響應(yīng)面法優(yōu)化低共熔溶液提取兒茶素工藝及組分分析

阮懌航，吳亮宇，魯靜，黃秀紅，劉麗辰，林金科, *

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院（福州 350002）；2. 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院（泉州 362000）

鐵觀音原產(chǎn)于福建安溪，屬于烏龍茶類(lèi)，既有綠茶的清香又有紅茶的醇厚，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。兒茶素作為鐵觀音烏龍茶中多酚類(lèi)的主要成分，包含兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒(méi)食子兒茶素（GC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（CGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）7種組成成分[1]。兒茶素具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、降脂等[2-5]多種保健功效。目前，兒茶素主要的提取方法有離子沉淀-大孔樹(shù)脂吸附分離法[6]、微波輔助浸提法[7]、超聲波輔助浸提法[8]、超臨界CO2萃取法等[9]。這些方法中，有的方法提取率較低，有的方法耗能大、成本高，無(wú)法投入大規(guī)模生產(chǎn)[10]。因此，探索一種綠色環(huán)保高效的兒茶素提取方法對(duì)茶產(chǎn)業(yè)具有深遠(yuǎn)的意義。

低共熔溶劑，又稱(chēng)低共熔離子液體，是指利用有機(jī)化合物和離子型化合物通過(guò)氫鍵結(jié)合形成的體系。這種溶劑無(wú)毒性，可生物降解，是一種新型的綠色溶劑[11]；其具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單，原料易得，相對(duì)較低的蒸汽壓，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，表面張力小，擴(kuò)散系數(shù)較大，室溫下為液體且電導(dǎo)率高等優(yōu)點(diǎn)[12]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，低共熔溶液在提取類(lèi)黃酮物質(zhì)[13]、橘皮多酚[14]、螺旋藻多糖[15]、黃酮物質(zhì)[16]等方面有著深入的研究，但在茶葉內(nèi)含活性成分的提取領(lǐng)域國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。故此次試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比不同體系的低共熔溶劑和傳統(tǒng)水提取方法的提取率，篩選適合的兒茶素提取體系，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法，優(yōu)化兒茶素提取條件，為提高兒茶素工業(yè)提取效率提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵觀音成品茶，惜緣茶葉有限公司；乳酸、檸檬酸、果糖，國(guó)藥集團(tuán)；蘋(píng)果酸、氯化膽堿、甜菜堿、沒(méi)食子酸，麥克林公司；以上藥品均為分析純。乙腈（色譜純），德國(guó)Merck公司；冰醋酸（AR）；抗壞血酸（AR）；甲醇（色譜純），美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

712N可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器廠）；5424R高速離心機(jī)（德國(guó)制造）；HH-6恒溫水浴鍋（國(guó)華電器公司）；SY-2230恒溫水域搖床（美國(guó)精騏公司）；超純水機(jī)（成都艾柯公司）；高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）。

1.3 樣品預(yù)處理

將鐵觀音成品茶葉粉碎后過(guò)60篩，密封備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同體系的低共熔溶液制備

采用水浴加熱攪拌的方法制備低共熔溶劑，將氯化膽堿/果糖、氯化膽堿/乳酸、甜菜堿/蘋(píng)果酸、甜菜堿/檸檬酸、甜菜堿/乳酸5種雙組分按摩爾比1︰2各放入燒杯中，在85 ℃水浴中攪拌為均一的液體，60～80 min。

1.4.2 兒茶素的提取工藝流程

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 0 g（±0.000 5 g）鐵觀音茶粉于50 mL離心管中，各加入30%含水率的5種自制低共熔溶液，混均放入恒溫水浴搖床中。提取條件為時(shí)間60 min、固液比1︰20 g/mL、溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min。提取后趁熱抽濾，濾液于4 ℃保藏待測(cè)。

1.4.3 HPLC分析

1.4.3.1 待測(cè)液制備

將25 mL EDTA（10 mg·mL-1）+0.2 g抗壞血酸+50 mL乙腈至500容量瓶，用水定容至刻度，制得穩(wěn)定溶液；兒茶素提取液用穩(wěn)定溶液稀釋10倍后過(guò)0.45 μm膜，制成待測(cè)液。

1.4.3.2 HPLC條件

采用Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，RP 181.7 μm），Acquity UPLC柱在線過(guò)濾器，以色譜圖中峰不出現(xiàn)拖尾、基線不漂移和分離度為依據(jù)對(duì)流動(dòng)相體系和梯度洗脫設(shè)計(jì)、分析參數(shù)進(jìn)行評(píng)定。流動(dòng)相條件：A相為9.5%乙腈+0.02%EDTA-2Na+2%冰醋酸，流動(dòng)相B為80%乙腈+0.02%EDTA-2Na+2%冰醋酸。柱溫箱溫度35 ℃。PDA檢測(cè)條件：掃描范圍200～400 nm，特征檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，掃描時(shí)間9 min，進(jìn)樣量2 μL。

1.4.4 兒茶素提取的單因素試驗(yàn)

低共熔溶液的制備和鐵觀音茶湯的提取參照1.4.1和1.4.2，考察不同因素對(duì)兒茶素提取的影響。設(shè)置的單因素分別是：時(shí)間（40，60，80，100和120 min）、溫度（40，50，60，70和80 ℃）、固液比（1︰20，1︰30，1︰40和1︰50 g/mL）、低共熔溶液含水率（10%，20%，30%，40%和50%）、低共熔溶劑中氫鍵受體（HBA）與供體（HBD）的摩爾比（1︰1，1︰2，1︰3，2︰1和3︰1）。

1.4.5 響應(yīng)面優(yōu)化茶多酚提取試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取連續(xù)變量時(shí)間（A，min）、溫度（B，℃）、低共熔溶液的含水率（C，%）為自變量，兒茶素的提取率（Y，%）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)各因素水平設(shè)定參見(jiàn)表1。

表1 Box-behnken試驗(yàn)因素水平及編碼水平表

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，采用Excel 2007，SPSS 17.0，Graphpad及Design-Expert 10.0.7進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 低共熔溶劑體系篩選試驗(yàn)

由圖1可知，低共熔溶劑的兒茶素提取率高于超純水；其中乳酸與甜菜堿組成的低共熔溶液體系兒茶素提取率最高，為14.56%，相比于傳統(tǒng)水提取的方法提高了148.70%。因此選擇乳酸和甜菜堿體系作為低共熔溶劑體系。

圖1 不同低共熔溶劑體系對(duì)兒茶素提取率的影響

2.2 兒茶素提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)兒茶素提取率的影響

由圖2可知，兒茶素的提取率在20～40 min時(shí)提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；在40 min之后提取率逐步下降；40 min時(shí)提取率達(dá)到最大，為11.53%。綜合考慮提取成本和效率，確認(rèn)最佳提取時(shí)間為40 min。

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)兒茶素提取率的影響

2.2.2 溫度對(duì)兒茶素提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，提取率隨著溫度的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大，為11.43%；進(jìn)一步增加溫度，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選擇溫度60 ℃為最佳提取條件。

2.2.3 低共熔溶劑組成摩爾比對(duì)兒茶素提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)氫鍵供體（HBD）和氫鍵受體（HBA）的摩爾比為2︰1時(shí)，提取率最佳，為12.26%；當(dāng)摩爾比為3︰1時(shí)，提取率最低，為10.82%。因此，選取低共熔溶劑組成摩爾比2︰1為最佳摩爾比條件。

2.2.4 低共熔溶液含水率對(duì)兒茶素提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)溶液的含水率為10%～30%時(shí)，兒茶素的提取率隨著含水率提高而逐漸增加；當(dāng)含水率為30%時(shí)，提取率達(dá)到最大，為13.31%，當(dāng)含水率大于30%時(shí)，提取率下降。因此，選擇30%含水率為兒茶素提取的最佳低共熔溶液條件。

圖3 不同提取溫度對(duì)兒茶素提取率的影響

圖4 不同低共熔組分摩爾比對(duì)兒茶素提取率的影響

圖5 不同低共熔溶液含水率對(duì)兒茶素提取率的影響

2.2.5 固液比對(duì)兒茶素提取率的影響由圖6可知，當(dāng)固液比為1︰10～1︰40 g/mL時(shí)，提取率隨著固液比的增加而增加；當(dāng)固液比為1︰40 g/mL時(shí)，提取率達(dá)到最大，為10.85%；當(dāng)固液比大于1︰40 g/mL時(shí)，提取率有所下降。綜上所述，選取1︰40 g/mL作為低共熔溶劑提取兒茶素的最優(yōu)固液比。

2.3 兒茶素提取工藝優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、低共熔溶液含水率（C）為自變量，以?xún)翰杷氐奶崛÷蔣為因變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design-Expert 10.0.7軟件中的Box-Behnken模型對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合分析，從而獲得兒茶素提取率（Y）對(duì)自變量提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、低共熔溶液含水率（C）的二次項(xiàng)多元統(tǒng)計(jì)分析，建立的二元回歸方程為：Y=14.99+0.066A+0.051B+0.067C-0.42AB-0.22AC-0.12BC-0.92A2-0.48B2-0.28C2。

由表3可知，模型p＜0.000 1，失擬項(xiàng)的p＞0.05，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有高度的吻合度；相關(guān)系數(shù)R2=0.984 5，說(shuō)明回歸方程能夠很好地模擬實(shí)際曲面；調(diào)整系數(shù)R2=0.964 6，說(shuō)明有96.46%的響應(yīng)值變化可以通過(guò)該模型來(lái)解釋?zhuān)砻鞔朔匠棠軌虺浞址从硟翰杷靥崛÷逝c各個(gè)提取工藝參數(shù)之間的關(guān)系。

模型的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖7。等高線的形狀能表示兩個(gè)因素之間的相互作用情況；若等高線呈現(xiàn)橢圓形，則兩個(gè)因素之間存在顯著的交互作用；若等高線呈現(xiàn)圓形，則無(wú)顯著性[17]。由圖7（f）可知，提取時(shí)間和提取溫度對(duì)兒茶素的提取率的交互作用沒(méi)有顯著性；由圖7（b）（d）可知，含水率和提取時(shí)間、含水率和提取溫度對(duì)兒茶素的提取率具有顯著的交互影響作用。由圖7（a）（c）（e）可知，當(dāng)提取溫度、提取時(shí)間、含水率增加時(shí)，響應(yīng)值呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。這與單因素試驗(yàn)的結(jié)果相吻合。

圖6 不同固液比對(duì)兒茶素提取率的影響

表2 響應(yīng)面方案及結(jié)果

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析

圖7 各因素影響兒茶素提取率的響應(yīng)面圖

2.3.2 兒茶素提取的最佳條件確定及驗(yàn)證

在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素范圍內(nèi)，按照回歸模型利用Design-Expert 10.0.7軟件分析得出的兒茶素提取最佳條件是：提取時(shí)間40.31 min，提取溫度60.33℃，低共熔溶液含水率31.68%，模型預(yù)測(cè)茶多酚提取率為15.00%。最后確定的兒茶素的提取條件為：提取時(shí)間40 min，提取溫度60 ℃，低共熔溶劑含水率32%。為證實(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果，采用最后確定的提取條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)際兒茶素提取率（15.22%），與模型預(yù)測(cè)相差0.22%，由此可見(jiàn)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法確定的兒茶素提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.4 兒茶素組分含量分析

通過(guò)HPLC對(duì)優(yōu)化后的提取液進(jìn)行組成成分分析，結(jié)果如圖8所示。含量最高的組分是EGCG，達(dá)到1.68 mg/mL；含量最低的是CG，僅有0.009 8 mg/mL。由圖8可知，兒茶素中的主要成分為EGCG和EGC，兩者合計(jì)占總量的69.20%；EC、C、GCG為次要成分，合計(jì)占兒茶素總量的29.57%。由此可見(jiàn)，發(fā)揮兒茶素主要保健功能的成分很可能是EGC、EGCG這兩種物質(zhì)。

圖8 兒茶素各組分及其含量

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)低共熔溶劑體系的篩選，得到最佳低共熔溶液體系，為乳酸-甜菜堿；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對(duì)此工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，得出的優(yōu)化提取工藝條件為：提取時(shí)間40 min，提取溫度60 ℃，低共熔溶劑含水率32%、固液比1∶40 g/mL、低共熔溶劑組分摩爾比2∶1。此時(shí)通過(guò)模型計(jì)算得出的提取率為15.00%，驗(yàn)證試驗(yàn)的提取率為15.22%，試驗(yàn)與模型得到的提取率高度吻合，表明模型準(zhǔn)確、可靠，具有實(shí)際參考意義。對(duì)兒茶素提取物進(jìn)行HPLC組分分析，結(jié)果顯示兒茶素中的主要成是EGCG和EGC，占總量的69.20%。由此可見(jiàn)采用低共熔溶液可以有效提高茶葉中兒茶素的提取效率；通過(guò)HPLC分析兒茶素主要成分可知，發(fā)揮兒茶素保健功效的主要成分可能是EGC、EGCG這兩種成分。因此可以在今后探索如何從低共熔溶液提取的兒茶素中分離出EGC、EGCG，從而發(fā)揮兒茶素類(lèi)物質(zhì)在食品、保健品等領(lǐng)域巨大的潛在市場(chǎng)價(jià)值和應(yīng)用前景。