫度為100 ℃，pH為8，酪蛋白與葡萄糖比例為1︰10（g/g），此條件下接枝度可達23.31%。