響應面法優化低共熔溶液提取兒茶素工藝及組分分析

阮懌航，吳亮宇，魯靜，黃秀紅，劉麗辰，林金科, *

1. 福建農林大學園藝學院（福州 350002）；2. 福建農林大學安溪茶學院（泉州 362000）

鐵觀音原產于福建安溪，屬于烏龍茶類，既有綠茶的清香又有紅茶的醇厚，深受消費者的喜愛[1]。兒茶素作為鐵觀音烏龍茶中多酚類的主要成分，包含兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（CGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）7種組成成分[1]。兒茶素具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、降脂等[2-5]多種保健功效。目前，兒茶素主要的提取方法有離子沉淀-大孔樹脂吸附分離法[6]、微波輔助浸提法[7]、超聲波輔助浸提法[8]、超臨界CO2萃取法等[9]。這些方法中，有的方法提取率較低，有的方法耗能大、成本高，無法投入大規模生產[10]。因此，探索一種綠色環保高效的兒茶素提取方法對茶產業具有深遠的意義。

低共熔溶劑，又稱低共熔離子液體，是指利用有機化合物和離子型化合物通過氫鍵結合形成的體系。這種溶劑無毒性，可生物降解，是一種新型的綠色溶劑[11]；其具有制備過程簡單，原料易得，相對較低的蒸汽壓，化學性質穩定，表面張力小，擴散系數較大，室溫下為液體且電導率高等優點[12]。根據文獻報道，低共熔溶液在提取類黃酮物質[13]、橘皮多酚[14]、螺旋藻多糖[15]、黃酮物質[16]等方面有著深入的研究，但在茶葉內含活性成分的提取領域國內未見報道。故此次試驗通過對比不同體系的低共熔溶劑和傳統水提取方法的提取率，篩選適合的兒茶素提取體系，通過單因素試驗和響應面法，優化兒茶素提取條件，為提高兒茶素工業提取效率提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵觀音成品茶，惜緣茶葉有限公司；乳酸、檸檬酸、果糖，國藥集團；蘋果酸、氯化膽堿、甜菜堿、沒食子酸，麥克林公司；以上藥品均為分析純。乙腈（色譜純），德國Merck公司；冰醋酸（AR）；抗壞血酸（AR）；甲醇（色譜純），美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

712N可見分光光度計（上海精密科學儀器廠）；5424R高速離心機（德國制造）；HH-6恒溫水浴鍋（國華電器公司）；SY-2230恒溫水域搖床（美國精騏公司）；超純水機（成都艾柯公司）；高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.3 樣品預處理

將鐵觀音成品茶葉粉碎后過60篩，密封備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 不同體系的低共熔溶液制備

采用水浴加熱攪拌的方法制備低共熔溶劑，將氯化膽堿/果糖、氯化膽堿/乳酸、甜菜堿/蘋果酸、甜菜堿/檸檬酸、甜菜堿/乳酸5種雙組分按摩爾比1︰2各放入燒杯中，在85 ℃水浴中攪拌為均一的液體，60～80 min。

1.4.2 兒茶素的提取工藝流程

準確稱取2.000 0 g（±0.000 5 g）鐵觀音茶粉于50 mL離心管中，各加入30%含水率的5種自制低共熔溶液，混均放入恒溫水浴搖床中。提取條件為時間60 min、固液比1︰20 g/mL、溫度60 ℃、轉速100 r/min。提取后趁熱抽濾，濾液于4 ℃保藏待測。

1.4.3 HPLC分析

1.4.3.1 待測液制備

將25 mL EDTA（10 mg·mL-1）+0.2 g抗壞血酸+50 mL乙腈至500容量瓶，用水定容至刻度，制得穩定溶液；兒茶素提取液用穩定溶液稀釋10倍后過0.45 μm膜，制成待測液。

1.4.3.2 HPLC條件

采用Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，RP 181.7 μm），Acquity UPLC柱在線過濾器，以色譜圖中峰不出現拖尾、基線不漂移和分離度為依據對流動相體系和梯度洗脫設計、分析參數進行評定。流動相條件：A相為9.5%乙腈+0.02%EDTA-2Na+2%冰醋酸，流動相B為80%乙腈+0.02%EDTA-2Na+2%冰醋酸。柱溫箱溫度35 ℃。PDA檢測條件：掃描范圍200～400 nm，特征檢測波長278 nm，掃描時間9 min，進樣量2 μL。

1.4.4 兒茶素提取的單因素試驗

低共熔溶液的制備和鐵觀音茶湯的提取參照1.4.1和1.4.2，考察不同因素對兒茶素提取的影響。設置的單因素分別是：時間（40，60，80，100和120 min）、溫度（40，50，60，70和80 ℃）、固液比（1︰20，1︰30，1︰40和1︰50 g/mL）、低共熔溶液含水率（10%，20%，30%，40%和50%）、低共熔溶劑中氫鍵受體（HBA）與供體（HBD）的摩爾比（1︰1，1︰2，1︰3，2︰1和3︰1）。

1.4.5 響應面優化茶多酚提取試驗

在單因素試驗的基礎上，選取連續變量時間（A，min）、溫度（B，℃）、低共熔溶液的含水率（C，%）為自變量，兒茶素的提取率（Y，%）為響應值，根據Box-Behnken中心組合試驗原理，設計三因素三水平響應面分析試驗。試驗各因素水平設定參見表1。

表1 Box-behnken試驗因素水平及編碼水平表

1.5 數據處理

所有試驗均進行3次重復，采用Excel 2007，SPSS 17.0，Graphpad及Design-Expert 10.0.7進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 低共熔溶劑體系篩選試驗

由圖1可知，低共熔溶劑的兒茶素提取率高于超純水；其中乳酸與甜菜堿組成的低共熔溶液體系兒茶素提取率最高，為14.56%，相比于傳統水提取的方法提高了148.70%。因此選擇乳酸和甜菜堿體系作為低共熔溶劑體系。

圖1 不同低共熔溶劑體系對兒茶素提取率的影響

2.2 兒茶素提取的單因素試驗

2.2.1 提取時間對兒茶素提取率的影響

由圖2可知，兒茶素的提取率在20～40 min時提取率呈現上升趨勢；在40 min之后提取率逐步下降；40 min時提取率達到最大，為11.53%。綜合考慮提取成本和效率，確認最佳提取時間為40 min。

圖2 不同提取時間對兒茶素提取率的影響

2.2.2 溫度對兒茶素提取率的影響

由圖3可知，當溫度低于60 ℃時，提取率隨著溫度的增加而呈現上升趨勢；當溫度為60 ℃時提取率達到最大，為11.43%；進一步增加溫度，提取率呈現下降趨勢。因此，選擇溫度60 ℃為最佳提取條件。

2.2.3 低共熔溶劑組成摩爾比對兒茶素提取率的影響

由圖4可知，當氫鍵供體（HBD）和氫鍵受體（HBA）的摩爾比為2︰1時，提取率最佳，為12.26%；當摩爾比為3︰1時，提取率最低，為10.82%。因此，選取低共熔溶劑組成摩爾比2︰1為最佳摩爾比條件。

2.2.4 低共熔溶液含水率對兒茶素提取率的影響

由圖5可知，當溶液的含水率為10%～30%時，兒茶素的提取率隨著含水率提高而逐漸增加；當含水率為30%時，提取率達到最大，為13.31%，當含水率大于30%時，提取率下降。因此，選擇30%含水率為兒茶素提取的最佳低共熔溶液條件。

圖3 不同提取溫度對兒茶素提取率的影響

圖4 不同低共熔組分摩爾比對兒茶素提取率的影響

圖5 不同低共熔溶液含水率對兒茶素提取率的影響

2.2.5 固液比對兒茶素提取率的影響由圖6可知，當固液比為1︰10～1︰40 g/mL時，提取率隨著固液比的增加而增加；當固液比為1︰40 g/mL時，提取率達到最大，為10.85%；當固液比大于1︰40 g/mL時，提取率有所下降。綜上所述，選取1︰40 g/mL作為低共熔溶劑提取兒茶素的最優固液比。

2.3 兒茶素提取工藝優化

2.3.1 響應面試驗方案及結果分析

根據單因素試驗結果，選取提取時間（A）、提取溫度（B）、低共熔溶液含水率（C）為自變量，以兒茶素的提取率Y為因變量，根據Box-Behnken中心組合設計原理進行響應面試驗，試驗方案和結果見表2。

利用Design-Expert 10.0.7軟件中的Box-Behnken模型對表3中的數據進行多元擬合分析，從而獲得兒茶素提取率（Y）對自變量提取時間（A）、提取溫度（B）、低共熔溶液含水率（C）的二次項多元統計分析，建立的二元回歸方程為：Y=14.99+0.066A+0.051B+0.067C-0.42AB-0.22AC-0.12BC-0.92A2-0.48B2-0.28C2。

由表3可知，模型p＜0.000 1，失擬項的p＞0.05，說明模型的預測值和試驗數據具有高度的吻合度；相關系數R2=0.984 5，說明回歸方程能夠很好地模擬實際曲面；調整系數R2=0.964 6，說明有96.46%的響應值變化可以通過該模型來解釋，表明此方程能夠充分反映兒茶素提取率與各個提取工藝參數之間的關系。

模型的響應曲面圖見圖7。等高線的形狀能表示兩個因素之間的相互作用情況；若等高線呈現橢圓形，則兩個因素之間存在顯著的交互作用；若等高線呈現圓形，則無顯著性[17]。由圖7（f）可知，提取時間和提取溫度對兒茶素的提取率的交互作用沒有顯著性；由圖7（b）（d）可知，含水率和提取時間、含水率和提取溫度對兒茶素的提取率具有顯著的交互影響作用。由圖7（a）（c）（e）可知，當提取溫度、提取時間、含水率增加時，響應值呈現出先增加后減少的趨勢。這與單因素試驗的結果相吻合。

圖6 不同固液比對兒茶素提取率的影響

表2 響應面方案及結果

表3 回歸統計分析

圖7 各因素影響兒茶素提取率的響應面圖

2.3.2 兒茶素提取的最佳條件確定及驗證

在響應面試驗設計的因素范圍內，按照回歸模型利用Design-Expert 10.0.7軟件分析得出的兒茶素提取最佳條件是：提取時間40.31 min，提取溫度60.33℃，低共熔溶液含水率31.68%，模型預測茶多酚提取率為15.00%。最后確定的兒茶素的提取條件為：提取時間40 min，提取溫度60 ℃，低共熔溶劑含水率32%。為證實預測結果，采用最后確定的提取條件進行3次重復驗證試驗，得到實際兒茶素提取率（15.22%），與模型預測相差0.22%，由此可見應用響應面優化法確定的兒茶素提取條件具有實際應用價值。

2.4 兒茶素組分含量分析

通過HPLC對優化后的提取液進行組成成分分析，結果如圖8所示。含量最高的組分是EGCG，達到1.68 mg/mL；含量最低的是CG，僅有0.009 8 mg/mL。由圖8可知，兒茶素中的主要成分為EGCG和EGC，兩者合計占總量的69.20%；EC、C、GCG為次要成分，合計占兒茶素總量的29.57%。由此可見，發揮兒茶素主要保健功能的成分很可能是EGC、EGCG這兩種物質。

圖8 兒茶素各組分及其含量

3 結論

通過對低共熔溶劑體系的篩選，得到最佳低共熔溶液體系，為乳酸-甜菜堿；在單因素試驗的基礎上應用Box-Behnken試驗設計及響應面分析法對此工藝進行優化分析，得出的優化提取工藝條件為：提取時間40 min，提取溫度60 ℃，低共熔溶劑含水率32%、固液比1∶40 g/mL、低共熔溶劑組分摩爾比2∶1。此時通過模型計算得出的提取率為15.00%，驗證試驗的提取率為15.22%，試驗與模型得到的提取率高度吻合，表明模型準確、可靠，具有實際參考意義。對兒茶素提取物進行HPLC組分分析，結果顯示兒茶素中的主要成是EGCG和EGC，占總量的69.20%。由此可見采用低共熔溶液可以有效提高茶葉中兒茶素的提取效率；通過HPLC分析兒茶素主要成分可知，發揮兒茶素保健功效的主要成分可能是EGC、EGCG這兩種成分。因此可以在今后探索如何從低共熔溶液提取的兒茶素中分離出EGC、EGCG，從而發揮兒茶素類物質在食品、保健品等領域巨大的潛在市場價值和應用前景。