花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取工藝

許靜，戴妙妙，魏蒙月，張赟彬, *，黃潤宇，王思佳

1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學香料香精技術(shù)與工程學院（上海 200234）；2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院（上海 201114）；3. 上海中僑職業(yè)技術(shù)學院食品學院（上海 201319）；4. 上海中醫(yī)藥大學公共健康學院（上海 201210）

阿爾茲海默病（AD）是一種由多因素共同導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1-2]。在眾多假說中以乙酰膽堿酶（AchE）水解神經(jīng)遞質(zhì)導致膽堿能活性下降的“膽堿能學說”和AchE誘導大腦細胞外Aβ沉積的“β-淀粉樣蛋白學說”得到廣泛支持[3-4]，這2種學說都表明AchE在AD的形成中起到至關(guān)重要的作用。在《阿爾茨海默病2018年報告》指出AD在老年人群體的發(fā)病率僅次于心血管、腫瘤等老年性疾病，到2050年，全球AD患者預計約1.5億人[5]。AD不僅嚴重影響老年人健康，還給患者家庭和社會帶來沉重負擔[6]。因此，AchE抑制劑的開發(fā)具有重大意義。

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim），茴香科花椒屬，是中國的傳統(tǒng)調(diào)味香辛料，在中國主要分布于長江流域及其南部地區(qū)[7]。近年來花椒的醫(yī)用價值受到廣泛關(guān)注，其中已被分離鑒定出富含有生物堿、香豆素、酰胺、黃酮和木質(zhì)素等活性成分[8-9]，藥理研究表明這些活性成分具有顯著的抗氧化[10]、抑菌[11]、抗癌[12]、抑制血小板凝集等[13]生物活性功效。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)四川花椒的95%乙醇提取物分離得到的異丁基羥酰胺可提高皮質(zhì)酮損傷PC12細胞存活率，對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用。張鋒等[15]對D-半乳糖致衰老模型小鼠用不同劑量的花椒多酚類化合物（ZPPC）總提取物進行灌胃處理，發(fā)現(xiàn)ZPPC處理組小鼠腦組織SOD活力值上升，明顯改善小鼠的學習記憶能力。此外，有報道指出從花椒屬植物分離的吖啶類生物堿在體外表現(xiàn)出一定細胞毒活性和抗瘧活性[16-17]。關(guān)于花椒活性物質(zhì)提取及其功效研究已有不少報道，但從花椒中提取抗AchE活性物質(zhì)的研究仍鮮見相關(guān)報道。因此，以花椒為原料，以改良的Ellman比色法為測定方法，在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗優(yōu)化花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取條件參數(shù)，為尋找新的AchE抑制劑來源和新型AD治療藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒粉（上海味好美食品有限公司）；AchE（5 00 U 2 mg）、碘代硫代乙酰膽堿（ATch）、二硫二硝基苯甲酸（DTNB）（美國Sigma公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇、甲醇、乙酸乙酯（均為分析純，上海泰坦科技股份有限公司）。

ME204E電子天平（托利多儀器上海有限公司）；DK-S24恒溫數(shù)顯水浴鍋（常州翔天試驗儀器廠）；EMS-20磁力攪拌油浴鍋（喬躍電子上海有限公司）；KQ-50DE超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BUCHI R-2真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi試驗室設(shè)備貿(mào)易上海有限公司）；酶標儀（島津中國有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取

準確稱取10 g花椒粉于錐形瓶中，加入一定體積分數(shù)提取溶劑，于37 ℃水浴浸提60 min，回流提取，提取物過濾后旋蒸、冷凍干燥，干燥后樣品用PBS緩沖液稀釋至1.0 mg/mL，用于AchE抑制活性測定。

1.2.2 AchE抑制活性的測定[18]

試驗在96孔酶標板上進行，設(shè)有空白組，空白對照組，測試組和測試對照組，每組做3個平行。試驗組在96孔板中依次加入100 μ L PBS緩沖溶液、100 μ L樣品提取液、10 μL 2.0 U/mL AchE，混合均勻后在37 ℃培養(yǎng)20 min，取出后依次加入20 μL 0.6 mmol/L DTNB、20 μ L 0.6 mmol/L ATch，于37 ℃反應(yīng)20 min后在412 nm下測定吸光度。試驗對照組用10 μ L的pH 8.0緩沖液代替10 μL的2.0 U/mL AchE溶液（扣除試驗樣品本身顏色影響）。空白組用100 μL的PBS緩沖溶液代替100 μ L樣品提取液。空白對照組用100 μ L磷酸緩沖液代替100 μ L樣品提取液、10 μ L緩沖液代替10 μ L的2.0 U/mL AchE溶液。

通過OD值評估對AchE的抑制活性，并根據(jù)式（1）計算抑制百分數(shù)。

抑制率=[（空白組-空白對照組）-（試驗組-試驗對照組）]/（空白組-空白對照組）×100% （1）

1.2.3 花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取單因素試驗

1.2.3.1 提取溶劑種類的選擇

在料液比1︰12（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間120 min條件下，選擇乙酸乙酯、甲醇、乙醇和蒸餾水，按1.2.1方法提取并測定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.2 乙醇體積分數(shù)的選擇

在料液比1︰12（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間120 min條件下，選擇50%，60%，70%，80%和90%不同乙醇體積分數(shù)，按1.2.1方法提取并測定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.3 提取時間的選擇

在乙醇體積分數(shù)80%、料液比1︰12（g/mL）、提取溫度70 ℃條件下，選擇提取時間60，90，120，150和180 min，按1.2.1方法提取并測定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.4 提取溫度的選擇

在乙醇體積分數(shù)80%、提取時間90 min、料液比1︰12（g/mL）條件下，選擇提取溫度50，60，70，80和90 ℃，按1.2.1方法提取并測定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.5 料液比的選擇

在乙醇體積分數(shù)80%、提取時間90 min、提取溫度條件80 ℃下，選擇料液比1︰9，1︰12，1︰15，1︰18和1︰21（g/mL），按1.2.1方法提取并測定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.4 花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取正交試驗

依據(jù)單因素試驗結(jié)果選取提取時間、乙醇體積分數(shù)、提取溫度和料液比為考察的4個因素，每個因素選取3水平，以AchE抑制率為指標，設(shè)計L9(34)正交試驗表進行正交試驗，優(yōu)化花椒中抗AchE活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取單因素試驗

2.1.1 溶劑種類對AchE抑制率的影響

由圖1可見，當提取溶劑為乙醇時，AchE抑制率最高，為33.64%，甲醇提取液抑制率最低，為14.72%。乙醇是一種半極性溶劑，既能溶解生物堿類、苷類等極性溶劑所溶解的極性化合物，也能溶解揮發(fā)油、內(nèi)脂等非極性溶劑所溶解的非極性化合物，且在中藥材活性物質(zhì)提取中乙醇是較理想的提取溶劑[19-20]。因此，在后續(xù)試驗中提取溶劑選擇不同提交分數(shù)乙醇溶液。

圖1 溶劑種類對AchE抑制率的影響

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對AchE抑制率的影響

由圖2可知，乙醇體積分數(shù)在50%～80%范圍內(nèi)，花椒提取液的AchE抑制率隨乙醇體積分數(shù)增加而增大，當乙醇體積分數(shù)為80%時，AchE抑制率達到最高值（41.60%）；當乙醇體積分數(shù)大于80%時，AchE抑制率有所降低。這可能是隨著乙醇體積分數(shù)增加，抗AchE有效活性化合物浸出量增大，抑制率升高；而提取的抗AchE活性成分大多為極性物質(zhì)[21-22]，乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增加，使溶液極性降低，極性成分浸出量減少，導致AchE抑制率降低。因此，花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取溶劑選取80%乙醇溶液。

圖2 乙醇體積分數(shù)對AchE抑制率的影響

2.1.3 提取時間對AchE抑制率的影響由圖3可知，隨著提取時間延長，花椒提取液AchE抑制率呈先升后降趨勢。提取時間在60～120 min范圍內(nèi)，AchE抑制率隨提取時間延長而升高，當提取時間為120 min時，AchE抑制率達到最大（54.88%），隨著時間繼續(xù)延長，AchE抑制率下降。這可能是隨時間延長，花椒中抗AchE活性物質(zhì)得以充分浸出，但提取時間過長導致浸出物質(zhì)分解失活，使有效活性成分損失。因此花椒中抗AchE活性物質(zhì)最佳提取時間選取120 min。

圖3 提取時間對AchE抑制率的影響

2.1.4 提取溫度對AchE抑制率的影響

由圖4可見，提取溫度在50～80 ℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度升高，AchE抑制率逐漸增大，當提取溫度為80 ℃時，花椒提取液AchE抑制效果最佳，抑制率達到最大值（52.54%）；當提取溫度大于80 ℃時，AchE抑制率下降。這可能是提取溫度升高使花椒細胞壁破損，溶劑擴散滲透到細胞內(nèi)的速率加快，有效活性成分充分析出，80 ℃時有效成分完全浸出達到濃度平衡，繼續(xù)提高溫度，浸出有效成分分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)因高溫而受到破壞，導致AchE抑制率降低[23-24]。因此，花椒中抗AchE活性物質(zhì)最佳提取溫度選取80 ℃。

圖4 提取溫度對AchE抑制率的影響

2.1.5 料液比對AchE抑制率的影響

由圖5可見，一定范圍內(nèi)料液比的增大有利于提高花椒提取液AchE抑制效果，花椒與80%乙醇溶液以1︰15（g/mL）料液比混合提取時，花椒提取液AchE抑制率最高，為58.22%。但隨溶劑體積增加，AchE抑制率稍有下降，可能是花椒中抗AchE活性物質(zhì)完全浸出，繼續(xù)增加溶劑使雜質(zhì)溶解量增加，影響花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取效果。因此，從節(jié)約成本和提取效率方面考慮，花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取最佳料液比選取1︰15（g/mL）。

圖5 料液比對AchE抑制率的影響

2.2 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以AchE抑制率為指標，確定花椒抗AchE活性物質(zhì)提取的因素水平表，結(jié)果見表1。

表1 正交試驗因素與水平

L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由表2中R值大小可知，影響花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取效果的主次順序為A＞B＞D＞C，即提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞提取溫度＞料液比，其中提取時間對花椒中抗AchE活性成分的提取效果影響最大，料液比對抗AchE活性成分的提取效果無明顯影響，因此花椒提取工藝的最佳組合為A2B2C1D3。由于化學穩(wěn)定性較差的浸出成分在過高的提取溫度下可能被降解失活，而且溫度越高，能源消耗和經(jīng)濟成本越大，綜合考慮成本和提取效率，最終確定最優(yōu)組合為A2B2C1D1，即乙醇體積分數(shù)80%，料液比1︰12（g/mL），提取溫度70 ℃、提取時間120 min。

表2 花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 工藝驗證

采用正交最優(yōu)試驗方案組合A2B2C1D1進行試驗，結(jié)果測定AchE抑制率為67.42%，高于正交試驗測定出的試驗結(jié)果，說明試驗采用的工藝條件合理，優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

正交試驗優(yōu)化確定花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取的最佳工藝為：提取溶劑80%乙醇溶液，提取溫度70℃、提取時間120 min、料液比1︰12（g/mL）。以最佳工藝組合提取的花椒提取液抑制率為67.42%。

采用乙醇回流提取法，通過正交試驗優(yōu)化花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取工藝條件，建立從花椒中抗AchE活性物質(zhì)的有效制備方法，為花椒中活性成分對阿爾茨海默病的治療研究和阿爾茨海默病新型藥物研發(fā)提供參考依據(jù)，為相關(guān)腦損傷發(fā)展和相關(guān)認知障礙提供研究方向。