響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉香豆素提取工藝

陳艷熙，賈春梅*

宜賓學(xué)院（宜賓 644000）

竹葉（Bamboo leaves）為禾本科植物淡竹的葉，中國(guó)具有豐富的竹葉資源，且香豆素是竹葉的主要功能活性物質(zhì)之一，具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值[1]，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于竹葉香豆素的研究非常少。提取香豆素主要方法有傳統(tǒng)溶劑法[2-4]、超聲波提取[5]、微波輔助提取[6]、超臨界流體萃取法[7-8]等。

此次試驗(yàn)以毛竹葉為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平的中心組合試驗(yàn)，用軟件Design-Expert 8.0.1擬合響應(yīng)值與影響因素的關(guān)系得到模型方程，分析模型方程得出提取竹葉香豆的素最佳工藝，將最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證。優(yōu)化竹葉香豆素的提取工藝可促進(jìn)竹葉資源開(kāi)發(fā)利用，為大規(guī)模提取竹葉香豆素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮毛竹葉（宜賓學(xué)院）；傘形花內(nèi)酯（分析標(biāo)準(zhǔn)品，99%）；蘆丁（分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%）；無(wú)水乙醇（分析純）；石油醚（分析純）。

TU-1901紫外分光光度計(jì)；800Y高速多功能粉碎機(jī)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌機(jī)；R-100VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；722可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 香豆素定量分析方法

1.2.1 制備傘形花內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確稱(chēng)取10 mg傘形花內(nèi)酯，用40%乙醇定容于25 mL容量瓶。從中取5 mL加入一個(gè)50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液（40 μg/mL）。

1.2.2 確定測(cè)定波長(zhǎng)與參比波長(zhǎng)

準(zhǔn)備3只10 mL容量瓶，分別加入1.0，2.0和3.0 mL傘形花內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，用40%乙醇定容。在190～900 nm范圍內(nèi)對(duì)溶液進(jìn)行紫外可見(jiàn)光掃描，由圖譜可知傘形花內(nèi)酯的特征吸收波長(zhǎng)326 nm，所以選擇326 nm為香豆素類(lèi)化合物的測(cè)定波長(zhǎng)。

為消除提取液中黃酮類(lèi)物質(zhì)干擾，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度蘆丁溶液，對(duì)蘆丁溶液進(jìn)行紫外可見(jiàn)光掃描，在掃描曲線上找一個(gè)與326 nm處吸收相等的波長(zhǎng)383 nm，作為參比波長(zhǎng)[18]。

1.2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)備6只10 mL容量瓶，分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL傘形花內(nèi)酯（40 μ g/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液，用40%乙醇定容。在選定雙波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，將2個(gè)吸光度作差，將差值對(duì)傘形花內(nèi)酯濃度線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：Y=0.133 8 X+0.062 3，R2=0.999 1。

1.3 制備樣品溶液

采摘宜賓學(xué)院新鮮竹葉，用清水洗凈，干燥，將干燥后的竹葉進(jìn)行粉碎，過(guò)60目篩，以石油醚溶劑對(duì)竹葉進(jìn)行脫色處理，脫色后的竹葉自然揮干，水浴烘30 min。準(zhǔn)確稱(chēng)取8.0 g竹葉，提取溶劑用70%乙醇，于60 ℃提取60 min，液料比30︰1（mL·g-1），提取2次，合并提取液并通過(guò)減壓旋蒸的方式將提取液中的乙醇旋出，制成浸膏，浸膏用40%乙醇定容至100 mL，得到樣品溶液。

1.4 計(jì)算樣品溶液中香豆素含量

取1 mL樣品溶液加入50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容，采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出樣品溶液中香豆素的含量。

1.5 日間精密度和日內(nèi)精密度

準(zhǔn)備3只50 mL容量瓶，分別加入1.0，1.5和2.0 mL樣品溶液，40%乙醇定容，采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)。測(cè)定日內(nèi)精密度需要在同1 d內(nèi)，每隔1.5 h測(cè)定1次數(shù)據(jù)，重復(fù)5次，測(cè)得1.0，1.5和2 mL樣品溶液中香豆素的RSD值分別為1.34%，0.874%和0.51%，表明日內(nèi)精密度良好。測(cè)定日間精密度需要連續(xù)在5 d的同一時(shí)間測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，測(cè)得1.0，1.5和2 mL樣品溶液中香豆素的RSD值分別為4.42%，2.46%和0.817%，表明日間精密度良好。

1.6 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)備3只50 mL容量瓶，分別加入1.0，1.2和1.4 mL樣品溶液，1，3和5 mL傘形花內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，用40%乙醇定容，采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示，標(biāo)樣的回收率分別為103.68%，99.86%和96.68%，回收率在95%～105%之間，回收率的RSD值小于5%，說(shuō)明檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)此試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果影響較小，該分析方法可行。

1.7 單因素試驗(yàn)

考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)竹葉香豆素得率的影響。

1.8 響應(yīng)面優(yōu)化

綜合單因素的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平的中心組合試驗(yàn)，用軟件Design-Expert 8.0.1擬合響應(yīng)值與影響因素的關(guān)系得到模型方程，分析模型方程得出提取竹葉香豆素最佳工藝，將最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 總香豆素得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化

由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，香豆素在溶液中的溶解度較小，所以提取出的香豆素量很少。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，總香豆素得率達(dá)到最大值（1.362 mg/g）。隨乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高，竹葉中有更多的物質(zhì)被提取出來(lái)，對(duì)測(cè)量結(jié)果會(huì)造成干擾。

圖1 總香豆素得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化

2.1.2 總香豆素得率隨液料比的變化

由圖2可知，當(dāng)液料比較小時(shí)，溶液黏度過(guò)大，不利于物料運(yùn)動(dòng)，使得香豆素溶出率低。當(dāng)液料比為25︰1（mL·g-1）時(shí)，總香豆素得率有最大值（1.379 mg/g）。液料比繼續(xù)增大，可能是由于溶液量過(guò)多，攪拌轉(zhuǎn)速不夠，造成物料在溶液中擴(kuò)散速度較慢，所以香豆素提取率低。

圖2 總香豆素得率隨液料比的變化

2.1.3 總香豆素得率隨提取時(shí)間的變化

由圖3可知，提取40 min時(shí)，總香豆素得率有最大值（1.343 mg/g）。隨提取時(shí)間增加，由于竹葉中香豆素含量少，香豆素全部被提取出來(lái)后，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，被提取出來(lái)的黃酮濃度增大，計(jì)算香豆素得率時(shí)需要減去的值越大，所以香豆素得率在曲線上呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

2.1.4 總香豆素得率隨提取溫度的變化

由圖4可知，在溫度較低時(shí)，分子熱運(yùn)動(dòng)較低，竹葉中香豆素溶出速率較慢。當(dāng)提取溫度升高到70 ℃時(shí)，總香豆素得率達(dá)到最大值（1.683 mg/g），溫度繼續(xù)升高會(huì)破壞香豆素分子的結(jié)構(gòu)，所以溶液中香豆素含量減少。

圖3 總香豆素得率隨提取時(shí)間的變化

圖4 總香豆素得率隨提取溫度的變化

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)（參見(jiàn)表1）

表1 試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 建立模型及模型分析

以香豆素得率為因變量，A、B、C、D為自變量進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表2。將4種影響因素和總香豆素得率進(jìn)行擬合并建模分析。回歸方程（編碼）為：Y=1.50-0.051A+0.021B+0.089C+9.000×10-3D-0.055AB-0.019AD+0.12BC-0.15CD-0.25A2。

由表3可知，模型的p值=0.000 5＜0.05，說(shuō)明模型有顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)p值=0.479 5＞0.05，沒(méi)有顯著性，說(shuō)明方程的擬合性好，可信度高。

由圖5可見(jiàn)，總香豆素得率隨提取時(shí)間增加而上升，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，呈先升后降趨勢(shì)；由圖6可見(jiàn)，等高線圖為橢圓形，說(shuō)明液料比與提取溫度交互影響非常顯著，提取條件變化對(duì)總香豆素得率影響較大。當(dāng)提取溫度為65 ℃、液料比為27.5︰1（mL·g-1）時(shí)，總香豆素得率到達(dá)最大值；由圖7可見(jiàn)，總香豆素得率隨液料比升高而升高；隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高則呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)；由圖8可見(jiàn)，提取時(shí)間和提取溫度間的交互對(duì)竹葉香豆素的提取率影響較大。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 模型方程方差分析

2.2.3 驗(yàn)證最優(yōu)工藝

對(duì)優(yōu)化工藝（乙醇43.75%、提取溫度80 ℃、液料比20︰1（mL·g-1）、提取時(shí)間50 min）進(jìn)行驗(yàn)證，平行3次，最終總香豆素的平均得率為1.785 mg/g，與預(yù)測(cè)值1.870 mg/g的相對(duì)誤差為4.5%。

圖5 提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總香豆素得率的影響

圖6 液料比和提取溫度對(duì)總香豆素得率的影響

圖7 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總香豆素得率的影響

圖8 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)總香豆素得率的影響

3 結(jié)論與討論

以毛竹葉為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用多元二次回歸方程擬合響應(yīng)值與影響因素之間的函數(shù)關(guān)系，得到模型方程：Y=1.50-0.051A+0.021B+0.089C+9.000×10-3D-0.055AB-0.019AD+0.12BC-0.15CD-0.25A2。通過(guò)建模分析，得出香豆素的最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)43.75%，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間50 min，液料比20︰1（mL·g-1）。驗(yàn)證試驗(yàn)的總香豆素得率為1.785 mg/g，與預(yù)測(cè)值1.870 mg/g的相對(duì)誤差為4.54%，說(shuō)明該模型擬合性較好，準(zhǔn)確性較高，響應(yīng)面法可用于優(yōu)化竹葉香豆素提取工藝，且該方法簡(jiǎn)單可行。與提取樣品溶液中香豆素含量0.868 mg/g比較，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行提取，香豆素得率明顯提高，為大規(guī)模提取竹葉香豆素奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)毛竹中香豆素得率為1.785 mg/g與謝捷等[2]研究的毛竹中香豆素含量6.19 mg/g相比，含量較低，可能是采摘竹葉季節(jié)和地域因素不同，造成這種差異。

試驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定吸光度，進(jìn)行香豆素定量，具有操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。但雙波長(zhǎng)法的特異性較差，試驗(yàn)樣品溶液為混合溶液，樣品溶液含有的其他物質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果造成干擾，所以在條件允許情況下，應(yīng)采用更精確的方法進(jìn)行試驗(yàn)，提高特異性。